一種提高釀酒酵母纖維乙醇發(fā)酵性能的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高釀酒酵母纖維乙醇發(fā)酵性能的方法，所述方法是將釀酒酵母的JJJ1基因敲除；本發(fā)明方法可以高效地獲得對纖維素水解液抑制物耐性顯著提升的釀酒酵母工程菌株，在多種抑制物(乙酸、糠醛、甲酸和5-羥甲基糠醛)存在時乙醇發(fā)酵速率明顯提高，發(fā)酵時間縮短20h以上。該發(fā)明方法獲得的釀酒酵母工程菌株更加適用于纖維素燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)工藝。
【專利說明】一種提高釀酒酵母纖維乙醇發(fā)酵性能的方法 一、

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種纖維乙醇發(fā)酵的方法，特別涉及一種提升釀酒酵母纖維乙醇發(fā)酵 性能的方法。 二、

【背景技術(shù)】
[0002] 由于石油、天然氣和煤炭等化石燃料的儲量有限和用量急增，伴隨著環(huán)境污染等 系列問題，利用可再生物質(zhì)生產(chǎn)清潔能源越來越被世界各國重視。生物燃料是具有良好發(fā) 展前景的可再生能源，其中以燃料乙醇發(fā)展最為迅速。纖維素是自然界中分布最廣、含量最 多的一種多糖，可以水解成葡萄糖，用于燃料乙醇的生產(chǎn)。利用纖維素生產(chǎn)燃料乙醇，既有 助于緩解化石燃料短缺，改善環(huán)境，也有利于整個社會的可持續(xù)發(fā)展，實(shí)現(xiàn)人與環(huán)境的和諧 相處。
[0003] 當(dāng)前，在纖維素原料預(yù)處理過程中（蒸汽爆破和酸處理），由于酸和熱的作用，會 產(chǎn)生甲酸、乙酸、糠醛等一系列有害物質(zhì)，其中乙酸所占比例最大。這些抑制物在高濃度條 件下會引起酵母細(xì)胞的生理代謝失衡甚至死亡，從而極大地限制纖維乙醇發(fā)酵效率。因此， 很有必要選育具有高抑制物耐受性的釀酒酵母菌株。通過尋找與細(xì)胞脅迫耐性相關(guān)的基 因，對釀酒酵母菌株進(jìn)行基因工程改造，是提升酵母燃料乙醇發(fā)酵效率的一種重要育種策 略。釀酒酵母JJJl基因是熱擊蛋白HSP40家族中的一員，已有研究表明該基因編碼的蛋白 可激活蛋白Ssalp的ATPase酶的活性，參與核糖體大亞基的合成，但未見關(guān)于該基因與纖 維素水解液中抑制物耐受性關(guān)系的報(bào)道。 三、


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種提高釀酒酵母纖維乙醇發(fā)酵性能的方法，具體是構(gòu)建纖 維素水解液高濃度抑制物耐受性的釀酒酵母菌株的方法，從而使其可以在高濃度抑制物存 在條件下快速高效的進(jìn)行乙醇發(fā)酵，以改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)中釀酒酵母發(fā)酵生成纖維乙醇受到乙 酸、糠醛、甲酸和5-羥甲基糠醛等抑制物影響的問題。
[0005] 本發(fā)明提供一種提高釀酒酵母纖維乙醇發(fā)酵性能的方法，所述方法是將釀酒酵 母的JJJl基因敲除（JJJl基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:2所示，JJJl基因上下游延長 IOOObp的核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示）。
[0006] 進(jìn)一步，所述JJJl基因敲除是以PUG6質(zhì)粒為PCR模板，在引物JJJlS和引物JJJlA 的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得2038bp的DNA片段作為JJJl基因敲除組件，然后將敲除組件 轉(zhuǎn)入釀酒酵母，即獲得提高纖維乙醇發(fā)酵性能的釀酒酵母；
[0007]引物 JJJlS 為：
[0008] 5'-GTCATCGCAAAGTAGCTCTTTTTACATAGTAAAAGTCTGA CCAGCTGAAGCTTCGTACG-3' ；
[0009] 引物 JJJlA 為：
[0010] 5'-AAATTAAACTCTACACAGCTCTACTAATAATTTCTGTTTC GGCGTCGATTTTTGTGATG-3' 。
[0011] 更進(jìn)一步，所述釀酒酵母為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) YJS329 (購自 CCTCC，編號為 CCTCC 2011275)。
[0012] 本發(fā)明所述提高釀酒酵母菌株纖維乙醇發(fā)酵性能的方法按如下步驟進(jìn)行：
[0013] (I)JJJl基因敲除組件的獲得
[0014] 根據(jù)已報(bào)道的釀酒酵母JJJl基因（GenBank號：NC_001146. 8)和PUG6質(zhì)粒 (GenBank號：AF298793. 1)的序列設(shè)計(jì)一對引物JJJlS和JJJ1A，以pUG6質(zhì)粒為PCR模板， 擴(kuò)增獲得長度為2038bp的JJJl基因敲除組件（核苷酸序列為SEQ ID NO: 1所示）。
[0015] JJJlS 為：
[0016] 5' -GTCATCGCAAAGTAGCTCTTTTTACATAGTAAAAGTCTG ACCAGCTGAAGCTTCGTACG-3'，
[0017] JJJlA 為：
[0018] 5' -AAATTAAACTCTACACAGCTCTACTAATAATTTCTGTTTC GGCGTCGATTTTTGTGATG-3'。
[0019] (2)高纖維乙醇發(fā)酵性能菌株的構(gòu)建
[0020] 將 IO8 個釀酒酵母 YJS329 細(xì)胞，50 μ 1 鮭魚精 DNA 溶液（2mg/ml)，240 μ 1 50 % (w/v)的PEG3350溶液，36 μ I I. OM醋酸鋰溶液，步驟⑴獲得的DNA片段25 μ 1混勻后于 30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)半小時，42°C水浴熱擊40min，12000rpm離心Imin去上清，沉淀用Iml YPD 液體培養(yǎng)基重懸，30°C培養(yǎng)2-3h后，吸取100 μ 1培養(yǎng)液涂布含300 μ g/ml遺傳霉素 G418的 YH)平板上，30°C培養(yǎng)。挑取單菌落抽提基因組DNA，用PCR方法驗(yàn)證是否為陽性轉(zhuǎn)化子。分 別以敲除驗(yàn)證引物和JJJl基因內(nèi)部引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述敲除驗(yàn)證引物為KS和AJJJl， JJJl基因內(nèi)部引物為JJJl-S和JJJl-A ;電泳檢測JJJl基因內(nèi)部引物擴(kuò)增無條帶而敲除驗(yàn) 證引物擴(kuò)增的條帶為1555bp的，判斷為JJJl基因缺失的釀酒酵母菌株；
[0021] 引物 KS 為 5' -GATCGCGTATTTCGTCTCG-3' ；
[0022] 引物 AJJJl 為 5' -TTACTTGACGGAGCGCATT-3' ；
[0023] 引物 JJJl-S 為 5' -GAAGAACCAAGAGGGAAGT-3' ；
[0024] 引物 JJJl-A 為 5, -TGTAAGCCCTTGTCTCCTA-3'。
[0025] 所述釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)YJS329菌體細(xì)胞制備方法為：將釀 酒酵母YJS329菌落接種到IOml YPAD (10g/l酵母粉，20g/l蛋白粉，20g/l葡萄糖，80mg/l 腺嘌呤半硫酸，溶劑為去離子水，pH5. 5)液體培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)16h，吸取Iml培養(yǎng) 液到25ml的2XYPAD(20g/l酵母粉，40g/l蛋白粉，40g/l葡萄糖，160mg/l腺嘌呤半硫酸， 溶劑為去離子水，PH5. 5)培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)2-3h，然后吸取Iml培養(yǎng)液離心，無菌水洗兩遍 獲得菌體細(xì)胞。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明方法可以高效地獲得對 纖維素水解液抑制物耐性顯著提升的釀酒酵母工程菌株，在多種抑制物（乙酸、糠醛、甲酸 和5-羥甲基糠醛）存在時乙醇發(fā)酵速率明顯提高，發(fā)酵時間縮短20h以上。該發(fā)明方法獲 得的釀酒酵母工程菌株更加適用于纖維素燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)工藝。 四、【專利附圖】

【附圖說明】：
[0027] 圖1為pUG6質(zhì)粒圖譜。
[0028] 圖2為JJJl基因敲除不意圖。
[0029] 圖3為JJJl基因敲除組件和陽性轉(zhuǎn)化子電泳驗(yàn)證圖，泳道1為實(shí)施例1中引物 (JJJ1S和JJJ1A)獲得的敲除組件DNA產(chǎn)物，泳道2為實(shí)施例2中引物（KS和AJJJ1)獲得 的產(chǎn)物，泳道3為實(shí)施例2中引物（JJJ1-S和JJJ1-A)獲得的產(chǎn)物。
[0030] 圖4菌株YJS329與菌株YJS △ JJJl對纖維素水解液中抑制物耐受性比較，a為菌 體濃度 3X 107cells/ml，b 為菌體濃度 3X 106cells/ml，c 為菌體濃度 3X 105cells/ml。
[0031] 圖5為菌株YJS329與菌株YJS Λ JJJl纖維乙醇發(fā)酵性能比較。 五、【具體實(shí)施方式】：
[0032] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0033] YPAD液體培養(yǎng)基組成：10g/l酵母粉，20g/l蛋白粉，20g/l葡萄糖，80mg/l腺嘌呤 半硫酸，溶劑為去離子水，pH值為5. 5。
[0034] Yro液體培養(yǎng)基組成：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L，溶劑為去離 子水，pH值為5. 5。
[0035] 實(shí)施例I JJJl基因敲除組件DNA的構(gòu)建
[0036] 根據(jù)已報(bào)道的釀酒酵母JJJl基因（GenBank號：NC_001146. 8)，以及pUG6質(zhì)粒 (GenBank號：AF298793. 1)的DNA序列，設(shè)計(jì)一對引物JJJlS和JJJ1A，以pUG6質(zhì)粒為模板 擴(kuò)增JJJl基因敲除組件。組件的構(gòu)成為JJJl基因左翼同源序列（41bp)+pUG6匹配序列 (18bp匹配同源可以重疊，加起來59bp)+loxp+G418篩選標(biāo)記+loxp+pUG6匹配序列+JJJl 右翼同源序列。
[0037] JJJlS 為：
[0038] 5'-GTCATCGCAAAGTAGCTCTTTTTACATAGTAAAAGTCTGA CCAGCTGAAGCTTCGTACG-3' ；
[0039] JJJlA 為：
[0040] 5'-AAATTAAACTCTACACAGCTCTACTAATAATTTCTGTTTC GGCGTCGATTTTTGTGATG-3' 。
[0041] PCR反應(yīng)體系為：5Xbuffer 10μ I ;dNTP 3μ 1 ;模板2μ 1 ;引物2μ I ;DNA聚合酶 0· 5 μ I (Prime star ;寶生物工程（大連）有限公司）；ddH2032. 5 μ 1，反應(yīng)條件為：95°C預(yù) 變性5min ;98°C變性IOs ;61. 5°C退火15s ;72°C延伸2min。得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR清潔回 收試劑盒（AXYGEN生物技術(shù)有限公司）回收后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物為單一長 度為2038bp的DNA片段（圖3中泳道1)，表明敲除組件構(gòu)建成功，序列為SEQ ID NO: 1所 示：
[0042] GTCATCGCAAAGTAGCTCTTTTTACATAGTAAAAGTCTGACCAGCTGAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCG ACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGT CCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGG GCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGG CCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGT TGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATA CTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGGTAAGGAAAAGACT CACGTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGG GCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTA GCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAG CATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGA AGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTT GTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGAT GCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATT CTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTT GTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTT TCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTT GATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTT TTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCC CAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCG ATTCGATACTAACGCCGCCATCCAGTGTCGAAAACGAGCTCTCGAGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGC TATACGAAGTTATTAGGTGATATCAGATCCACTAGTGGCCTATGCGGCCGCGGATCTGCCGGTCTCCCTATAGTGAG TCGTATTAATTTCGATAAGCCAGGTTAACCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATT GGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTC AAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGG CCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGA CGCCGAAACAGAAATTATTAGTAGAGCTGTGTAGAGTTTAATTT
[0043] 實(shí)施例2 JJJl基因敲除菌株的構(gòu)建
[0044] (1)釀酒酵母細(xì)胞獲得：接種釀酒酵母菌株YJS329于YPAD液體培養(yǎng)基中， 30°C 200rpm培養(yǎng)12-16h，然后吸取Iml培養(yǎng)液到25ml 2 X YPAD培養(yǎng)液中，于30°C下200rpm 培養(yǎng)2-3h，然后取Iml培養(yǎng)液離心，無菌水洗兩遍，獲得待轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞。
[0045] (2) JJJl基因敲除釀酒酵母菌株的構(gòu)建：在步驟（1)制備的IO8酵母細(xì)胞中加入 50μ l、10mg/ml鮭魚精DNA(沸水煮lOmin，置于冰水混合物冷卻），240μ 1的500g/l的 PEG3350溶液；36 μ I I. OM醋酸鋰溶液，25 μ 1基因敲除組件（實(shí)施例1中制備）。槍頭吹 打混勻，30°C培養(yǎng)半小時后42°C水浴熱擊40min，12000rpm離心lmin，去上清，沉淀用Iml YH)液體培養(yǎng)基重懸，30°C、120rpm培養(yǎng)2-3h，吸取100 μ 1涂布于含終濃度400mg/L新霉素 G418(geneticin，G418 ;購自默克公司）的YPD平板上，30°C培養(yǎng)2天后，挑取單菌落抽取基 因組，用兩對驗(yàn)證引物（KS和AJJJl JJJl-S和JJJ1-A)進(jìn)行PCR反應(yīng)來驗(yàn)證JJJl基因是 否被成功敲除。
[0046] 引物 KS 的序列為：5'-GATCGCGTATTTCGTCTCG-3' ；
[0047] 引物 AJJJl 為 5' -TTACTTGACGGAGCGCATT-3' ；
[0048] 引物 JJJl-S 為 5, -GAAGAACCAAGAGGGAAGT-3' ；
[0049] 引物 JJJl-A 為 5, -TGTAAGCCCTTGTCTCCTA-3'。
[0050] PCR反應(yīng)體系為：10 μ 1的2XTaq MasterMix(康為世紀(jì)），1 μ 1引物，1 μ 1基因 組 DNA，8 μ I ddH20, PCR 反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s ;5L 9°C和 50. 5°C退 火30s ;72°C延伸I. 5min。瓊脂糖凝膠電泳后顯示引物（JJJ1-S和JJJ1-A)無條帶（圖3 中泳道3)，而引物（KS和AJJJ1)的條帶大小為1555bp (圖3中泳道2)，判斷為JJJl基因 缺失的釀酒酵母菌株，命名為釀酒酵母菌株YJS △ JJJl。
[0051] 實(shí)施例3菌株抑制物耐受性與發(fā)酵性能的比較
[0052] ⑴挑取YJS329和YJS Λ JJJl菌株接種至25ml YPD液體培養(yǎng)基中（20g/l葡萄糖、 20g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物，溶劑為去離子水，pH值為5. 5)過夜培養(yǎng)，用無菌水將菌 體調(diào)整到3X 107cells/ml，并依此10倍稀釋2個梯度。用移液槍吸取4 μ 1點(diǎn)樣于對照YPD 平板和含多種纖維素水解液抑制物（下列抑制物同時加入，終濃度為：3g/l乙酸；0. 8g/l 糠醛；0. 2g/l甲酸和0. 3g/15-羥甲基糠醛）的YPD平板，點(diǎn)樣后30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 天觀察。圖4顯示YJS Λ JJJl較親株YJS329對抑制物的耐受性有顯著提高。
[0053] (2)接種上述培養(yǎng)的YJS329和YJSA JJJl的細(xì)胞至發(fā)酵培養(yǎng)基中（500ml錐形 瓶，每瓶200ml培養(yǎng)基，組成：10g/l葡萄糖，10g/l蛋白胨，5g/l酵母膏，3g/L乙酸，0.8g/ 1^糠醛，0.28/1甲酸和0.38/15-羥甲基糠醛，溶劑為去離子水，？!1值為4.5)，保證接種后 發(fā)酵液中的酵母細(xì)胞數(shù)約為l〇 7cells/ml，置于33?搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)數(shù)為IOOrpm,每隔8h左 右吸取ImL發(fā)酵樣品，12000rpm離心lOmin，測定上清液中的葡萄糖和乙醇含量。圖5顯示 YJS △ JJJl較親株的乙醇發(fā)酵速度和糖消耗速率有顯著提高，總發(fā)酵時間約縮短21h。
【權(quán)利要求】
1. 一種提高釀酒酵母菌株纖維乙醇發(fā)酵性能的方法，其特征在于所述方法是將釀酒酵 母的JJJ1基因敲除。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述JJJ1基因敲除是以PUG6載體質(zhì)粒為模 板，在引物JJJ1S和引物JJJ1A的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得2038bp的DNA片段作為JJJ1 基因敲除組件，然后將JJJ1基因敲除組件轉(zhuǎn)入釀酒酵母，即獲得提高纖維乙醇發(fā)酵性能的 釀酒酵母； 引物JJJ1S為： 5'-GTCATCGCAAAGTAGCTCTTTTTACATAGTAAAAGTCTGACCAGC TGAAGCTTCGTACG-3' ； 引物JJJ1A為： 5'-AAATTAAACTCTACACAGCTCTACTAATAATTTCTGTTTCGGCGTC GATTTTTGTGATG-3' 。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于釀酒酵母為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)YJS329。
【文檔編號】C12N15/87GK104278057SQ201410453324
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月6日
【發(fā)明者】鄭道瓊, 張珂, 張黎杰, 李歐, 高克慧, 方雅紅, 王品美, 吳雪昌 申請人:浙江大學(xué)