青枯菌5號小種rtq-pcr檢測引物及方法
【專利摘要】青枯菌5號小種RTQ-PCR檢測引物及方法，序列為：RS72F：5'-ATGGATAAAGGGTTCGTGGTG-3'；RS312R：5'-CAGGCTCAGCGAGATTGC-3'。本發(fā)明基于青枯菌5號小種區(qū)別于其他青枯菌小種的特異性片段設計和篩選了一對特異性引物，同時利用該引物設計了桑青枯菌的熒光定量PCR檢測方法，具有特異性好、靈敏度高的特點，且大大縮短了檢測所需時間，樣品處理至得出結果只需4～5h。適用于桑青枯病的早期診斷。
【專利說明】青枯菌5號小種RTQ-PCR檢測引物及方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子檢測【技術領域】，具體涉及植物檢疫技術，尤其涉及一種專用于檢 測引起桑樹青枯病的青枯菌5號小種的引物和檢測方法。

【背景技術】
[0002] 青枯病（Bacterial wilt)是世界上分布最廣、危害最嚴重且最難防治的重大細菌 性病害，于2002年被美國列入應對生物恐怖活動的名單。此病廣泛流行于熱帶、亞熱帶及 溫帶地區(qū)，對包括草本、灌木和喬本在內(nèi)的50多科300多種植物造成危害（Annual review of phytopathology, 1991，29(1) :65-87)。青枯病可造成農(nóng)作物最高減產(chǎn)95%，每年在全球 范圍內(nèi)造成直接經(jīng)濟損失高達500億美元，引起了人們的廣泛關注。
[0003] 青枯病由青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum)引起，青枯菌按照其寄主范 圍可分為5個生理小種（生理1號小種一生理5號小種）；按照對3種雙糖（麥芽糖、乳糖 和纖維二糖）和3種己醇（甘露醇、山梨醇和甜醇）氧化產(chǎn)酸能力的差異可劃分為5個生 化型（生化型I 一生化型V) (Acta Horticulturae，2005, 695:127-136)。我國呂志強等 (2007)的研究結果表明，侵染桑樹的青枯勞爾氏菌屬于生理小種1和5,按生化型區(qū)分，有 生化型I、生化型III、生化型IV及生化型V等。桑青枯?。∕ulberry bacterial wilt)又被 稱為"枯萎病"，細菌性枯萎病，俗名"瘟桑"、"疽桑"，該病來勢猛、蔓延快，是一種對桑樹具 有毀滅性的土傳植物檢疫性病害，可引起新種?；虺闪稚．斈晁劳觯殉蔀橹萍s蠶桑產(chǎn)業(yè) 可持續(xù)發(fā)展的重要因素。青枯病一旦發(fā)生，很難進行有效的根治，而處在潛伏期的植物組織 從外觀上很難與正常組織分開，因此，快速有效的早期診斷對于控制青枯病的蔓延和避免 重大損失的發(fā)生具有重要意義。
[0004] 快速、精確的早期病原菌檢測手段是提高病害檢測效率的基礎，也是降低生物 防治成本的前提。桑青枯病的產(chǎn)生是由于其病原在植物維管束中繁殖，導致導管阻塞， 植物水分運輸受阻，從而使植物表現(xiàn)萎蔫癥狀。而桑樹上的其他病害，如桑樹腸桿菌 (Enterobacter mori)引起的枯萎病、桑丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae pv.mori) 引起的桑疫病，往往給診斷帶來誤判，從而增大了防治成本。
[0005] 對于青枯菌的檢測，目前最主要的有選擇性培養(yǎng)基和分子生物學的方法。選擇性 培養(yǎng)基最早是由 Kelman 于 1954 年研究出的 TTC/TZC(Tripheny tetrazolium chloride) 培養(yǎng)基，Rica等于1983年在TZC基礎上得到一種改良的SM-1培養(yǎng)基。青枯菌于培養(yǎng)基 上28°C條件下培養(yǎng)2-5d，會出現(xiàn)典型的流動性強、不規(guī)則圓形的具白色暈圈粉紅色菌落。 Elphinstone等于1996年進一步改進后得到SMSA培養(yǎng)基，可分離檢測出帶菌土壤中的青枯 菌。目前使用的青枯分離培養(yǎng)基大多也是基于以上幾種培養(yǎng)基或改良而來。指示植物檢測 法也是檢測病原菌的方法之一，但由于其周期太長，并且受季節(jié)性限制，因此該法不適用于 快速檢測青枯病原菌。
[0006] 分子生物學的方法主要包括核酸分子雜交和PCR方法，陳永芳等利用RAH)技術篩 選到1條青枯菌特有的DNA片段，并根據(jù)其堿基序列，設計了 PCR特異引物，以可侵染馬鈴 薯的其他病原細菌為對照，對樣品DNA進行擴增，結果表明，只有青枯菌可擴增出773bp的 DNA片斷，其他對照細菌均未擴增出這一條譜帶。Fouche等對非洲桉樹和馬鈴薯的致病菌 進行了檢測，運用PCR-RFLP技術，以Hrp基因區(qū)域進行擴增從而確定了青枯病菌的生物型 (Journal of General Plant Pathology, 2006, 72 (6) :369 - 373)。
[0007] 以上各種方法都只能在青枯種水平上分離青枯菌，并不能從小種水平上區(qū)分作為 桑樹病原菌的青枯5號小種。專利CN103602727A公開了一種快速檢測青枯菌的檢測引物 組、檢測試劑盒和檢測方法，專利CN103468794A公開了一種煙草青枯病分子檢測引物、檢 測方法及應用，專利CN102465173A公開了青枯菌2號小種的特異性PCR檢測方法，專利 CN101724692A公開了桑樹的另一種引起枯萎病的細菌桑樹腸桿菌的特異性引物和診斷方 法。Z. C. Pan等利用抑制消減雜交技術建立了青枯菌5號小種區(qū)別于標準青枯菌株GMI1000 的差減序列文庫（Eur J Plant Pathol, 2013, 137:377 - 391)。然而，以上方法均是基于特 異性引物的普通PCR檢測，目前并未見利用青枯菌5號小種單一擴增片段特異引物與熒光 定量PCR技術結合檢測桑青枯菌的報導。
[0008] 本發(fā)明嘗試使用熒光定量PCR的方法對桑青枯菌進行絕度定量檢測，提高了檢測 的特異性和靈敏度，可避免生產(chǎn)上對桑樹病害的誤判，同時降低了檢測所需的時間，為桑青 枯病的早期診斷和及早采取防治措施打下了基礎。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 解決的技術問題：本發(fā)明提供一種青枯菌5號小種RTQ-PCR檢測引物及方法，通過 設計青枯菌5號小種特異性引物建立一種靈敏、穩(wěn)定、可靠的桑樹青枯菌的熒光定量PCR檢 測方法。
[0010] 技術方案：青枯菌5號小種RTQ-PCR檢測引物，其特征在于序列為：RS72F : 5'-ATGGATAAAGGGTTCGTGGTG-3' ；RS312R:5'-CAGGCTCAGCGAGATTGC-3'。利用所述引物檢測 青枯菌5號小種的RTQ-PCR方法，步驟包括：（1)使用TM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)被測菌，并抽提被 測菌DNA，制備菌液樣品和DNA樣品；（2)使用引物對步驟1)中的菌液樣品及DNA樣品進行 PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；（3)根據(jù)步驟2)中擴增產(chǎn)物的有無即可判斷所測樣品是否為青枯 菌5號小種。
[0011] PCR試劑和步驟包括：擴增反應體系：在25μ L反應液中包含2μ L菌液模板或 DNA 模板，12.5yL 2XTaq MasterMix:含 2.5U Taq Polymerase/yL、20mM Tris-HCl、3mM MgCl2、500y M dNTP 和 lOOmM KC1，lOpmoles 引物 RS72F，lOpmoles 引物 RS312R ;PCR 擴增程 序為94°C預變性5min，94°C變性15s，53°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環(huán)，最后72°C延 伸lOmin ;電泳檢測：反應結束后，取10 μ L反應產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳上檢測，并使 用凝膠成像系統(tǒng)在紫外燈下拍照，根據(jù)產(chǎn)物的有無及長度判斷結果。
[0012] 所述青枯菌5號小種RTQ-PCR檢測引物在定量檢測土壤、組織中病原菌中的應 用。步驟包括：（1)抽提桑青枯菌的基因組DNA，并進行梯度稀釋；（2)對桑青枯菌進行培 養(yǎng)，并進行梯度稀釋；（3)以上述步驟1)和2)中的樣本為模板進行熒光定量PCR，并繪制標 準曲線；（4)擴增反應體系：20yL反應體系中，包含10yL SYBR Premix Ex TaqII (Tli RNaseH Plus) (2 X), 0. 8 μ L RS72F ΙΟμΜ,Ο. 8yL RS312R ΙΟμΜ,Ο. 4yL R0X Reference Dye (50 X)，2. 0 μ L模板；(5)擴增程序：兩步法擴增程序：第一步：95°C預變性lOmin ;第二 步：95°C變性15s，60°C延伸31s，反應45個循環(huán)。
[0013] 具體方法為：通過搜索GenBank中青枯菌5號小種區(qū)別于其他青枯菌小種的差異 序列，利用Primer Premier 5設計引物，通過PCR及電泳檢測，獲得1對青枯菌5號小種特 異性引物RS72F/RS312R，PCR反應后，產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)產(chǎn)物片段大小可 直接判斷待測樣品是否為青枯菌5號小種。同時，利用該引物設計了靈敏度更高的桑青枯 菌的RTQ-PCR檢測方法。
[0014] 用于檢測青枯菌5號小種的PCR方法，包括：
[0015] (1)用于檢測的樣品制備
[0016] 使用TM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5號小種青枯菌、其他小種青枯菌、和其它種屬的對照菌 株，至其濃度達到約 108 cfu/mL;使用 Bioflux Biospin Genomic DNA Extraction Kit 提 取樣品基因組DNA。
[0017] (2)用于檢測的特異性引物
[0018] 引物序列為：
[0019] RS72F :5'-ATGGATAAAGGGTTCGTGGTG-3' ；
[0020] RS312R :5'-CAGGCTCAGCGAGATTGC-3' ；
[0021] RS72F/312R引物對可從青枯菌5號小種菌株中特異性地擴增出片段長度為241bp 的產(chǎn)物；
[0022] 同時使用所有類型青枯菌的共有特異性引物AU759/760作為對照，其序列為：
[0023] AU759 :5'-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3' ；
[0024] AU760 :5'-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3' ；
[0025] AU759/760引物對可從所有小種類型的青枯菌中特異性地擴增出片段長度為 282bp的產(chǎn)物。
[0026] (3) PCR擴增反應體系
[0027] 在25 μ L反應液中，包含2 μ L菌液模板或DNA模板，12. 5 μ L 2XTaq MasterMix(含 2.5U Taq Polymerase/yL，20mM Tris_HCl，3mM MgCl2,500 yM dNTP，100mM KC1)，lOpmoles上游引物，lOpmoles下游引物。
[0028] (4) PCR擴增程序
[0029] 941：預變性51^11，941：變性158,531：退火3〇8,721：延伸3〇8,30個循環(huán)，最后 72°C 延伸 10min。
[0030] (5) PCR產(chǎn)物的鑒定
[0031] 取10 μ L反應產(chǎn)物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳上檢測，并使用凝膠成像系統(tǒng)在紫外 燈下拍照，根據(jù)產(chǎn)物的有無及長度判斷結果。
[0032] (6) RTQ-PCR標準樣品的制備
[0033] 將青枯菌5號小種的DNA使用DNA提取試劑盒中的Elution Buffer進行十倍梯 度稀釋，使其終濃度分別為5.0\102叩/^1^，5.0\101叩/^1^，5.0\10°即/^1^，5.0\10_ 1 ng/ μ L, 5. 0 X 10 2 ng/ μ L, 5. 0 X 10 3 ng/ μ L, 5. 0 X 10 4 ng/ μ L。
[0034] 將純培養(yǎng)的青枯菌5號小種菌液配制成濃度梯度為1 X 108 cfu/mL，5Χ 107 cfu/ mL,2X107cfu/mL,lX107 cfu/mL,5X106 cfu/mL,2X106 cfu/mL,lX106 cfu/mL,lX105 cfu/mL，lX104 cfu/mL，lX103 cfu/mL，lX102 cfu/mL 細胞懸浮液。
[0035] (7) RTQ-PCR 反應體系
[0036] 20μ L反應體系中，包含 10μ L SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (2X)， 0. 8yL RS72F(10yM),0. 8yL RS312R(10 μ M) ,0. 4 μ L ROX Reference Dye (50X), 2. 0 μ L 模板。
[0037] (8) RTQ-PCR 擴增程序
[0038] 兩步法擴增程序：第一步：95°C預變性lOmin ;第二步：95°C變性15s，60°C延伸 31s，反應45個循環(huán)。
[0039] (9)標準曲線的繪制
[0040] 分別以DNA濃度的LOG值和菌液濃度的LOG值為橫坐標，相應的CT值（每個反應 管內(nèi)的熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）為縱坐標繪制標準曲線。
[0041] 有益效果
[0042] 本發(fā)明基于青枯菌5號小種區(qū)別于其他青枯菌小種的特異性片段設計和篩選了 一對特異性引物，同時利用該引物設計了桑青枯菌的熒光定量PCR檢測方法，具有特異性 好、靈敏度高的特點，且大大縮短了檢測所需時間，樣品處理至得出結果只需4?5h。適用 于桑青枯病的早期診斷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043] 圖la引物RS72F/312R對青枯菌株的擴增結果圖：
[0044] M:DNA分子量標準Marker (600bp, 500bp, 400bp, 300bp, 200bp, 100bp) ;1 :青枯菌 5 號小種（GMl. 73) ;2 :青枯菌1號小種（GMl. 74) ;3 :青枯菌2號小種（GMl. 76) ;4 :青枯 菌3號小種（RS-3) ;5 :青枯標準菌株GMI1000(3號小種）；6 :青枯4號小種（GMl. 71) ;CK : 空白的TM培養(yǎng)液。虛線左側為引物AU759/760擴增結果；虛線右側為引物RS72F/312R擴 增結果。
[0045] 圖lb引物RS72F/312R對其他種屬對照菌株的擴增結果圖：
[0046] M:DNA 分子量標準 Marker (600bp, 500bp, 400bp, 300bp, 200bp, 100bp) ;1 :青枯 菌5號小種（GIM1.73) ;7 :桑丁香假單胞菌（M4-13) ;8 :桑腸桿菌（JX-6) ;9 :大腸桿菌 (DCG) ;10 :熒光假單胞菌（A-S1) ;11 :惡臭假單胞菌（ECJ) ;12 :枯草芽孢桿菌（KCY) ;13 : 蠟樣芽孢桿菌（LYY) ;14 :蘇云金芽孢桿菌（SYJ) ;15 :金黃色葡萄球菌（PTQ) ;16 :四聯(lián)球菌 (SLQ) ;17 :桔綠木霉（JLM) ;18 :黃鏈霉菌（HLM)。
[0047] 圖2a以CT值為縱坐標，DNA濃度的LOG值為橫坐標繪制熒光定量絕對定量標準 曲線圖：
[0048] DNA濃度在10_4?102ng/yL范圍內(nèi)，其LOG值與CT值呈良好的線性關系，Y =-2. 747X+21. 834, R2 = 0· 993。
[0049] 圖2b以CT值為縱坐標，菌液濃度的LOG值為橫坐標繪制的熒光定量絕對定量標 準曲線圖：
[0050] 菌液濃度在103?107 cfu/mL范圍內(nèi)，其LOG值與CT值呈良好的線性關系，Y =-3. 418X+45. 447, R2 = 0. 998。

【具體實施方式】
[0051] 實施例1
[0052] (1)參試菌株的培養(yǎng)和DNA提取
[0053] 參試的18株菌株包括一株桑青枯病病原菌GM1. 73 (青枯5號小種，其致病性已 在桑樹上經(jīng)科赫法則驗證），5株其他小種的青枯菌（GM1. 74, GM1. 76, GM1. 71，RS-3， GMI1000)，其中 GM1. 73，GM1. 74(青枯 1 號小種），GM1. 76(青枯 2 號小種），GM1. 71 (青 枯4號小種）購自廣東省微生物菌種保藏中心（GMCC) ;RS-3(青枯3號小種）由南京農(nóng)業(yè) 大學植物保護學院提供；GMI1000 (青枯3號小種）購自美國模式培養(yǎng)物收藏中心（ATCC)。 其他 12 種非青枯屬的對照菌株（M4-13, JX-6, DCG，A-Sl，ECJ，KCY，LYY，SYJ，PTQ，SLQ，JLM， HLM)由本實驗室保存，其中M4-13為桑疫病病原菌（Pseudomonas syringae pv.mori)， JX-6為桑細菌性枯萎病病原菌（Enterobacter mori)，其余則為土壤中常見的一些菌屬。 將菌株接種到TM液體培養(yǎng)基中（葡萄糖5g，蛋白胨10g，水解酪蛋白lg，蒸餾水1000mL)， 28°C，培養(yǎng) 2 天。使用 Biospin Genomic DNA Extraction Kit 提取參試菌株的 DNA。
[0054] ⑵引物的合成
[0055] RS72F:5'-ATGGATAAAGGGTTCGTGGTG-3' ；
[0056] RS312R:5'-CAGGCTCAGCGAGATTGC-3' ；
[0057] AU759:5'-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3' ；
[0058] AU760:5'-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3' ；
[0059] 引物由上海生工公司合成。
[0060] (3)PCR擴增反應
[0061] ①在25μ L反應體系中，包含2μ L DNA模板，12. 5μ L 2XTaq MasterMix(含2. 5U Taq Polymerase/yL，20mM Tris-HCl，3mM MgCl2,500 yM dNTP，100mM KCl)，10pmoles 引物 RS72F，lOpmoles 引物 RS312R。
[0062] ②在25μ L反應體系中，包含2μ L DNA模板，12. 5μ L 2XTaq MasterMix(含2. 5U Taq Polymerase/μ L，20mM Tris-HCl，3mM MgCl2, 500 μ M dNTP，100mM KC1)，lOpmoles 引物 AU759, lOpmoles 引物 AU760。
[0063] (4) PCR擴增程序
[0064] 941：預變性51^11，941：變性158,531：退火3〇8,721：延伸3〇8,30個循環(huán)，最后 72°C 延伸 10min。
[0065] (5) PCR產(chǎn)物的鑒定
[0066] 取10 μ L反應產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測，并使用凝膠成像系統(tǒng)在紫外燈 下拍照，根據(jù)產(chǎn)物的有無及長度判斷結果。
[0067] (6)熒光定量PCR模板的制備
[0068] ①將青枯菌5號小種的DNA使用DNA提取試劑盒中的Elution Buffer進行十倍梯 度稀釋，使其終濃度分別為5.0\102叩/^1^，5.0\101叩/^1^，5.0\10°即/^1^，5.0\10_ 1 ng/ μ L, 5. 0 X 10 2ng/ μ L, 5. 0 X 10 3 ng/ μ L, 5. 0 X 10 4 ng/ μ L〇
[0069] ②將青枯菌5號小種菌液使用培養(yǎng)液進行梯度稀釋，使其終濃度分別為5. OX 107 cfu/mL ；2. ΟΧΙΟ7 cfu/mL ； 1. 0X 107 cfu/mL ；5. OX 106 cfu/mL ；2. 0X 106 cfu/mL ；1. OX 106 cfu/mL ； 1. 0 X 105cfu/mL ； 1. 0 X 104 cfu/mL ； 1. 0 X 103 cfu/mL〇
[0070] (7)熒光定量PCR擴增體系
[0071] 20μ L反應體系中，包含 10μ L SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (2X)， 0. 8yL RS72F(10yM),0. 8yL RS312R(10 μ M) ,0. 4 μ L ROX Reference Dye (50X), 2. 0 μ L 模板。每個樣品進行5次重復。
[0072] (8)熒光定量PCR擴增程序
[0073] 兩步法擴增程序：
[0074] 第一步：95°C預變性lOmin ;第二步：95°C變性15s，60°C延伸31s，反應45個循環(huán)。
[0075] (9) DNA為模板的絕對定量標準曲線
[0076] 以CT值為縱坐標，DNA濃度的LOG值為橫坐標繪制標準曲線。
[0077] (10)菌液為模板的絕對定量標準曲線
[0078] 以CT值為縱坐標，菌液濃度的LOG值為橫坐標繪制標準曲線。
[0079] 實施結果
[0080] 利用本發(fā)明設計的引物RS72F/312R，以青枯菌5號小種和其他小種的青枯菌為模 板，進行PCR擴增，結果如圖la所示，虛線左側使用青枯菌種水平上的特異引物AU759/760， 每種青枯菌均可擴增出282bp的片段，在種水平上證明參試菌株均為青枯菌；虛線右側使 用本發(fā)明設計的引物RS72F/312R，只有青枯5號小種能被擴增出241bp的特異性片段，以此 證明本發(fā)明的引物在青枯菌小種水平上具有特異性。
[0081] 利用本發(fā)明設計的，以青枯菌5號小種和其他種屬的對照菌為模板，進行PCR擴 增，結果如圖lb所示，只有青枯菌5號小種能被擴增出241bp的特異性片段，說明本發(fā)明的 引物在種水平上具有特異型。
[0082] 由引物RS72F/312R擴增出的青枯菌5號小種特異的DNA序列：
[0083] ATGGATAAAGGGTTCGTGGTGCGGCACATCAAATTTGATATGTGCCGGATGTGCCGTAGTTGGCCGGCA TTGGCTACCATAATGCTGAGTGCTTGTTGCGGCACATTCTGAATTGCGAGGCGAGGGGGGCGATTGAGCTATTCCAC TGAGAACATTCTCCCGAGTGGCGTTACGGTTGCGCAGGTCGTCGCATTCGCCAAGCTGCTCGGCTACACGCCCGGCG GCAATCTCGCTGAGCCTG
[0084] 利用引物RS72F/312R設計熒光定量PCR方法對青枯菌5號小種DNA進行絕對定 量檢測，如圖2a所示，DNA濃度在10_ 4?102ng/yL范圍內(nèi)，其LOG值與CT值呈良好的線性 關系，Y = -2. 747X+21. 834, R2 = 0· 993。
[0085] 利用引物RS72F/312R設計熒光定量PCR方法對青枯菌5號小種菌液進行絕對定 量檢測，如圖2b所示，菌液濃度在10 3?107 cfu/mL范圍內(nèi)，其LOG值與CT值呈良好的線 性關系，Y = -3· 418X+45. 447, R2 = 0· 998。
[0086] 熒光定量PCR反應的溶解曲線顯示，產(chǎn)物在87. 9°C出現(xiàn)單一的峰，說明反應中無 非特異性的擴增或引物二聚體的干擾。
[0087] 上述實施方式僅為說明本發(fā)明專利，但不能以此來限定本發(fā)明的保護范圍。本領 域的技術人員在本發(fā)明基礎上所做的任何非實質(zhì)性的變化和替換均屬于本發(fā)明所要求保 護的范圍。
[0088] SEQUENCE LISTING <110〉江蘇科技大學 <120〉青枯菌5號小種RTQ-PCR檢測引物及方法 <130〉 <160〉 5 <170> Patentln version 3. 3 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 1 atggataaag ggttcgtggt g 21 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 2 caggctcagc gagattgc 18 <210〉 3 <211〉 21 <212〉 DNA <213> 人工序列
[0089] <400> 3 gtcgccgtca actcactttc c 21 <210〉 4 <211> 24 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400〉 4 gtcgccgtca gcaatgcgga atcg 24 〈210〉 5 <211〉 241 <212> DNA <213> Ralstonia solanacearum <400〉 5 atggataaag ggttcgtggt gcggcacatc aaatttgata tgtgccggat gtgccgtagt 60 tggccggcat tggctaccat aatgctgagt gcttgttgcg gcacattctg aattgcgagg 120 cgaggggggc gattgagcta ttccactgag aacattxtcc cgagtggcgt tacggttgcg 180 caggtcgtcg cattcgccaa gctgctcggc tacacgcccg gcggcaatct cgctgagcct 240 g 241
【權利要求】
1. 青枯菌5號小種RTQ-PCR檢測引物，其特征在于序列為： RS72F :5'-ATGGATAAAGGGTTCGTGGTG-3' RS312R :5'-CAGGCTCAGCGAGATTGC-3'。
2. 利用權利要求1所述引物檢測青枯菌5號小種的RTQ-PCR方法，其特征在于步驟包 括： 1) 使用TM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)被測菌，并抽提被測菌DNA，制備菌液樣品和DNA樣品； 2) 使用引物對步驟1)中的菌液樣品及DNA樣品進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物； 3) 根據(jù)步驟2)中擴增產(chǎn)物的有無即可判斷所測樣品是否為青枯菌5號小種。
3. 根據(jù)權利要求2所述的RTQ-PCR方法，其特征在于PCR試劑和步驟包括： 1) 擴增反應體系：在25 μ L反應液中包含2 μ L菌液模板或DNA模板，12. 5 μ L 2 X Taq MasterMix:含2.5U Taq Polymerase/μ L、20mM Tris-HCl、3mM MgCl2、500y M dNTP和 lOOmM KC1，lOpmoles 引物 RS72F，lOpmoles 引物 RS312R ; 2) 卩〇?擴增程序為941：預變性51^11，941：變性158,531：退火308,721：延伸308,30個 循環(huán)，最后72°C延伸lOmin ; 3) 電泳檢測：反應結束后，取10 μ L反應產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳上檢測，并使用 凝膠成像系統(tǒng)在紫外燈下拍照，根據(jù)產(chǎn)物的有無及長度判斷結果。
4. 權利要求1所述青枯菌5號小種RTQ-PCR檢測引物在定量檢測土壤、組織中病原菌 中的應用。
5. 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于步驟包括： 1) 抽提桑青枯菌的基因組DNA，并進行梯度稀釋； 2) 對桑青枯菌進行培養(yǎng)，并進行梯度稀釋； 3) 以上述步驟1)和2)中的樣本為模板進行熒光定量PCR，并繪制標準曲線； 4) 擴增反應體系： 20μL反應體系中，包含10μLSYBRPremixExTaqΠ (TliRNaseHPlus)(2X)， 0. 8yL RS72F ΙΟμΜ,Ο. 8yL RS312R ΙΟμΜ,Ο. 4yL ROX Reference Dye (50 X), 2. 0 μ 板； 5) 擴增程序 兩步法擴增程序： 第一步：95°C預變性lOmin ;第二步：95°C變性15s，60°C延伸31s，反應45個循環(huán)。
【文檔編號】C12R1/01GK104250665SQ201410410006
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年8月20日 優(yōu)先權日:2014年8月20日
【發(fā)明者】吳福安, 曹夢琪, 包奇, 王俊, 張健, 盛晟 申請人:江蘇科技大學