嗜冷酶組合物及其制備方法和使用方法【專利摘要】描述了具有提高的酶活性和/或嗜熱和嗜冷穩(wěn)定性的酶組合物。另外，提供了用于制備和使用所述酶組合物的方法和試劑盒?！緦＠f明】嗜冷酶組合物及其制備方法和使用方法[0001]本申請(qǐng)要求于2013年8月9日提交的印度專利申請(qǐng)944/K0L/2013的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此整體引為參考。發(fā)明領(lǐng)域[0002]本發(fā)明技術(shù)特別地涉及具有提高的酶活性的酶組合物，其具有工業(yè)應(yīng)用。[0003]適冷的酶由于節(jié)能提供經(jīng)濟(jì)益處：它們無需在寒冷環(huán)境和冬季期間起作用的昂貴的加熱步驟，提供了升高的反應(yīng)產(chǎn)率，適應(yīng)高水平立體特異性，使可能在較高溫度下發(fā)生的不期望的化學(xué)反應(yīng)最小化，并且當(dāng)需要時(shí)表現(xiàn)出使所述酶快速容易地失活的熱不穩(wěn)定性?！?br>背景技術(shù)：
】[0004]在寒冷環(huán)境中定殖的微生物稱為嗜冷生物。適冷的（Cold-adapted)酶是在低溫下具有高活性的酶。通常，在低溫下，適冷的酶的比活性高于其嗜溫的對(duì)應(yīng)物的比活性?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]在某些一些方面，本發(fā)明的技術(shù)提供了具有至少一種納米顆粒和至少一種嗜冷酶的組合物。在某些一些實(shí)施方案中，所述嗜冷酶與所述納米顆粒接觸，但是不與其結(jié)合連接。在某些一些實(shí)施方案中，納米顆粒處理的嗜冷酶具有比對(duì)照嗜冷酶提高的活性。在某些一些實(shí)施方案中，所述組合物包括來自細(xì)菌的無細(xì)胞提取物和至少一種納米顆粒，其中所述無細(xì)胞提取物中的酶具有比對(duì)照控制酶提高的活性。在某些一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞提取物來自嗜冷菌、嗜溫菌或其組合。[0006]在某些一些方面，本發(fā)明的技術(shù)涉及制備酶組合物的方法。在某些一些實(shí)施方案中，所述方法包括：使將至少一種納米顆粒和至少一種嗜冷酶接觸，其中使所述嗜冷酶與接觸所述納米顆粒接觸，但是不與該納米顆粒結(jié)合連接。[0007]-個(gè)方面，本發(fā)明的技術(shù)涉及一種試劑盒，其包括：大量多個(gè)納米顆粒和至少一種嗜冷酶。在某些一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括用于將混合所述嗜冷酶和所述納米顆粒組合以形成酶組合物的使用說明書。[0008]在一個(gè)方面，本發(fā)明的技術(shù)涉及組合物，其包括大量多個(gè)活細(xì)胞，其中所述活細(xì)胞為細(xì)菌；和至少一種納米顆粒；其中所述活細(xì)胞中的酶具有比對(duì)照酶提高的酶活性。在某些一些實(shí)施方案中，所述活細(xì)胞包括嗜冷菌細(xì)胞、嗜溫菌細(xì)胞，或其組合?！緦＠綀D】【附圖說明】[0009]圖1(A-D)為比較在存在和不存在納米顆粒（NP)下嗜冷酶的溫度依賴性的圖（HapNP用于果膠酶、纖維素酶和木聚糖酶；Cu20NP用于漆酶）。所述酶如下表示：(A)果膠酶；(B)漆酶；(C)纖維素酶和（D)木聚糖酶。[0010]圖2為圖解NP補(bǔ)充提高嗜冷漆酶的pH依賴性范圍的圖。[0011]圖3(A-H)為比較在存在或不存在NP下，在三個(gè)不同溫度（4°C、10°C和25°C)下嗜冷酶的時(shí)間動(dòng)力學(xué)的圖，（A)未處理的果膠酶；(B)NP處理的果膠酶；（C)未處理的漆酶；⑶NP處理的漆酶；(E)未處理的纖維素酶；(F)NP處理的纖維素酶；(G)未處理的木聚糖酶；(H)NP處理的木聚糖酶。[0012]圖4(A-H)為顯示在存在和不存在納米顆粒下嗜冷酶的冷失活能（Ed)的阿赫紐斯曲線（Arrheniusplot)的圖：⑷未處理的果膠酶；(B)NP處理的果膠酶；（C)未處理的漆酶；(D)NP處理的漆酶；(E)未處理的纖維素酶；(F)NP處理的纖維素酶；(G)未處理的木聚糖酶；(H)NP處理的木聚糖酶。[0013]圖5(A-d)為比較在存在和不存在相應(yīng)納米顆粒下嗜冷酶的冷凍-解凍循環(huán)的圖；(A)果膠酶，⑶漆酶，（C)纖維素酶和⑶木聚糖酶。[0014]圖6為比較在存在和不存在Cu20NP下蛋白酶活性的圖。另外，該圖表明Cu20NP影響蛋白酶活性最大時(shí)的最佳溫度。[0015]圖7為圖解在存在和不存在Cu20NP下游離氨基酸產(chǎn)生隨時(shí)間變化的圖。[0016]圖8為圖解在存在和不存在Cu20NP下游離氨基酸產(chǎn)生隨pH變化的圖。[0017]圖9A為顯示在范圍從約4°C至約10°C的溫度下，由來自用或不用NP處理下，由來自通過經(jīng)利用或不用NP處理的酶混合物（果膠酸裂解酶、漆酶、纖維素酶和木聚糖酶）的進(jìn)行蛋白酶處理的脫粒的玉米芯的無細(xì)胞提取物制備的還原糖的量的圖。[0018]圖9B為顯示在范圍從約4°C至約10°C的溫度下，由來自用或不用NP處理下，通過經(jīng)利用或不用NP處理的酶混合物（果膠酸裂解酶、漆酶、纖維素酶和木聚糖酶）進(jìn)行的蛋白酶處理的、脫粒的玉米芯的無細(xì)胞提取物制備的葡萄糖的量的圖。[0019]圖10A為顯示在約5至約10的pH范圍下，由來自用或不用NP處理下，通過經(jīng)利用或不用NP處理的酶混合物（果膠酸裂解酶、漆酶、纖維素酶和木聚糖酶）的進(jìn)行蛋白酶處理的脫粒的玉米芯的無細(xì)胞提取物制備的還原糖的量的圖。[0020]圖10B為顯示在約5至約10的pH范圍下，由來自用或不用NP處理下，通過經(jīng)利用或不用NP處理的酶混合物（果膠酸裂解酶、漆酶、纖維素酶和木聚糖酶）進(jìn)行的蛋白酶處理的脫粒的玉米芯的無細(xì)胞提取物制備的葡萄糖的量。[0021]圖11A為顯示在存在或不存在NP下，由無細(xì)胞提取物制備的還原糖的時(shí)間依賴性的圖。[0022]圖11B為顯示在存在或不存在NP下，由無細(xì)胞提取物制備的葡萄糖的時(shí)間依賴性的圖。[0023]圖12A為顯示在沒有NP下從嗜冷菌的活細(xì)胞懸液得到的酶的pH依賴性的圖，所述酶包括果膠酸裂解酶、漆酶、纖維素酶和木聚糖酶。[0024]圖12B為顯示在存在NP(加入Cu20NP和HapNP)下從嗜冷菌的活細(xì)胞懸液得到的酶的pH依賴性的圖，所述酶包括果膠酸裂解酶、漆酶、纖維素酶和木聚糖酶。[0025]圖13A為顯示在沒有NP下從嗜冷菌的活細(xì)胞懸液得到的酶的溫度依賴性的圖，所述酶包括果膠酸裂解酶、漆酶、纖維素酶和木聚糖酶。[0026]圖13B為顯示在存在NP(加入Cu20NP和HapNP)下從嗜冷菌的活細(xì)胞懸液得到的酶的溫度依賴性的圖，所述酶包括果膠酸裂解酶、漆酶、纖維素酶和木聚糖酶。[0027]圖14A為顯示在沒有NP下從嗜冷菌的活細(xì)胞懸液得到的酶的時(shí)間依賴性的圖，所述酶包括果膠酸裂解酶、漆酶、纖維素酶和木聚糖酶。[0028]圖14B為顯示在存在NP(加入Cu20NP和HapNP)下從嗜冷菌的活細(xì)胞懸液得到的酶的時(shí)間依賴性的圖，所述酶包括果膠酸裂解酶、漆酶、纖維素酶和木聚糖酶?！揪唧w實(shí)施方式】[0029]在下述詳細(xì)說明中，參考形成其一部分的附圖。在附圖中，除非上下文另有指定，類似的符號(hào)通常代表類似的組件。在詳細(xì)說明、附圖和權(quán)利要求書中描述的說明性實(shí)施方案不意味著限制。在不背離此處呈現(xiàn)的主題的精神或范圍下，可以利用其它實(shí)施方案，并且可以進(jìn)行其它變化。[0030]本文公開的是關(guān)于穩(wěn)定的嗜冷酶的組合物及其制備和使用方法。在一些實(shí)施方案中，本文公開的酶組合物和方法包括（1)至少一種嗜冷酶；和（2)至少一種與所述嗜冷酶接觸的納米顆粒。在一些實(shí)施方案中，所述納米顆粒與所述嗜冷酶接觸，但不與其連接。在一些實(shí)施方案中，所述組合物可以用于工業(yè)過程中。例如，在一些實(shí)施方案中，所述組合物可以用于產(chǎn)生葡萄糖和還原糖。[0031]如本說明書和所附權(quán)利要求書中所用的，除非文中清楚指定，單數(shù)形式"一"和"該"包括復(fù)數(shù)指代。例如，提及"細(xì)胞"包括兩種或多種細(xì)胞的組合，和類似情況。[0032]如本文所用的，"約"將為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解，且根據(jù)其所使用的上下文不同將在某種程度上變化。若有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不清楚該術(shù)語的用途的情況，則考慮使用其的上下文，"約"將意味特定術(shù)語的至多+或-10%。[0033]如本文所用的，術(shù)語"對(duì)照"或"對(duì)照酶"將為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的含義，并且必定將取決于例如待評(píng)價(jià)的酶活性或條件的方面。通常，對(duì)照或?qū)φ彰笇⑴c試驗(yàn)酶（例如，已經(jīng)以某種方式修飾或處理的酶）相比較。對(duì)照或?qū)φ彰笇⑼ǔ橄嗤愋偷拿福⑶以醋韵嗤瑏碓?。?duì)照酶將不會(huì)經(jīng)歷"修飾"或"處理"（例如，不接觸納米顆粒，或者不在包含納米顆粒的組合物中），但將在與"修飾的"或"處理的"酶所處相同條件下來評(píng)價(jià)酶活性、pH耐受性、耐熱性、半衰期等。因此，可以確定"修飾"或"處理"的效果。在一些實(shí)施方案中，"修飾"或"處理"包括使酶與至少一種納米顆粒接觸，其中所述納米顆粒不與所述酶連接。在一些實(shí)施方案中，所述酶和納米顆粒在組合物中。[0034]如本文所用的，在酶的上下文中，術(shù)語"提高的活性"或"增加的活性"指與適宜的對(duì)照酶相比，每單位時(shí)間轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物的提高或增加底物的摩爾數(shù)。在一些實(shí)施方案中，在對(duì)于特定類型的酶的"最佳"或"標(biāo)準(zhǔn)條件"下（例如，標(biāo)準(zhǔn)pH、標(biāo)準(zhǔn)溫度、標(biāo)準(zhǔn)底物等），與在同樣標(biāo)準(zhǔn)條件下的對(duì)照酶相比，酶可表現(xiàn)出提高的酶活性。另外或可選地，在一些實(shí)施方案中，在對(duì)于特定類型的酶的非標(biāo)準(zhǔn)條件（例如，較高或較低溫度、較高或較低pH、非最佳底物等）下，與在相同條件下的對(duì)照酶相比，或與在標(biāo)準(zhǔn)條件下的對(duì)照酶相比，可表現(xiàn)出提高的活性。舉例來說，但不作為限制，本文公開的是與至少一種納米顆粒接觸但沒有與其連接的嗜冷酶，其中與對(duì)照嗜冷酶（例如，沒有與至少一種納米顆粒接觸的相同類型的嗜冷酶，其中在與嗜冷酶接觸納米顆粒相同的溫度、緩沖液、pH、底物等條件下評(píng)價(jià)對(duì)照酶的活性）相比，所述嗜冷酶具有提高的活性。[0035]如本文所用的，關(guān)于酶的"提高的半衰期"或"增加的半衰期"指與適宜的對(duì)照的酶活性相比酶可以保留其活性的50%的時(shí)間量的提高或增加。[0036]如本文所用的，在酶的上下文中的"提高的熱穩(wěn)定性"或"增加的熱穩(wěn)定性"或"提高的耐熱性"指與適宜的對(duì)照酶相比，給定的酶在超過"正常"或"標(biāo)準(zhǔn)"溫度或溫度范圍之外的較高溫度或較高溫度范圍下，結(jié)構(gòu)和/或功能完整性和/或酶活性的提高或增加。舉例來說，但不作為限制，在本文公開的組合物和方法的一些實(shí)施方案中，與對(duì)照蛋白酶（例如，沒有與至少一種納米顆粒接觸的酶）相比，與至少一種納米顆粒接觸但不與其連接的蛋白酶在40°C、42°C、44°C、46°C、48°C和/或50°C下顯示較高的穩(wěn)定性和/或活性。[0037]如本文所用的，在酶的上下文中"提高的嗜冷性"或"增加的嗜冷性〃指與合適的對(duì)照酶相比，給定酶在超過"正常"或"標(biāo)準(zhǔn)"溫度或溫度范圍之外的較低溫度或較低溫度范圍下，結(jié)構(gòu)和/或功能完整性和/或酶活性的提高或增加。舉例來說，但不作為限制，在本文公開的組合物和方法的一些實(shí)施方案中，與對(duì)照嗜冷酶（例如，沒有與至少一種納米顆粒接觸的酶）相比，與至少一種納米顆粒接觸但不與其連接的嗜冷酶在2°C、3°C、4°C、5°〇、61：、71：、81：、91：、101：、111：、121：或131：、141：或151：下顯示較高的穩(wěn)定性和/或活性。[0038]如本文所用的，在酶的上下文中的"提高的pH穩(wěn)定性"或"提高的pH耐受性"指與適宜的對(duì)照酶相比，其顯示增加的或較寬的pH值范圍的酶，在所述pH值中，所述酶具有活性（例如，全部的任何活性，或提高的活性）。舉例來說，但不作為限制，增加或較寬的pH值范圍可以指與合適的對(duì)照酶相比，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶（例如，與至少一種納米顆粒接觸但不與其結(jié)合的酶）在酸性pH下具有更強(qiáng)酶活性，或者與合適的對(duì)照酶相比，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶在更堿性pH下具有更強(qiáng)酶活性，或者兩者的組合。[0039]如本文所用的，關(guān)于"與納米顆粒接觸但不與納米顆粒連接"的術(shù)語"與……連接"指導(dǎo)致納米顆粒固定在酶上或使納米顆粒永久地附著于酶的分子間鍵合。[0040]如本文所用的，術(shù)語"納米顆粒"指其中最大尺寸在納米范圍和/或其中所述顆粒具有在納米范圍的平均尺寸的任何顆粒。例如，在一些實(shí)施方案中，納米顆粒所具有的最大尺寸或者包含多個(gè)納米顆粒的組合物所具有的平均尺寸小于l〇〇〇nm，例如約999nm、約900nm、約800nm、約700nm、約600nm、約500nm、約400nm、約350nm、約300nm、約200nm、約100nm，或者介于這些值的任兩個(gè)之間。另外或可選地，在一些實(shí)施方案中，納米顆粒的最大尺寸，或大量納米顆粒的平均尺寸為例如約l〇〇nm、約90nm、約80nm、約70nm、約60nm、約50nm、約25nm、約20nm、約10nm、約5nm、約3nm、約2nm、約lnm或更小，或者介于這些值的任兩個(gè)之間。[0041]如本文所用的，術(shù)語"蛋白酶"（也稱為肽酶或蛋白酶）指進(jìn)行蛋白水解的酶，所述蛋白水解即，通過水解形成蛋白質(zhì)的多肽鏈中將氨基酸連接在一起的肽鍵而開始蛋白質(zhì)分解代謝。[0042]如本文所用的，"嗜冷酶"指在約0至30°C下具有最佳功能或活性的那些酶。在一些實(shí)施方案中，嗜冷酶在低于約10°c的溫度下具有最佳功能或活性。[0043]如本文所用的，術(shù)語"處理的酶"、"納米顆粒處理的酶"和"酶組合物"指本發(fā)明技術(shù)的組合物，其包括與至少一種納米顆粒接觸但不與其連接的酶。另外，在一些實(shí)施方案中，處理的酶、納米顆粒處理的酶和酶組合物指本發(fā)明技術(shù)的組合物，其包括與至少一種納米顆粒接觸但不與其連接的來自細(xì)菌的無細(xì)胞提取物或來自細(xì)菌的活細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)菌包括，但不限于嗜冷菌、嗜溫菌、或其組合。[0044]I?酶組合物[0045]本文公開了包含與至少一種納米顆粒接觸但不與其連接的酶的方法和組合物。在一些實(shí)施方案中，與適宜的對(duì)照酶相比，組合物中的酶可表現(xiàn)出提高的活性、提高的pH耐受性、提高的耐熱性和提高的半衰期的一種或多種特征。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶包括嗜冷的酶。另外或可選地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶包括蛋白酶。[0046]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶存在于來自細(xì)胞的無細(xì)胞提取物中。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞提取物來自嗜冷菌、嗜溫菌、或其組合。[0047]在另一個(gè)實(shí)施方案中，使來自細(xì)菌的大量細(xì)胞與至少一種納米顆粒接觸但不與其連接。在一些實(shí)施方案中，所述活細(xì)胞來自至少一種嗜冷菌、至少一種嗜溫菌、或其組合。[0048]A.嗜冷酶[0049]本發(fā)明技術(shù)不受嗜冷酶的類型或酶的來源所限制。在一些實(shí)施方案中，嗜冷酶可以是從天然來源（例如，嗜冷原核生物或真核生物比如細(xì)菌或霉菌）分離的，或可以是重組制備的。在一些實(shí)施方案中，嗜冷酶可以是"野生型"或可以是突變體，并且與野生型酶相t匕，可以包括一種或多種氨基酸置換、添加或缺失。[0050]本文公開的組合物和方法中可以使用的嗜冷酶的非限制性實(shí)例包括果膠酶、漆酶、木聚糖酶、纖維素酶及其組合。[0051]B.嗜溫酶[0052]本發(fā)明技術(shù)不受嗜溫酶的類型或酶的來源所限制。在一些實(shí)施方案中，本文公開的嗜溫酶可以是從天然來源（例如，嗜冷原核生物或真核生物比如細(xì)菌、酵母菌、霉菌等）分離的，或可以是重組制備的。在一些實(shí)施方案中，嗜冷酶可以是"野生型"或可以是突變體，并且與野生型酶相比，可以包括一種或多種氨基酸置換、添加或缺失。[0053]可用于本文公開的組合物和方法中的嗜溫酶的非限制性實(shí)例包括蛋白酶。[0054]C?納米顆粒[0055]本發(fā)明技術(shù)的納米顆粒不受構(gòu)型的限制，并且可具有任何形狀。例如，在一些實(shí)施方案中，納米顆?？梢允腔旧锨蛐蔚?。另外或可選地，在一些實(shí)施方案中，納米顆?？梢跃哂袡E圓形、立方形、圓柱形或不規(guī)則形狀的形狀。根據(jù)形狀的不同，本文描述的尺寸可以指直徑、寬度、長度、高度、對(duì)角線等的任一個(gè)。而且，在其中所述組合物含有大量納米顆粒的情況中，本文所述尺寸可以指多個(gè)納米顆粒的單獨(dú)尺寸的平均值。例如，在一些實(shí)施方案中，大量納米顆粒的單獨(dú)尺寸的平均值為約l〇〇〇nm、約999nm、約900nm、約800nm、約700nm、約600nm、約500nm、約400nm、約300nm、約200nm、約100nm、或介于這些值的任兩個(gè)之間。另外或可選地，在一些實(shí)施方案中，多個(gè)納米顆粒的單獨(dú)尺寸的平均值為例如約l〇〇nm、約90nm、約80nm、約70nm、約60nm、約50nm、約25nm、約20nm、約10nm、約5nm、約3nm、約2nm、約lnm，或者介于這些值的任兩個(gè)之間。[0056]在一些實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有基本上球形的形狀，并且直徑為約2nm至約500nm、約10nm至約500nm、約25nm至約500nm、約50nm至約400nm、約100nm至約400nm、約80nm至約100nm。[0057]本發(fā)明的示例性的納米顆粒包括，但不限于氧化亞銅納米顆粒、羥磷灰石（HAp)納米顆粒、氯化鎂納米顆粒、氯化猛納米顆粒、氯化興納米顆粒、鋅納米顆粒、鎂納米顆粒、猛納米顆粒、或其組合。[0058]D.形成本發(fā)明技術(shù)的酶組合物[0059]在一些實(shí)施方案中，形成具有提高的活性、耐熱性、pH耐受性、半衰期等的酶組合物包括混合至少一種嗜冷酶或蛋白酶與至少一種納米顆粒，其中所述納米顆粒與所述嗜冷酶或蛋白酶接觸，但不與所述嗜冷酶或蛋白酶連接。[0060]在一些實(shí)施方案中，納米顆粒與嗜冷酶的比例（wt/wt)為約1:4、或約1:3、或約1:2、或約3:5、或約1:1、或者介于這些值的任兩個(gè)之間。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒與蛋白酶的比例（wt/wt)為約1:4、或約1:3、或約1:2、或介于這些值的任兩個(gè)之間。[0061]在一些實(shí)施方案中，將納米顆粒和酶（例如，嗜冷酶或蛋白酶）的混合物渦旋。在一些實(shí)施方案中，渦旋是約2至3秒脈沖進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，渦旋在室溫下進(jìn)行。[0062]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物的形成包括將來自細(xì)菌的無細(xì)胞提取物與至少一種納米顆粒組合。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞提取物來自嗜冷菌、嗜溫菌、或其組合。[0063]E?本發(fā)明的酶組合物的特征[0064]在一些實(shí)施方案中，酶（例如，嗜冷酶或蛋白酶）與納米顆粒接觸導(dǎo)致下述一種或多種：提高的酶活性、提高的pH耐受性、提高的耐熱性、增加的半衰期、和/或承受多種冷凍-解凍循環(huán)和維持給定的活性水平的能力。[0065]1.提高的活性和半衰期[0066]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物或蛋白酶組合物的提高的活性或增加的活性是通過最大反應(yīng)速度（Vmax)增加、轉(zhuǎn)換數(shù)（即，每單位時(shí)間每個(gè)酶位點(diǎn)的底物分子轉(zhuǎn)換為產(chǎn)物的數(shù)量）增加、和/或底物親和力增加（例如，米氏常數(shù)（Km)降低）、活化能（Ea)降低、或其組合來測定的。[0067]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的組合物中的嗜冷酶或蛋白酶具有比對(duì)照嗜冷酶較長的半衰期和/或較低的衰變常數(shù)。在一些實(shí)施方案中，較長的半衰期和/或較低的衰變常數(shù)提高了嗜冷酶或蛋白酶的生產(chǎn)率，因?yàn)樵撁冈陂L期的反應(yīng)過程期間較長時(shí)期地保持活性。[0068]在一些實(shí)施方案中，與對(duì)照酶的酶活性時(shí)長相比，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶或蛋白酶在更長的時(shí)間段保持酶活性。在一些實(shí)施方案中，嗜冷酶組合物或蛋白酶組合物保持酶活性持續(xù)約1.5小時(shí)至約5小時(shí)之間、或約2小時(shí)至約4.5小時(shí)之間、或約2.5小時(shí)至約4小時(shí)之間、或約3小時(shí)至約3.5小時(shí)之間。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒處理的酶的酶活性的持續(xù)時(shí)間為約1.5小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、或介于這些值的任兩個(gè)之間。[0069]在一些實(shí)施方案中，在約2°C至約30°C之間、或約4°C至約26°C之間、或約6°C至約22°C之間、或約10°C至約18°C之間、或約12°C至約16°C之間的溫度下觀察到與對(duì)照酶相t匕，納米顆粒處理的酶的酶活性的延長的持續(xù)時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，溫度為約2°C、4°C、8°C、12°C、16°C、20°C、24°C、28°C、或30°C、或介于這些值的任兩個(gè)之間。[0070]2?低溫下嗜冷酶提高的活性[0071]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)提高了低溫下嗜冷酶的活性。嗜冷酶經(jīng)改造而在從約o°c至約10°C的低溫下具有高活性。另外，嗜冷酶通常具有比其嗜溫對(duì)應(yīng)物更高的特異性。雖然嗜冷酶在極低溫度例如低于約l〇°C下具有酶活性，但是與對(duì)照嗜冷酶相比，將嗜冷酶與至少一種納米顆粒相接觸提高了嗜冷酶的酶活性。[0072]在一些實(shí)施方案中，嗜冷酶的提高的活性指在約0°C至約10°C、或約2°C至約8°C、或約4°C至約6°C的溫度下的酶活性。在一些實(shí)施方案中，在納米顆粒處理的嗜冷酶的上下文中的參考溫度為約01：、11：、21：、31：、41：、51：、61：、71：、或81：、或91：、或101：、或介于這些值的任兩個(gè)之間。[0073]3.提高的耐熱性和提高的蛋白酶活性[0074]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物顯示在"標(biāo)準(zhǔn)"溫度、以及在高于標(biāo)準(zhǔn)的溫度、或標(biāo)準(zhǔn)溫度范圍下提高的蛋白酶酶活性。蛋白酶類，如同許多酶一樣，在較高溫度下變性并喪失其酶活性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的納米顆粒處理的蛋白酶類具有增加的熱穩(wěn)定性和在較高的溫度下具有比對(duì)照蛋白酶類更高的酶活性。[0075]在一些實(shí)施方案中，納米顆粒處理的蛋白酶的提高的熱穩(wěn)定性指在約40°C至約90°C、約45°C至約85°C、或約50°C至約80°C、或約55°C至約75°C、或約60°C至約70°C的溫度范圍下的蛋白酶酶活性。在一些實(shí)施方案中，包含納米顆粒處理的蛋白酶的組合物的反應(yīng)溫度為約40°C、42°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、或80°C、或90°C、或介于這些值的任兩個(gè)之間。[0076]4.提高的pH穩(wěn)定性[0077]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的技術(shù)還提供具有提高的pH穩(wěn)定性的酶組合物。舉例來說，但不作為限制，在一些實(shí)施方案中，與對(duì)照酶相比，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物或蛋白酶能夠在更大或更寬pH范圍下起作用。在一些實(shí)施方案中，所述嗜冷酶組合物或蛋白酶組合物在更酸性pH和/或更堿pH下顯示比對(duì)照酶更強(qiáng)活性。例如，用氧化銅納米顆粒處理的嗜冷漆酶在約PH5至約pHll下顯示最佳酶活性。對(duì)照漆酶在pH7.5至pHIO下顯示最佳酶活性。[0078]5?冷凍-解凍循環(huán)之后酶的穩(wěn)定化[0079]在一些實(shí)施方案中，與對(duì)照酶相比，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物在三次或多次冷凍-解凍循環(huán)之后，具有提高的酶活性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶保持酶活性高達(dá)4個(gè)冷凍-解凍循環(huán)、5個(gè)冷凍-解凍循環(huán)、6個(gè)冷凍-解凍循環(huán)、7個(gè)冷凍-解凍循環(huán)、8個(gè)冷凍-解凍循環(huán)、或9個(gè)冷凍-解凍循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，所述嗜冷酶保持酶活性超過9個(gè)冷凍-解凍-循環(huán)。[0080]II.使用本發(fā)明技術(shù)的酶組合物的方法[0081]在一些實(shí)施方案中，將至少一種提高的嗜冷酶組合物或蛋白酶組合物與至少一種底物接觸。在一些實(shí)施方案中，所述接觸是在約〇°C至約10°C、或約2°C至約8°C、或約4°C至約6°C的溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，例如，用于嗜冷酶組合物的接觸溫度為約0°C、1°〇、21：、31：、41：、51：、61：、71：、或81：、或91：、或101：、或介于這些值的任兩個(gè)之間。[0082]在一些實(shí)施方案中，所述接觸是在約40°C至約90°C、從約45°C至約85°C、或從約50°C至約80°C、或從約55°C至約75°C、或從約60°C至約70°C的溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，例如對(duì)于蛋白酶組合物的接觸溫度為約40°C、37°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、或80°C、或90°C、或介于這些值的任兩個(gè)之間。[0083]在一些實(shí)施方案中，所述接觸進(jìn)行約1.5小時(shí)至約5小時(shí)、或約2小時(shí)至約4.5小時(shí)、或約2.5小時(shí)至約4小時(shí)、或約3小時(shí)至約3.5小時(shí)。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒處理的酶的酶活性的持續(xù)時(shí)間為約1.5小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)或以上、介于這些值的任兩個(gè)之間。[0084]在一些實(shí)施方案中，最佳產(chǎn)物生成包括接觸約1小時(shí)、或約2小時(shí)、或約3小時(shí)、或介于這些值的任兩個(gè)之間的任何范圍。[0085]III.試劑盒[0086]在一些實(shí)施方案中，提供了試劑盒。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括包含酶的第一容器和包含納米顆粒的第二容器。在一些實(shí)施方案中，所述酶包括嗜冷酶或蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，所述嗜冷酶包括，但不限于果膠酶、漆酶纖維素酶和木聚糖酶。在一些實(shí)施方案中，所述納米顆粒包括氧化亞銅、羥磷灰石（HAP)、氯化鎂、氯化錳和氯化鈣中的一種或多種。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包括將納米顆粒和酶相組合的說明書。[0087]在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括具有一種或多種嗜冷酶的第一容器、具有一種或多種納米顆粒的第二容器、和具有一種或多種蛋白酶的第三容器。在一些實(shí)施方案中，所述嗜冷酶包括，但不限于果膠酶、漆酶、纖維素酶和木聚糖酶。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒包括氧化亞銅、羥磷灰石（HAp)、氯化鎂、氯化錳和氯化鈣中的一種或多種。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包括將納米顆粒和嗜冷酶相組合的說明書。另外，在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包括將納米顆粒和蛋白酶相組合的說明書。[0088]在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括酶組合物。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括嗜冷酶組合物和/或蛋白酶組合物。在一些實(shí)施方案中，所述嗜冷酶試劑盒包括具有與至少一種納米顆粒組合的至少一種嗜冷酶的容器。納米顆粒與嗜冷酶接觸，但是不與嗜冷酶結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括具有與至少一種納米顆?；旌系闹辽僖环N蛋白酶的容器。納米顆粒與蛋白酶接觸，但不該蛋白酶結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，試劑盒同時(shí)包括嗜冷酶組合物和蛋白酶酶組合物。[0089]在上述公開的任一個(gè)試劑盒實(shí)施方案中，在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括利用所述酶組合物處理底物（例如，酶與納米顆粒接觸）的說明書。[0090]IV.本文公開的酶組合物的示例性用途[0091]A?概述[0092]本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物在低溫和中等溫度下的高活性提供了潛在的經(jīng)濟(jì)效益，例如通過在大規(guī)模工藝中大量的能量節(jié)約，其不需要昂貴的反應(yīng)器加熱。嗜冷酶也可以用于家用方案中。例如，在低溫下洗衣可以保護(hù)織物顏色（并減少能源消耗）。在食品工業(yè)中，它們的性質(zhì)允許進(jìn)行熱敏產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化或精煉，作為實(shí)例，在低溫下，冷活性果膠酶可以有助于降低粘度和使果汁澄清。這些酶的熱不穩(wěn)定性也確保它們?cè)趶?fù)雜混合物中快速、有效和選擇性的失活。[0093]當(dāng)內(nèi)源性微菌群的降解能力由于低溫而受損時(shí)，本發(fā)明的嗜冷酶組合物也可用于在溫帶國家的冬季期間的污染土壤和廢水的生物再修復(fù)（bioremediation)。[0094]本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物，除了在需要快速和溫和的滅活處理的多步驟過程中可以利用的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性之外，在低溫和中等溫度下，還因其提高的選擇性和高催化活性而是有益的。而且，適冷的酶的固有的構(gòu)象可塑性可尤其適于在低水條件下的有機(jī)合成應(yīng)用，該低水條件是在制備許多精細(xì)化學(xué)品和藥物中間體期間使用的。[0095]本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可以用于多種目的。例如，所述組合物提供在工業(yè)加工溫度下，分解木質(zhì)素纖維素（ligninocellulosic)材料的強(qiáng)催化替代物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的組合物可用于纖維和棉花的生物漂白。所述組合物可以對(duì)環(huán)境友好的方法用于織物和紙工業(yè)中。在一些實(shí)施方案中，所述組合物可用于處理含有酚、芳基胺、二胺材料和織物染料試劑的工業(yè)廢水。在一些實(shí)施方案中，所述組合物可用于工業(yè)廢水的解毒。在一些實(shí)施方案中，所述組合物可用于天然韌皮纖維（例如，大麻和亞麻）和棉織物的浸漬或生物精練（bioscouring)。在一些實(shí)施方案中，所述組合物可用作生物再修復(fù)的有效工具。[0096]例如，在一些實(shí)施方案中，所述組合物可用于通過用組合物接觸和/或培養(yǎng)所述底物來處理底物，其中所述底物包括酚羥基。在一些實(shí)施方案中，底物包含偶氮基。在一些實(shí)施方案中，底物包括丁香醛連氮、剛果紅、棉藍(lán)、溴酚藍(lán)和孔雀綠。在一些實(shí)施方案中，底物包含鄰-和對(duì)-二元酚、氨基苯酚、多酚、多胺、木質(zhì)素和/或芳基二胺。在一些實(shí)施方案中，底物包括織物、羊毛、生物復(fù)合材料、廢水、紙、木漿、土壤、動(dòng)物飼料、食品、飲料、除草齊IJ、殺蟲劑、染料、顏料或其組合。在一些實(shí)施方案中，底物包含含木質(zhì)素的木漿。[0097]在一些實(shí)施方案中，底物包括染料或顏料，其中所述酶與染料或顏料反應(yīng)，減少了底物的顏色或使底物脫色。在一些實(shí)施方案中，底物包括包含染料的織物，其中所述酶與染料或顏料反應(yīng)，減少了織物的顏色或使織物脫色。在一些實(shí)施方案中，底物包括包含酚類化合物的飲料，其中所述酶與酚化合物反應(yīng)以降低或除去飲料的褐色或濁度。在一些實(shí)施方案中，飲料選自果汁、啤酒或紅酒。[0098]在一些實(shí)施方案中，包含漆酶的本文公開的酶組合物可以通過催化它們的酚羥基氧化成苯氧基而作用于酚醛底物，同時(shí)雙氧（〇2)被還原為水。酶催化氧化技術(shù)在包括漿料和紙、織物和食物工業(yè)的許多工業(yè)內(nèi)具有前景。[0099]在一些實(shí)施方案中，本文公開的包含果膠酶的酶組合物具有多種用途。舉例來說，但不作為限制，這樣的酶組合物用于食品加工，和催化引起食品質(zhì)量改善的化學(xué)反應(yīng)。本文公開的包含果膠酶的酶組合物在紙工業(yè)和制漿工業(yè)、織物、果汁工業(yè)等中具有一些用途。[0100]在一些實(shí)施方案中，本文公開的包含纖維素酶的酶組合物用于多種工業(yè)中，包括漿料和紙、織物、洗衣、生物燃料生產(chǎn)、食品和飼料工業(yè)、釀酒和農(nóng)業(yè)。由于酶系統(tǒng)的復(fù)雜性和巨大工業(yè)潛力，纖維素酶已經(jīng)成為高校和工業(yè)研究組研究的潛在候選物。[0101]在一些實(shí)施方案中，本文公開的包含木聚糖酶的酶組合物用于生物技術(shù)中；示例性的用途包括生物漂白木漿、處理動(dòng)物飼料以提高可消化性、加工食品以增加澄清度和將木質(zhì)素纖維物質(zhì)轉(zhuǎn)化成原料和燃料。[0102]在一些實(shí)施方案中，本文公開的包含蛋白酶類的酶組合物用于水解組合物，和用于清潔劑、食品、藥品、皮革、診斷學(xué)、廢物處理和銀回收。在一些實(shí)施方案中，所述蛋白酶為細(xì)菌蛋白酶。[0103]以下提供了本發(fā)明技術(shù)的酶組合物的示例性的、非限制性的用途。[0104]B.低溫下葡萄糖和其它還原糖的產(chǎn)生[0105]在一些實(shí)施方案中，上述嗜冷酶組合物可用于在低溫下由底物產(chǎn)生葡萄糖及其它還原糖。本發(fā)明技術(shù)的用途可以減少用于產(chǎn)生葡萄糖和由某些底物還原的當(dāng)前方法中所用的反應(yīng)需酸預(yù)處理和/或高溫的需求。[0106]在一些實(shí)施方案中，將與至少一種納米顆粒接觸的至少一種蛋白酶與至少一種底物接觸。在一些實(shí)施方案中，所述底物包括，但不限于脫粒玉米芯、脫粒玉米芯廢物、木質(zhì)素-纖維素生物質(zhì)、稻草和馬鈴薯皮。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒包括，但不限于氧化亞銅。在一些實(shí)施方案中，使蛋白酶與底物接觸約1小時(shí)、或約2小時(shí)、或約3小時(shí)、或介于這些值的任兩個(gè)之間的任何范圍。在一些實(shí)施方案中，所述接觸是在約40°C至約90°C之間、或約50°C至約80°C之間、或約60°C至約70°C之間進(jìn)行的。另外或可選地，在一些實(shí)施方案中，所述接觸是在pH為約5至約10之間、或約6至約9之間、或約7至約8之間進(jìn)行的。[0107]利用本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物對(duì)來自納米顆粒處理的蛋白酶和底物的孵育的產(chǎn)物進(jìn)行另一孵育。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物包括與至少一種納米顆粒接觸但不與其結(jié)合的一種或多種嗜冷酶。在一些實(shí)施方案中，嗜冷酶包括，但不限于果膠酶、漆酶、纖維素酶和木聚糖酶中的一種或多種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物包括來自與至少一種納米顆粒接觸但不與其結(jié)合的嗜冷細(xì)菌的細(xì)胞提取物。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞提取物包括，但不限于果膠酶、漆酶、纖維素酶和木聚糖酶中的一種或多種。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物包括來自與至少一種納米顆粒接觸但不與其連接的嗜冷細(xì)菌的活細(xì)胞。[0108]在一些實(shí)施方案中，所述納米顆粒包括，但不限于氧化亞銅、HAp或其組合。在一些實(shí)施方案中，使嗜冷酶組合物與底物接觸約〇.5小時(shí)、或約1小時(shí)、或約1.5小時(shí)、或約2小時(shí)、或這些值的任兩個(gè)之間的任何范圍。在一些實(shí)施方案中，所述接觸是在約2°C至約15°C、或約3°C至約12°C、或約4°C至約8°C的溫度下進(jìn)行的。另外或可選地，在一些實(shí)施方案中，所述接觸是在pH為約6至約11、或約7至約10、或約8至約9的pH下進(jìn)行的。[0109]C.清潔劑和清潔產(chǎn)品[0110]在一些實(shí)施方案中，本文公開的嗜冷酶組合物可用作清潔劑。在一些實(shí)施方案中，所述清潔劑在低溫下有效地水解土壤和污垢，從而降低能量消耗，其導(dǎo)致降低的相關(guān)費(fèi)用和環(huán)境影響。另外，減少了在溫水和熱水洗滌循環(huán)期間發(fā)生的衣服變化比如織物降解、皺縮和染料析水?？紤]到特別地在歐洲和日本降低洗滌溫度的趨勢，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物能夠在低至介質(zhì)溫度條件下在清潔劑中有效地作用。[0111]例如，在一些實(shí)施方案中，嗜冷酶組合物包含纖維素酶，所述組合物用于制備纖維素酶基清潔劑。包含本發(fā)明技術(shù)的嗜冷纖維素酶酶組合物的纖維素酶-基清潔劑具有優(yōu)越的清潔作用而不會(huì)損壞纖維，提高了顏色亮度和污垢清除，除去了棉織品中粗糙突起(roughprotuberances)，并提供了油墨粒子的抗再沉淀作用。[0112]在一些實(shí)施方案中，由于其具有幫助清除蛋白質(zhì)的污染和遞送采用常規(guī)清潔劑技術(shù)不能以其它方式得到的獨(dú)特益處的能力，本發(fā)明技術(shù)的蛋白酶組合物可用于清潔劑中。例如，在一些實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的蛋白酶類組合物的清潔劑具有改善的性能/成本t匕，提高了活性和改善了與其它清潔劑成分的相容性。[0113]D.紙制品和造紙[0114]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物用于造紙。紙漿廠和造紙廠開始在它們的制造過程中使用酶解決問題。造紙基本上是連續(xù)過濾其中纖維、纖維片段（細(xì)料）和無機(jī)填料顆粒比如粘土的稀懸浮液的過程。這些多糖中主要是果膠或聚半乳糖醛酸。聚半乳糖醛酸絡(luò)合陽離子聚合物（陽離子需求）的能力強(qiáng)烈取決于它們的聚合度，半乳糖醛酸的單體、二聚體和三聚體不會(huì)產(chǎn)生可測量的陽離子需求，但是六聚體和長鏈具有高陽離子需求。本【
發(fā)明內(nèi)容】的果膠酶組合物例如可用于使半乳糖醛酸聚合物解聚，接著降低果膠溶液和來自過氧化物漂白的陽離子需求。[0115]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物用于制備日本紙。例如，本發(fā)明技術(shù)的堿性果膠酶組合物是由芽孢桿菌（Bacillussp.)和胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwiniacarotovora)產(chǎn)生的，由于其強(qiáng)的浸解活性，用于浸漬結(jié)香（Mitsumata)韌皮。這些浸漬的韌皮用于制造日本紙。在一些實(shí)施方案中，來自使用本【
發(fā)明內(nèi)容】的組合物所浸漬細(xì)菌的漿料的強(qiáng)度高達(dá)通過常規(guī)蘇打灰煮法（soda-ashcookingmethod)獲得的強(qiáng)度。由此楽料制造的紙張非常均勻且觸感柔軟。[0116]工業(yè)制紙包括分離和降解木漿中的木質(zhì)素。環(huán)境問題集中于替代常規(guī)且污染的氯基脫木質(zhì)化/漂白過程。因此，本【
發(fā)明內(nèi)容】的嗜冷木質(zhì)素降解（木質(zhì)素-降解）酶（漆酶）組合物可用于（預(yù)）處理木質(zhì)纖維素原料，比如漿料中的木片；這稱為生物制漿。使用本發(fā)明技術(shù)的酶組合物的生物制漿適用于機(jī)械和化學(xué)漿料；優(yōu)點(diǎn)包括降低機(jī)械紙漿中精磨能量(refiningenergy)或增加研磨生產(chǎn)量，并且在機(jī)械制楽和化學(xué)制楽和造紙中，提高紙強(qiáng)度性質(zhì)、減輕樹脂（pitch)問題、提高產(chǎn)率和降低環(huán)境影響。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可以應(yīng)用于工業(yè)造紙。例如，如本文公開的嗜冷漆酶組合物可用于在所述復(fù)合物制備期間活化纖維素結(jié)合的木質(zhì)素，因此，產(chǎn)生具有良好機(jī)械性質(zhì)而不含有毒合成粘合劑的紙板。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的漆酶組合物可用于將多種酚酸衍生物接枝到牛皮紙漿纖維上。另外，本【
發(fā)明內(nèi)容】的嗜冷木聚糖酶酶組合物可以用于從牛皮紙漿清除殘余木質(zhì)素。來自牛皮紙漿制法的殘余木質(zhì)素在物理和化學(xué)上受半纖維素的限制。木質(zhì)素可以連接半纖維素，并且存在從牛皮紙漿分離木質(zhì)素糖復(fù)合物。半纖維素是木聚糖酶的底物。[0117]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可以應(yīng)用于漿料和紙的制造。例如，如本文公開的纖維素酶組合物可用作漿料漂白中的共同添加劑；生物機(jī)械法制漿；改善排水；酶法脫墨；降低能量需求；降低需氯量；改善纖維亮度、強(qiáng)度性質(zhì)及漿料游離度和清潔度；改善造紙廠的排水；制造可生物降解的紙板、紙巾和衛(wèi)生紙。[0118]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可應(yīng)用于降低造紙工業(yè)的環(huán)境污染。例如，在常規(guī)漿料漂白期間產(chǎn)生的氯化酚化合物以及多氯聯(lián)二苯是有毒的，對(duì)生物降解有高度抗性，形成了環(huán)境污染的主要來源之一。本【
發(fā)明內(nèi)容】的木聚糖酶組合物可用于無氯木漿漂白法。[0119]E.廢水和廢物處理[0120]造紙廠和制漿廠、糖蜜基-酒廠、制革廠、染料制造單位和紡織業(yè)是產(chǎn)生和排放色度高的廢水的一些主要工業(yè)。每種這些工業(yè)廢水都除了產(chǎn)生土壤和水體的美學(xué)不可接受的強(qiáng)烈染色之外，還產(chǎn)生一些特殊的問題。它們阻斷光穿過較淺深度的水生系統(tǒng)，導(dǎo)致光合作用停止，引起缺氧狀態(tài)，其依次導(dǎo)致水生生物死亡，產(chǎn)生惡臭有毒的水。[0121]由于工業(yè)廢水造成的污染問題近年來不斷增加。一般而言，染色過程具有低產(chǎn)率，廢水中丟失的染料的百分比可以達(dá)到50%。例如，織物染料廢水是復(fù)合物，含有多種燃料、從纖維及其它產(chǎn)品提取的天然雜質(zhì)，比如分散劑、均化劑、酸、堿金屬、鹽及有時(shí)的重金屬。通常，廢水的色度高，具有生物需氧量（B0D)、懸浮固體（SS)、毒性和化學(xué)需氧量（C0D)，其具有高導(dǎo)電性，且本質(zhì)是堿性的。染料的降解產(chǎn)物通常是致癌的。為了滿足嚴(yán)格的環(huán)境保護(hù)法規(guī)，廢水在排放到環(huán)境之前必須處理。處理染料廢水的大多數(shù)現(xiàn)有方法都是低效和不經(jīng)濟(jì)的。因此，由于其在降解不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的染料（包括目前工業(yè)中應(yīng)用的合成染料）的潛能，基于包含漆酶的組合物進(jìn)行方法研究似乎是很有吸引力的解決方法。本發(fā)明技術(shù)的酶組合物，例如包含漆酶酶，能夠通過經(jīng)由基團(tuán)偶聯(lián)催化其聚合化使含有氯酚的廢水解毒。可以通過沉淀從廢水中除去偶聯(lián)產(chǎn)物。氯酚也可以與廢水中存在的其它苯酚交聯(lián)偶聯(lián)和用其沉淀，其可提高氯酚的清除效率。[0122]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物用于處理含果膠的廢水。來自柑橘-加工工業(yè)的廢水含有果膠的（pectinaceous)物質(zhì)，其在活化的-污泥處理期間幾乎不能被微生物分解。因此，本發(fā)明技術(shù)的含有果膠酶酶組合物用于治療含果膠的廢水。[0123]F.食品、飲料、飼料工業(yè)、藥品和化妝品[0124]在一些實(shí)施方案中，由于本文公開的嗜冷酶組合物在使腐敗及味道和營養(yǎng)價(jià)值的變化最小化的溫度下高催化活性，其對(duì)于食品加工特別有吸引力。一旦獲得期望的產(chǎn)品，它們固有的低結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也促進(jìn)失活。[0125]本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物在低溫度和環(huán)境溫度下顯示高催化活性，也可以開發(fā)用于制藥工業(yè)。對(duì)對(duì)映異構(gòu)體純的藥物和藥物中間體的不斷增長的需求導(dǎo)致有機(jī)合成中生物催化劑的使用的快速發(fā)展。[0126]在化妝品工業(yè)中，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物可以提高涉及揮發(fā)性底物生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)率，比如調(diào)味劑和香料化合物接受在高溫下的蒸發(fā)。[0127]舉例來說，但不作為限制，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可以用于提高或改善食品、動(dòng)物飼料或飲料的顏色外觀的方法中。本發(fā)明技術(shù)的組合物用于清除不想要的酚類，所述酚類引起澄清的果汁、啤酒和葡萄酒變褐色、形成薄霧、和濁度變化。在一些實(shí)施方案中，所述組合物用于食品工業(yè)的不同方面，比如生物再修復(fù)、飲料加工、抗壞血酸測定、甜菜果膠凝膠化、烘焙和作為生物傳感器。[0128]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物用于咖啡和茶葉發(fā)酵。例如，果膠酶在咖啡和茶葉發(fā)酵中起重要作用。使用果膠分解（pectinolytic)微生物發(fā)酵咖啡以從咖啡豆除去粘液表層。有時(shí)，加入果膠酶以清除菜豆的果肉層，其中四分之三由果膠物質(zhì)組成。[0129]真菌果膠酶也用于制備茶。酶處理加速了茶葉發(fā)酵，但是必須小心地調(diào)節(jié)酶劑量以防止破壞茶葉。加入果膠酶也通過破壞茶膠改善了速溶茶粉末的成泡性能。[0130]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可應(yīng)用于發(fā)酵。例如，纖維素酶可用于改善麥芽制造和淀粉糖化（mashing);改善葡萄的壓榨和顏色提?。桓纳破咸丫频南銡?；改善啤酒的初發(fā)酵和質(zhì)量；改善葡萄酒的粘度和可濾性；改善葡萄酒生產(chǎn)中鮮葡萄汁澄清；改善過濾速度和葡萄酒穩(wěn)定性。[0131]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可應(yīng)用于食品產(chǎn)生。例如，纖維素酶在從水果和蔬菜渣中釋放抗氧劑中起作用；提高淀粉和蛋白質(zhì)提取的產(chǎn)率；改善水果和蔬菜的浸解、壓榨和色彩提?。皇构吻?；改善焙烤食品的質(zhì)地和質(zhì)量；改善果醬粘度；改善水果和蔬菜的質(zhì)地、香味、香氣和揮發(fā)性性質(zhì)；控制柑桔類水果的苦味。[0132]G.生物燃料[0133]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物用于制造生物燃料，比如由植物產(chǎn)生的糖的發(fā)酵制造的乙醇。由本發(fā)明技術(shù)的組合物制造的生物燃料代表可再生能源，其可提供無數(shù)的其它益處，包括增加能源安全、減少溫室氣體排放、農(nóng)村社區(qū)的經(jīng)濟(jì)益處、和減少與農(nóng)業(yè)工業(yè)殘余物處理的有關(guān)問題。目前，所有的燃料乙醇都是通過發(fā)酵基于含淀粉的作物的糖制造的，工業(yè)酶公司尋求由低成本的木質(zhì)纖維生物資源（包括農(nóng)業(yè)廢物、林業(yè)廢物、能源作物和城市固體廢物）制造便宜乙醇的方法。舉例來說，但不作為限制，本發(fā)明技術(shù)的包含適冷的糖基水解酶比如纖維素酶、木聚糖酶和糖苷酶的組合物可能能夠進(jìn)行成本有效的木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化，因此便于經(jīng)濟(jì)可行的且可再生的燃料來源的發(fā)展?jié)M足世界不斷增長的能源需要。[0134]H?酶納米生物技術(shù)[0135]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酶組合物用于在低溫和溫和條件下合成納米結(jié)構(gòu)材料。這產(chǎn)生對(duì)傳統(tǒng)合成技術(shù)的便宜的、環(huán)境友好的替代物。[0136]I.使用漆酶的示例性的應(yīng)用[0137]漆酶可以作用于廣泛范圍的底物。其具有氧化酚木質(zhì)素和非酚木質(zhì)素相關(guān)化合物以及高度頑固的環(huán)境污染物的能力，這使得該酶對(duì)于一些生物技術(shù)過程的應(yīng)用非常有用。這樣的應(yīng)用包括使主要來自紙張和漿、織物和石化工業(yè)的工業(yè)廢水解毒，用作醫(yī)學(xué)診斷的工具和用作清除土壤中的除草劑、殺蟲劑和某些爆炸物的生物再修復(fù)劑。漆酶也用作一些水凈化系統(tǒng)的清潔劑、用作制造抗癌藥物的催化劑并且甚至用作化妝品中的成分。另外，其除去外源物物質(zhì)和生產(chǎn)聚合產(chǎn)物的能力使其成為用于生物再修復(fù)目的的有用工具。[0138]1.漆酶用于木質(zhì)纖維材料的降解[0139]包含漆酶的本發(fā)明技術(shù)的組合物用于降解木質(zhì)纖維材料。該組合物可用于例如引發(fā)一系列氧化還原反應(yīng)，其降解木質(zhì)素（或木質(zhì)素-衍生的污染物）。該組合物可用于氧化芳香化合物直到芳香環(huán)結(jié)構(gòu)被裂解，然后其可以被其它酶進(jìn)行另外的降解。木質(zhì)纖維材料的分解具有廣泛種類的工業(yè)應(yīng)用。[0140]木質(zhì)纖維材料的酶催化水解是消化成沼氣（甲烷）或發(fā)酵成乙醇的第一個(gè)步驟。乙醇在體積和市場價(jià)值方面是重要的可再生生物燃料。乙醇的需求具有巨大的市場，因?yàn)橐掖纪ǔＳ米骰瘜W(xué)原料或用作辛烷值提高劑或汽油添加劑。因此，本發(fā)明技術(shù)的組合物用于從木質(zhì)纖維材料制造乙醇。[0141]沼氣是另一種能源，其用作汽車燃料或用于產(chǎn)熱或發(fā)電。用本發(fā)明技術(shù)的組合物預(yù)處理木質(zhì)纖維素材料將降解木質(zhì)纖維素材料且有助于生產(chǎn)乙醇和沼氣。[0142]木質(zhì)纖維分解廢物的生物轉(zhuǎn)化可以對(duì)生產(chǎn)有機(jī)化學(xué)品有顯著的貢獻(xiàn)。[0143]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的組合物可用于生產(chǎn)香草醛。香草醛是木質(zhì)素分解的一種示例性的生物產(chǎn)品。香草醛的最大應(yīng)用是作為調(diào)味料，通常用在甜食中。其作為許多不同調(diào)味劑（特別是乳脂狀的）的非常重要的主味（keynote)用于調(diào)味劑工業(yè)中。冰淇淋和巧克力工業(yè)一起占香草醛作為調(diào)味料市場的75%，較小數(shù)量用于甜食和烤焙物中。香草醛也用于香料工業(yè)、掩蔽藥品的不良?xì)馕痘蚩谖兜南懔?、家畜飼料和清潔產(chǎn)品中。香草醛已經(jīng)用作藥物生產(chǎn)及其它精細(xì)化學(xué)品中的化學(xué)中間體。[0144]2?漆酶用于有機(jī)合成[0145]在一些實(shí)施方案中，包含漆酶的本發(fā)明技術(shù)的組合物可以用于有機(jī)合成中的一些應(yīng)用，例如氧化官能團(tuán)、偶聯(lián)苯酚和類固醇。[0146]在一些實(shí)施方案中，包含漆酶的本發(fā)明技術(shù)的組合物可用于苯酚向兒茶酚的需氧轉(zhuǎn)化。兒茶酚是殺蟲劑、調(diào)味劑和香料的前體。約50%的合成兒茶酚消耗在殺蟲劑的生產(chǎn)中，其余用作精細(xì)化學(xué)品比如香料和藥物的前體。[0147]兒茶酚是有機(jī)合成中一種常見結(jié)構(gòu)單元。一些工業(yè)上大量的調(diào)味劑和香料是從兒茶酚開始制備的。愈創(chuàng)木酚是通過將兒茶酚甲基化，然后轉(zhuǎn)化成香草醛制備的。兒茶酚的相關(guān)單乙基醚（鄰乙氧基苯酚）轉(zhuǎn)化為乙基香草醛，巧克力甜食中的一種組分。3-反式-異莰基環(huán)己醇，廣泛地用作檀香油的替代物，是經(jīng)由愈創(chuàng)木酚和樟腦從兒茶酚制備的。胡椒醛，具有花香味，是由兒茶酚的亞甲基二醚制備的，接著與乙二醛縮聚和脫羧基。[0148]本發(fā)明技術(shù)的組合物用于氧化酚類化合物（例如，苯酚、多酚、和間取代酚）、二胺和多種利用分子氧的其它組分。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的組合物通過氧化苯酚和兒茶酚用于合成醌類。醌類的大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用是用于生產(chǎn)過氧化氫。2-烷基蒽醌氫化為相應(yīng)氫醌（醌茜），其然后將H2傳遞給氧。[0149]醌的衍生物是生物學(xué)相關(guān)分子的常見組分（例如維生素K1是葉綠醌）。天然或合成醌顯示生物學(xué)或藥理學(xué)活性，它們中有些顯示抗腫瘤活性，并且具有許多生物學(xué)特性，包括在草藥中一些用途。這些應(yīng)用包括催瀉（sennosdes)、抗微生物（大黃酸-和紅根草鄰醌（saprorthoquinone))、抗腫瘤（大黃素和jugone)、抑制PGE2生物合成（紫草醌(arnebinone)和紫草呋喃醌（arnebifuranone))和抗心血管疾?。ǖ⑼?。[0150]許多天然和人工著色物質(zhì)（染料和顏料）是醌衍生物。它們作為染料的重要性僅次于偶氮染料，特別著重于藍(lán)色。從茜草屬植物提取的茜素2,3-二羥基-9,10-蒽醌）是第一種由煤焦油合成的天然染料。[0151]3.漆酶在紡織工業(yè)中的示例性的用途[0152]本發(fā)明技術(shù)的熱穩(wěn)定的漆酶，具有在較高溫度下提高的活性和降低的pH依賴性，也用于毛染色、粗紗精煉（rovescouring)、毛的防縮處理和染料合成中。[0153]在紡織加工中，本發(fā)明的漆酶可用于改善漂白過程中織物的白度、使染色紡織材料和有色廢液脫色及纖維精煉、毛染色和毛抗氈縮。本發(fā)明技術(shù)的漆酶可用于給之前襯填充填（padded)氫醌的毛織物上色。本發(fā)明技術(shù)的漆酶可用于毛染色。染色浴可以用染料前體（2,5-苯二胺-磺酸）、染料調(diào)節(jié)劑（兒茶酚和間二苯酚）和漆酶制備，不含任何染色助劑。[0154]本發(fā)明技術(shù)的漆酶可用于粗紗處理以改善紗線均勻度（yarnregularity)。在粗紗精練中使用漆酶的優(yōu)點(diǎn)是該過程是在溫和的反應(yīng)條件下進(jìn)行的，因此是一種生態(tài)友好的方法。[0155]本發(fā)明技術(shù)的漆酶可通過氧化偶合3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙（MBTH)和苯酚形成紅色偶氮染料。在雙相氫-有機(jī)介質(zhì)中漆酶氧化阿魏酸導(dǎo)致生成穩(wěn)定的黃色產(chǎn)物。[0156]a?牛仔布整理（Denimfinishing)[0157]在織物整理工業(yè)中，靛藍(lán)的酶促降解在石洗方法和用于處理染料廢水中都具有潛能。一些步驟參與染色和最后石洗之間的牛仔服裝制造，其中從織物清除過量的靛藍(lán)并用廢水排出。通過用次氯酸鈉處理，接著中和和漂洗步驟部分地漂白織物，這都會(huì)引起大量的環(huán)境污染。本發(fā)明技術(shù)的酶組合物，例如具有漆酶酶，用于牛仔布整理中。[0158]b.棉生物漂白[0159]棉漂白的目的是使天然顏料脫色，并賦予纖維純白色的外觀。主要是類黃酮決定著棉花顏色。最常見的工業(yè)漂白劑是過氧化氫。然而，漂白劑與纖維的游離基反應(yīng)可導(dǎo)致聚合度降低，因此造成其嚴(yán)重破壞。而且，需要巨大量的水從織物除去過氧化氫，其可造成染色的問題。因此，通過酶催化漂白體系代替過氧化氫不僅由于纖維損傷較少而產(chǎn)生較好產(chǎn)品質(zhì)量，而且實(shí)際上節(jié)約了除去過氧化氫所需的洗滌水。[0160]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物用于提高棉纖維的漂白效應(yīng)。例如，據(jù)報(bào)道通過使用低濃度的漆酶可提高棉織物的漂白效應(yīng)。而且，包含漆酶的本發(fā)明技術(shù)的組合物由于氧化類黃酮可改善棉的白度。例如，研究表明來自T.hirsuta的新分離的菌株的漆酶很可能由于氧化類黃酮而決定著棉的白度改善。另外，足夠提高織物白度的酶催化預(yù)處理的時(shí)間短使該生物方法適用于連續(xù)操作。[0161]J.使用纖維素酶的應(yīng)用[0162]1.纖維素酶用于農(nóng)業(yè)中[0163]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)。植物病原菌和疾病控制；植物和真菌原生質(zhì)體的產(chǎn)生；提高種子發(fā)芽和改善根系；提高植物生長和開花；改善土壤質(zhì)量；減少對(duì)無機(jī)肥料的依賴性。[0164]2?纖維素酶用于生物轉(zhuǎn)化中[0165]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可以用于生物轉(zhuǎn)化。例如，纖維素材料轉(zhuǎn)化為乙醇、其它溶劑、有機(jī)酸和單細(xì)胞蛋白、及脂質(zhì)；生產(chǎn)高能動(dòng)物飼料；改善動(dòng)物飼料的營養(yǎng)質(zhì)量；改善反芻動(dòng)物性能；改善飼料的消化和吸收；高品質(zhì)飼料的保存。[0166]3.纖維素酶用于紡織工業(yè)中[0167]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可應(yīng)用于紡織工業(yè)。例如，牛仔布的生物磨石（bio-stoning);織物纖維的生物拋光；改善織物質(zhì)量；改善纖維的吸光性質(zhì)；服裝的軟化；提高纖維素織物的穩(wěn)定性；從織物清除過量的染料；恢復(fù)顏色亮度。[0168]4.使用纖維素酶的其它應(yīng)用[0169]在一些實(shí)施方案中，其中所述酶為纖維素酶的本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可以用于下述的一種：改善類胡蘿卜素提取；改善氧化和類胡蘿卜素的色穩(wěn)定性；改善橄欖油提??；改善橄欖醬的攪拌（malaxation);改善橄欖油的質(zhì)量；減少生物質(zhì)浪費(fèi)的風(fēng)險(xiǎn)；產(chǎn)生雜交分子；設(shè)計(jì)型纖維素體的產(chǎn)生。[0170]K.使用木聚糖酶的示例性應(yīng)用[0171]在本發(fā)明技術(shù)的一些實(shí)施方案中，使用包含木聚糖酶的組合物。示例性的用途包括，但不限于木漿的生物浸取、處理動(dòng)物飼料以提高可消化性、加工食品以提高澄清化和將木質(zhì)纖維材料轉(zhuǎn)化為原料和燃料。[0172]1.生物浸取[0173]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物可應(yīng)用于生物浸提。將化學(xué)紙漿常規(guī)漂白為較高亮度而不完全除去木質(zhì)素還沒有成功。常規(guī)地，氯用于漂白。因此，包含木聚糖酶的本發(fā)明技術(shù)的組合物用于生物漂白。[0174]2.使用木聚糖酶的其它示例性的應(yīng)用[0175]其中包含木聚糖酶的本發(fā)明的酶技術(shù)用于的其它區(qū)域包括，但不限于用作家禽食物添加劑，用于改善焙烤產(chǎn)品的面團(tuán)處理和質(zhì)量的小麥粉中，用于提取咖啡、植物油和淀粉，用于改善青貯飼料和谷物飼料的營養(yǎng)性質(zhì)，與果膠酶和纖維素酶組合物一起用于果汁的澄清化和使植物纖維來源比如亞麻、大麻、黃麻和苧麻脫膠。[0176]L.使用果膠酶的示例性的應(yīng)用[0177]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷果膠酶酶組合物用于水果和織物工業(yè)。本發(fā)明技術(shù)的嗜冷果膠酶酶組合物將植物組織的復(fù)合多糖分解成更簡單的分子如半乳糖醛酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷酸性果膠酶酶組合物用于降低果汁的濁度和苦味。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嗜冷酸性果膠酶酶組合物在紡織工業(yè)中用于浸漬纖維作物和使其脫膠、優(yōu)質(zhì)紙的生產(chǎn)、咖啡和茶的發(fā)酵、油的提取和含果膠廢水的處理。[0178]果膠酸裂解酶是一種堿性酶。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的嗜冷果膠酸裂解酶酶組合物用于使纖維作物脫膠和浸漬及預(yù)處理來自果汁工業(yè)的含果膠廢水。通常，這些酶主要來自細(xì)菌來源。在工業(yè)部門中，本【
發(fā)明內(nèi)容】的嗜冷堿性果膠酶組合物，主要來自芽胞桿菌屬，用于下述目的。[0179]1?浸漬纖維作物和使其脫膠[0180]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物用于纖維作物的浸漬和使其脫膠。例如，果膠分解酶參與黃麻、亞麻、大麻、芒麻、洋麻（Hibiscussativa)和來自椰子皮的椰殼纖維的浸漬和使其脫膠。浸漬是其中一些細(xì)菌（例如，梭菌屬、芽胞桿菌屬）和一些真菌(例如，曲霉屬、青霉屬）分解樹皮的果膠和釋放纖維的發(fā)酵過程。[0181]苧麻纖維是一種優(yōu)良的天然織物，但是剝皮的苧麻纖維含有20±35%的苧麻膠，其主要由果膠和半纖維素組成；因此，必須使纖維脫膠以滿足織物的要求。[0182]2.油提取[0183]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明技術(shù)的酶組合物用于油提取。來自油菜籽（canola)、椰子芽、向日葵籽、棕櫚、果仁和橄欖的油傳統(tǒng)上是用有機(jī)溶劑提取制備的。最通常使用的溶劑是己烷，其是一種潛在致癌物。細(xì)胞壁降解酶（包含果膠酶）可以通過液化含油作物的結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁組分以水性方法提取植物油。[0184]實(shí)施例[0185]通過下述實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明技術(shù)，其不應(yīng)當(dāng)被看作是以任何方式的限制。[0186]實(shí)施例1.從土壤中分離分泌工業(yè)酶的細(xì)菌[0187]酶的分離[0188]分泌細(xì)菌的果膠酶、漆酶、纖維素酶和木聚糖酶分離自喜瑪拉雅山的森林土壤，其見于海撥3800米。[0189]通過"釕紅"方法分離果膠分解細(xì)菌菌株。在該方法中，在YP瓊脂板上形成幾個(gè)細(xì)菌菌落。將YP板用釕紅溶液浸沒（flooded)。顯示光環(huán)的那些菌落被鑒別為果膠分解菌株。[0190]通過"丁香醛連氮"方法分離分泌漆酶的菌株。在Luria-Agar(LA)板上形成菌落，將其用丁香醛連氮溶液浸沒。形成紫色染色的那些菌落鑒別為分泌漆酶的細(xì)菌。[0191]通過"剛果紅"方法分離分泌木聚糖酶的菌株。在木聚糖-瓊脂板上培養(yǎng)菌落。將在木聚糖-瓊脂板上形成的菌落用剛果紅溶液浸沒。形成光環(huán)的那些菌落被鑒別為分泌木聚糖酶的細(xì)菌。[0192]通過"剛果紅"方法分離分解纖維素的細(xì)菌菌株。在CMC-瓊脂板上培養(yǎng)菌落。將在CMC-瓊脂板上形成的菌落用剛果紅溶液浸沒。形成光環(huán)的那些菌落被鑒別為分泌纖維素酶的細(xì)菌。[0193]在20°C下孵育每種細(xì)菌培養(yǎng)。[0194]酶的部分純化[0195]通過兩個(gè)連續(xù)的過程部分純化果膠酶。首先，且主要地，通過離子交換色譜法(CMSepharose?;Sigma-Aldrich)，然后接著是凝膠過濾色譜法（Sephadex?G-75;Sigma-Aldrich)〇[0196]通過三個(gè)連續(xù)過程部分純化漆酶。首先，且主要地，通過30-80%的硫酸銨切割法，接著是離子交換色譜法（CMSe_pharose?;Sigma-Aldrich)，最后通過凝膠過濾色譜法(Sephadex?G-75;Sigma-Aldrich)。[0197]通過兩個(gè)連續(xù)過程部分純化纖維素酶。首先，且主要地，通過離子交換色譜法（DEAE纖維素；Sigma-Aldrich)，然后接著是凝膠過濾色譜法（Sephadex?G-100;Sigma-Aldrich)〇[0198]通過兩個(gè)連續(xù)過程部分純化木聚糖酶。首先，且主要地，通過離子交換色譜法(CMSepharose?;Sigma-Aldrich)，然后接著是凝膠過濾色譜法（Sephadex?G-50;Sigma-Aldrich)〇[0199]實(shí)施例2.酶活件的測量[0200]通過TBA方法，在20°C下，在25mM的tris-Cl緩沖液（pH-8.5)中，用聚半乳糖酸(PGA)孵育純化的果膠酶2小時(shí)。在培養(yǎng)酶底物復(fù)合物兩小時(shí)之后，在550nm下測量紅色形成。[0201]通過測量在525nm的吸光度的丁香醛連氮測定來測定漆酶活性。將約1ml的漆酶加入到3ml的25mMtris-Cl緩沖液Ph:8.5中，然后加入2ml的底物丁香醛連氮溶液（在甲醇中，用二卩惡燒以1:2稀釋）以使總測定系統(tǒng)（totalassaysystem)為5ml。在20°C下進(jìn)行丁香醛連氮測定。[0001]通過二硝基水楊酸法進(jìn)行纖維素酶測定。將lml的培養(yǎng)物濾液放入試管中，并用蒸餾水稀釋至2ml。使用pH7.5的Tris-Cl緩沖液與作為底物的CMC。接著，將3ml的DNS試劑加入到制備的培養(yǎng)物濾液中。在沸水浴中加熱試驗(yàn)管中內(nèi)含物5分鐘。加熱后，將該內(nèi)含物在室溫下冷卻。在冷卻時(shí)，加入7ml新制備的40%酒石酸鉀鈉溶液。冷卻后，在U.V.分光光度計(jì)中于510nm處讀取樣品。使用葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)圖測定還原糖的量。[0202]使用1%樺木木聚糖溶液作為底物測定木聚糖酶活性，并通過二硝基水楊酸法測定所釋放的還原糖的量。使用PH8.0的Tris-Cl緩沖液進(jìn)行該測定。一單位的酶活性定義為在給定條件下每分鐘產(chǎn)生的ImM木糖當(dāng)量。在U.V.分光光度計(jì)中于410nm處讀數(shù)樣品。[0203]實(shí)施例3.用納米顆粒處理嗜冷酶的效果[0204]方法和材料[0205]Cu20納米顆粒（Cu20NP)和輕磷灰石納米顆粒（HApNP)購自Sigma-Aldrich(登記號(hào)分別為No:678945,702153)。[0206]對(duì)于果膠酶和漆酶、木聚糖酶、和纖維素酶，使用的緩沖液分別為pH8.5、pH8、pH7.5的Tris-Cl。[0207]將各種酶與如下納米顆?；旌希簩?duì)于果膠酶、纖維素酶和木聚糖酶使用HApNP，并且對(duì)于漆酶使用Cu20NP。將果膠酸裂解酶、纖維素酶和木聚糖酶分別與8.8yg/ml、llyg/ml和6.6iig/ml的HApNP混合。將漆酶與0.ImM的Cu20NP混合。[0208]在預(yù)培養(yǎng)之前，通過在室溫下渦旋約2至3秒混合納米顆粒和所述酶。[0209]每種樣品的總反應(yīng)體積（酶、緩沖液、底物和納米顆粒）為1ml。[0210]根據(jù)實(shí)施例2中詳述的方案測定酶活性。[0211]在如表1詳述的初始預(yù)培養(yǎng)之后，在20°C下進(jìn)行每個(gè)酶系統(tǒng)的測定。果膠酶的培養(yǎng)時(shí)間為2小時(shí)，漆酶的培養(yǎng)時(shí)間為5分鐘，木聚糖酶的培養(yǎng)時(shí)間為30分鐘，纖維素酶的培養(yǎng)時(shí)間為20分鐘。[0212]【權(quán)利要求】1.組合物，包含：至少一種納米顆粒；和至少一種與所述納米顆粒相接觸的嗜冷酶，其中所述嗜冷酶與具有比對(duì)照對(duì)照嗜冷酶相比較具有提高的活性。2.-種制備酶組合物的方法，所述方法包括：使將至少一種納米顆粒和與至少一種嗜冷酶相接觸，其中用所述嗜冷酶與所述納米顆粒相接觸所述嗜冷酶，和并且其中所述嗜冷酶與具有比對(duì)照嗜冷酶相比較具有提高的活性。3.-種處理底物的方法，所述方法包括：將底物與用包含以下述的組合物相接觸底物：至少一種納米顆粒，和至少一種與所述納米顆粒相接觸的嗜冷酶，其中所述嗜冷酶與具有比對(duì)照嗜冷酶相比較具有提1?的活性。4.一種用于從脫粒的玉米芯或脫粒的玉米芯廢料廢物中產(chǎn)生制備還原糖和葡萄糖的方法，所述方法包括：在存在多個(gè)納米顆粒的情況下，通過將使脫粒的玉米芯和蛋白酶組合物相接觸形成混合物；在約45°C至約90°C下培養(yǎng)孵育該混合物以，產(chǎn)生大量游離的氨基酸；和在存在大量多個(gè)納米顆粒存在的情況下，向所述經(jīng)孵育培養(yǎng)的混合物中加入添加調(diào)合物，以制備產(chǎn)生還原糖和葡萄糖，其中所述調(diào)合物包括大量多個(gè)與納米顆粒相接觸的嗜冷酶，其中嗜冷酶與具有比對(duì)照嗜冷酶相比較具有提高的活性。5.如權(quán)利要求1所述的組合物，或權(quán)利要求2、3或4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嗜冷酶包括漆酶、果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶或其組合中的一種或多種。6.如權(quán)利要求1所述的組合物、或權(quán)利要求2、3或4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嗜冷酶具有以下特征中的一個(gè)或多個(gè)下述特征：：(a)與對(duì)照嗜冷酶相比較，在約2°C至約10°C的溫度下提高的活性；(b)與對(duì)照嗜冷酶相比較，在約4°C的溫度下提高的活性；(c)與對(duì)照嗜冷酶相比較，在約2至約6的pH下提高的活性；⑷與對(duì)照嗜冷酶相比較，在約8至約11的pH下提高的活性；(e)與對(duì)照嗜冷酶相比較，增加的半衰期；和(f)與對(duì)照嗜冷酶相比較，所述組合物中的嗜冷酶是更嗜冷穩(wěn)定的（psychrostable)。7.如權(quán)利要求1所述的組合物或權(quán)利要求2、3或4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述納米顆粒不與所述嗜冷酶結(jié)合相連接。8.如權(quán)利要求1所述的組合物或權(quán)利要求2、3或4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述納米顆粒包括氧化亞銅納米顆粒、羥磷灰石納米顆粒、氯化鎂、氯化錳、氯化鈣、鋅、鎂、錳、或其組合中的一種或多種。9.如權(quán)利要求1所述的組合物或權(quán)利要求2、3或4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嗜冷酶包括漆酶、果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶或其組合中的一種或多種。10.如權(quán)利要求1所述的組合物或權(quán)利要求2、3或4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嗜冷酶包括重組酶?！疚臋n編號(hào)】C12P19/14GK104342407SQ201410392448【公開日】2015年2月11日申請(qǐng)日期:2014年8月11日優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日【發(fā)明者】A·穆霍帕德亞,N·杜塔,K·查克拉博蒂,A·K·達(dá)斯古普塔申請(qǐng)人:加爾各答大學(xué)