一株防治立枯病的枯草芽孢桿菌dppg-26及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株防治苗期立枯病的枯草芽孢桿菌DPPG-26，所述菌種的保藏號(hào)為CGMCC No.9393。該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，具有廣譜抑菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，并能在真菌性病原菌絲體表面繁衍定殖，有效抑制病菌生長(zhǎng)，控制病害發(fā)生。菌株DPPG-26發(fā)酵原液抑菌效價(jià)為213.3 U1，經(jīng)硫酸銨逐級(jí)鹽析結(jié)合離子交換層析分析其抑菌物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。另外，該菌能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，能夠很好的抑制病原菌立枯絲核菌菌絲的延伸，能夠有效的防治加工番茄立枯病發(fā)生。本發(fā)明的發(fā)酵菌液其處理過(guò)的植株株高、鮮重和干重分別增加了23.81％、42.57％和30.38％，防治效果為58.62％，能有效增加植株的營(yíng)養(yǎng)體生物量。本發(fā)明的菌株培養(yǎng)條簡(jiǎn)單，易保存，對(duì)環(huán)境友好，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。
CGMCC No9393
20140630
【專(zhuān)利說(shuō)明】一株防治立枯病的枯草芽孢桿菌DPPG-26及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體的，本發(fā)明涉及一株防治立枯病的枯草芽 孢桿菌DPPG-26及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 加工番茄是新疆主要的經(jīng)濟(jì)作物。新疆加工番茄種植面積達(dá)一百多萬(wàn)畝，番茄年 生產(chǎn)總值占全國(guó)的90%，番茄產(chǎn)業(yè)經(jīng)過(guò)15年的發(fā)展，已經(jīng)形成產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)，年出口 量占全國(guó)市場(chǎng)份額的70%，有番茄醬生產(chǎn)廠40余家，建成番茄醬加工生產(chǎn)線151條，年加工 能力已達(dá)到80萬(wàn)噸，加工裝備能力占全國(guó)加工總能力的90%。但加工番茄苗期立枯病發(fā)生 嚴(yán)重，直接影響到新疆加工番茄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。因此，找到適合新疆本土土壤和氣候 條件并能夠結(jié)合新疆栽培模式使用的生物農(nóng)藥受到更多關(guān)注。
[0003] 立枯絲核病菌Rhizictonia solani Kuhn，是一種土壤習(xí)居菌，可寄生180多科、 上千種植物，棉花及番茄幼苗出土至定植前均可受害。低溫高濕的條件十分有利于該病 的發(fā)生，由于新疆春季較寒冷，作物播種后通常會(huì)發(fā)生倒春寒和陰雨天氣，常引起苗期立 枯病大發(fā)生，為害嚴(yán)重。由Rhizictonia solani Kuhn引起的棉苗爛根病一般發(fā)病率為 27% -75%，嚴(yán)重的達(dá)90%以上，有時(shí)由于爛種死苗較多，造成缺苗斷壟，大大影響植株生 長(zhǎng)。一般加工番茄苗期立枯病的發(fā)病率為10-20%，有些年份可達(dá)50%以上，嚴(yán)重年份甚至 可造成作物毀種重播。近年來(lái)，隨著滴灌措施的實(shí)施和常年連作，該病發(fā)生率還有逐年上升 的趨勢(shì)。
[0004] 由立枯絲核菌（Rhizictonia solani)引起的苗期立枯病是一類(lèi)分布廣、危害重、 難防治的土傳病害，在病害防治方面，由于化學(xué)農(nóng)藥存在污染環(huán)境，易造成農(nóng)藥殘留，破壞 生態(tài)平衡等問(wèn)題，而選育和推廣抗性品種由于要考慮病原菌復(fù)雜的致病型，因此難以取得 很大的突破。針對(duì)這種情況，人們逐漸地將目光轉(zhuǎn)向從自然界中篩選和開(kāi)發(fā)防治立枯病的 高效生防菌劑。芽孢桿菌作為一種良好的研究材料一直倍受矚目。國(guó)內(nèi)外篩選到的許多生 防有效菌株都是該屬的成員。
[0005] 目前國(guó)外利用枯草芽抱桿菌防治由Rhizoctonia solan，Pvthium spp.，F(xiàn)usarium spp?和Botryadiplodia solani-tuberosi引起的病害，取得較好的效果。美國(guó)已有4 株枯草芽孢桿菌生防菌株獲得環(huán)保局（EPA)商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可，它們是 GB03，MBI600，QST713 和 FZB24。美國(guó) Gustafson 公司和 MierobioLtd?公司開(kāi)發(fā)的 GB03 和 MB1600, GB03 和 MB1600 用于拌種或根施可防治 Fusarium、Aspergillus、Altrernaria 和Rhizoctonia引起的棉花、豆類(lèi)、麥類(lèi)和花生根部病害；菌株FZB24用于溫室或室內(nèi)栽培 樹(shù)苗和灌木根部可防治Fusarium和Rhizoctonia引起的根腐病和枯萎病；菌株QSI713能 防治蔬菜、櫻桃、葡萄、葫蘆和胡桃的細(xì)菌和真菌病害。日本東京技術(shù)研究所的Bacillus subtills RB14 和 Bacillus subtilis NB22 分別對(duì) Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum 和 Pseudomonas solanacearum 引起的番爺病害有良好的防效（Asaka 0，Shoda M. Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-〇ff of tomato with Bacillus subtilis RB14[J].Appl Environ Microbiol，1996,62(11) :4081-4085.)。很多優(yōu)良的枯草芽孢桿菌 菌株已經(jīng)應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。
[0006] 我國(guó)利用枯草芽孢桿菌防治植物病害的應(yīng)用研究也達(dá)到了世界先進(jìn)水平。江蘇農(nóng) 業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所的B916菌株對(duì)多種病原真菌和水稻白葉枯病菌都有顯著抑制作 用，對(duì)水稻紋枯病田間防效達(dá)50-81%，與井崗霉素按一定比例混合后可提高防病效果。目 前已進(jìn)行農(nóng)藥登記，年使用面積達(dá)67000公頃。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生防菌B3對(duì)小麥紋枯病田間 防效達(dá)50-80%，增產(chǎn)達(dá)5. 6-20. 2%。萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院BL03和XM16菌株對(duì)蘋(píng)果霉心病和棉花炭 疽病田間防效達(dá)90%。B. subtilis S9和生防菌綠色木霉、毛殼菌可以混合使用，提高防病 效果（林福呈，李德葆.枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis S9對(duì)植物病原真菌的溶菌作用 [J] ?植物病理學(xué)報(bào)，2003,33⑵：174-177)，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)了生防制劑產(chǎn)品威綠達(dá)（VIRIDA)，在 浙江省蔬菜作物中使用累計(jì)推廣面積達(dá)到333公頃。B. subtilis S0113對(duì)水稻白葉枯病菌 (Xan thomonas Oryzae pv. Orzae)具有強(qiáng)烈的抑菌作用（林東，徐慶，劉憶舟，等.枯草芽 孢桿菌S0113分泌蛋白的抑菌作用及抑菌蛋白的分離純化[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001， 9(1) :77-80.)。
[0007] 然而，生物農(nóng)藥能夠?qū)ν寥乐械倪@些病原物產(chǎn)生一定抑制作用從而起到防病功 能，但土壤中存在的大量微生物也能影響生物農(nóng)藥中的主要成分活性微生物的存活從而影 響其防病效能，防治作物土傳病害的微生物農(nóng)藥存在很強(qiáng)的地域適應(yīng)性，而且，不同的氣候 條件和土壤性質(zhì)都影響了功能微生物的生防效應(yīng)的發(fā)揮。因此許多在其它地方具有很好防 病效能的微生物農(nóng)藥，到了新疆很多時(shí)候表現(xiàn)不穩(wěn)定。
[0008] 這就迫切需要利用從新疆本地篩選出的適合本土的高效防病微生物，開(kāi)發(fā)適宜于 新疆特殊地理氣候條件下使用的新的生物農(nóng)藥，不但可以很好地控制以加工番茄和棉花為 主的經(jīng)濟(jì)作物上的土傳病害的發(fā)生，還會(huì)保證新疆農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展，同時(shí)將會(huì)取得 良好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種適宜于新疆特殊地理氣候環(huán)境下能夠很好地控制以加 工番茄為主的經(jīng)濟(jì)作物的立枯病病害發(fā)生的防病促生菌株及其用途。
[0010] 本發(fā)明所述的DPPG-26菌為枯草芽孢桿菌，保藏日期：2014年6月30日，保藏單位 名稱(chēng)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏號(hào)：CGMCC No. 9393， 保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。其特點(diǎn)在于該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，該菌能產(chǎn) 生抑菌蛋白和幾丁質(zhì)酶，具有廣譜抑菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，并能在真菌性病原菌絲體 表面繁衍定殖，有效抑制病菌生長(zhǎng)，能夠有效的防治加工番茄早春苗期立枯病害的發(fā)生，為 提商加工番爺?shù)钠焚|(zhì)和廣量提供技術(shù)支持。
[0011] 具體內(nèi)容如下：
[0012] 在本發(fā)明中，首先從新疆特殊環(huán)境中分離篩選獲得抑制立枯病菌生長(zhǎng)的生防菌 DPPG-26菌株。經(jīng)過(guò)生理生化試驗(yàn)鑒定：菌株DPPG-26經(jīng)革蘭氏染色和芽孢染色后鏡檢，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌經(jīng)芽孢染色后可以看見(jiàn)紅色短桿狀的菌體中間有綠色芽孢，形狀近似橢圓 形，經(jīng)革蘭氏染色后均呈藍(lán)紫色，K0H實(shí)驗(yàn)沒(méi)有絲狀物拉出，為革蘭氏陽(yáng)性菌。菌株的16S rDNA鑒定表明，基因測(cè)序獲得的菌株DPPG-26的16S rDNA序列片段大小為1546bp，在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析，結(jié)合生理生化特征的鑒定結(jié)果，DPPG-26為枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)〇
[0013] 將活化的DPPG-26接種到BPY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基初始pH值為6. 0,裝液量為250mL 三角瓶裝液50mL，接種量為5%，在溫度30°C的搖床中培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)速為180r/min，獲得活菌 數(shù)為 109-10ncfu/mL。
[0014] 采用本發(fā)明的發(fā)酵菌液浸種加工番茄種子和苗期菌液灌根接種處理后，能明顯增 加工番茄種子的發(fā)芽率、出苗率及幼苗的鮮重和干重，進(jìn)一步說(shuō)明該菌株具有一定的防病 促生作用。
[0015] 具體技術(shù)措施是將DPPG-26菌株的發(fā)酵液（109--10nCfu/mL)浸泡加工番茄種子 和苗期菌液灌根接種處理1次，并設(shè)3個(gè)對(duì)照（(? :滅菌培養(yǎng)液浸種，土壤接種絲核菌；CK2 : 滅菌培養(yǎng)液浸種，土壤為滅菌土；CK3 :用種子重量0. 8%的化學(xué)農(nóng)藥PCNB拌種，土壤接種絲 核菌）。調(diào)查出苗率和發(fā)病情況。采用本發(fā)明的發(fā)酵菌液灌根處理加工番茄種子，對(duì)加工 番茄早春苗期立枯病具有較好的防治效果，其防治效果為58. 62%，而PCNB的防治效果為 12. 62%。對(duì)各處理的干重和鮮重進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明本發(fā)明的發(fā)酵菌液其處理過(guò)的其處 理過(guò)的植株株高、鮮重和干重分別增加了 23. 81 %、42. 57%和30. 38%，能有效增加植株的 營(yíng)養(yǎng)體生物量。
[0016] 通過(guò)對(duì)本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行硫酸銨分級(jí)鹽析、水合茚三酮反應(yīng)表明本發(fā)明的發(fā) 酵菌生長(zhǎng)的過(guò)程中主要產(chǎn)生了蛋白類(lèi)的抗菌物質(zhì)。該抑菌蛋白除了對(duì)加工番茄立枯病菌有 較高的抑菌活性外，對(duì)茄菌核、番茄早疫病菌、西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌也有較好的抑 制作用，對(duì)病原細(xì)菌西瓜細(xì)菌性果斑病菌也有一定的抑菌效果。
[0017] 所述的防病菌株為枯草芽抱桿菌，菌株發(fā)酵原液抑菌效價(jià)為213. 3?，該菌能產(chǎn)生 幾丁質(zhì)酶，能夠很好的抑制病原菌立枯絲核菌菌絲的延伸，能夠有效的防治加工番茄立枯 病的發(fā)生。
[0018] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0019] 本發(fā)明提供了 一種適宜于新疆特殊地理氣候條件應(yīng)用的防病促生菌株 DPPG-26 (CGMCC No. 9393)，防病能力強(qiáng)、應(yīng)用效果穩(wěn)定。特別是可以很好地控制以加工番茄 為主的經(jīng)濟(jì)作物的立枯絲核菌發(fā)病的生防菌株，具有較強(qiáng)潛力開(kāi)發(fā)適宜于新疆特殊地理氣 候條件下使用的新型生物農(nóng)藥。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1 :不同培養(yǎng)基對(duì)DPPG-26生長(zhǎng)的影響
[0021] 圖2 :DPPG-26抑菌粗蛋白的DEAE-s印harose離子交換色譜圖
[0022] 圖3 :純化后幾丁質(zhì)酶平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)
[0023] 圖4 :純化后幾丁質(zhì)酶抑菌顯微觀察

【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定 性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025] 實(shí)施例1防病促生菌DPPG-26的鑒定
[0026] 將活化的DPPG-26接種到BPY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基初始pH值為6. 0,裝液量為250mL 三角瓶裝液50mL，接種量為5%，在溫度30°C的搖床中培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)速為180r/min。
[0027] 根據(jù)菌體形態(tài)特征、菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果，結(jié)合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》 (Bergey' s Manual of etermitive Bacteriology)第八版和《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生 理生化特性的鑒定。以及芽孢桿菌的16S rDNA鑒定。
[0028] 經(jīng)過(guò)生理生化試驗(yàn)鑒定：菌株DPPG-26為紅色短桿狀的菌體中間有綠色芽孢，形 狀近似橢圓形，經(jīng)革蘭氏染色后均呈藍(lán)紫色，K0H實(shí)驗(yàn)沒(méi)有絲狀物拉出，為革蘭氏陽(yáng)性菌。
[0029] 表1菌株DPPG-26的生理生化特性
[0030]

【權(quán)利要求】
1. 一株防治立枯病的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)DPPG-26菌株，該菌株已在 國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2014年6月30日，保藏單位名稱(chēng)：中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏號(hào)：CGMCC No. 9393。
2. 權(quán)利要求1所述菌株，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌DPPG-26由新疆特殊環(huán)境中 分離篩選獲得，在BPY培養(yǎng)基上，30°C條件下培養(yǎng)48h。在培養(yǎng)基上呈乳白色，近似橢圓形， 中央突起，無(wú)熒光。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述菌株，其特征在于所述的BPY培養(yǎng)基是由下列成分組成：蛋白 胨10. 0g，酵母浸膏5. 0g，牛肉浸膏5. 0g，NaC15. 0g，葡萄糖5. 0g，蒸餾水1000mL，pH7. 0。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述菌株，其特征在于該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，具有廣譜抑菌活性和 極強(qiáng)的抗逆能力，并能在真菌性病原菌絲體表面繁衍定殖，有效抑制病菌生長(zhǎng)，控制病害發(fā) 生。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述菌株，其特征在于所述的目標(biāo)病原真菌是病原真菌：瓜果腐 霉（Pythium aphanidermatum)、立枯絲核病菌（Rhizoctonia solani)、番爺枯萎病菌 (Fusarium oxysporumf. sp. lycopersici)、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici)、番爺 早疫病菌（Alternaria solani)、菌核病菌（Sclerotiniasclerotioum) 〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述菌株，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌DPPG-26產(chǎn)幾丁質(zhì)酶，能 夠有效的抑制病原菌新生菌絲的合成，具有抑菌作用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述菌株，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌DPPG-26,經(jīng)硫酸銨逐級(jí) 鹽析結(jié)合離子交換層析分析其抑菌物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述菌株，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌DPPG-26的發(fā)酵液 其處理過(guò)的植株株高、鮮重和干重分別增加了 23. 81 %、42. 57%和30. 38%，防治效果為 58. 62%，提高棉花種子的出苗率和發(fā)芽率，且促進(jìn)了棉苗的生長(zhǎng)。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104450551SQ201410386872
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月3日
【發(fā)明者】武占省, 凃亮, 李春, 何艷慧, 樊艷爽 申請(qǐng)人:石河子大學(xué), 北京理工大學(xué)