一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括下述步驟：步驟1，農(nóng)桿菌菌種的活化培養(yǎng)；步驟2，山葵無菌苗的獲得；步驟3，山葵子葉的預(yù)培養(yǎng)；步驟4，山葵子葉的遺傳轉(zhuǎn)化；步驟5，山葵毛狀根的快速增殖。其由發(fā)根農(nóng)桿菌成功誘導(dǎo)山葵子葉實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了大量含有次生代謝產(chǎn)物、生長迅速、遺傳穩(wěn)定和能快速生長的毛狀根。
【專利說明】一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及山葵遺傳轉(zhuǎn)化【技術(shù)領(lǐng)域】，特別公開一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn) 化方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 山葵（Wasabi japonica Matsum)又名山箭菜、山菜，為十字花科山箭菜屬多年生 半陰生草本植物。山葵植物中含有一種芥子苷類的物質(zhì)，在植物體被磨碎時，該物質(zhì)在芥子 苷酶的作用下水解形成異硫氰酸酯類化合物，其中尤以丙烯基異硫氰酸酯含量最高，約占 89%?94% ;另外，山葵植物還含有大量的氨基酸和各種人體需要的微量兀素。由于山葵 含有豐富的異硫氰酸酯類化合物和大量的人體需要的氨基酸和微量元素，其不僅具有強烈 的辛辣味和特殊的香辛味，而且還具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗癌、抗氧化、抗血小板聚集等多種 作用，是國際上公認的極為稀缺和珍貴的藥食同源植物，被稱為"綠色黃金"。
[0003] 與其廣泛的應(yīng)用形成鮮明的對比，山葵資源十分有限，這是因為山葵植物的生長 發(fā)育對環(huán)境有極為苛刻的要求，山葵適于在海拔高度為1〇〇〇?2000米、溫度范圍為8? 18 °C的潮濕涼爽的林中小溪生長。山葵生育溫度一旦超過30°C易發(fā)生軟腐病、黑心病、白粉 病和病毒病，其中以軟腐病和黑已病最為嚴重；但低于_3°C時又易受凍害；另外，山葵結(jié)實 率低，種子休眠期長，其栽培地也不能連續(xù)種植；通常一株山葵植物經(jīng)過18個月的栽種，收 獲的根莖平均不到200g。因此，目前僅靠山葵有限的栽種量，是遠不能滿足市場的需求。
[0004] 專利CN1204453A公開了一種山葵種苗的快速繁殖方法，包括：無菌條件下切取 山葵頂芽或根狀莖上的側(cè)芽，通過對培養(yǎng)基的選擇、激素配比、培養(yǎng)條件的改變，進行試管 苗誘導(dǎo)、試管苗的快速增殖培養(yǎng)、試管苗壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、馴化移栽使山葵組培苗的增 殖迅速，其繁殖系數(shù)能達到4. 0-5.0,增殖培養(yǎng)形成的試管苗直接用于生產(chǎn)，省工省力、省 地、速度快、降低生產(chǎn)成本。專利CN102668992A公開了一種山葵組培苗瓶外生根方法，其 利用組織培養(yǎng)誘導(dǎo)山葵莖尖獲得無根試管芽苗，在繼代培養(yǎng)后，將芽苗經(jīng)馴化切成單芽，再 將芽苗插入土壤基質(zhì)中，期間每周澆促根劑及1/2MS營養(yǎng)液一次，插入土壤基質(zhì)30d后可 獲得較好的生根效果。專利CN102823491A公開了一種以山葵根為外植體的山葵愈傷組 織培養(yǎng)方法，包括如下步驟：（1)外植體的處理：取從山葵植株剪下的山葵根，用流水沖洗 干凈后，放于濾紙上吸干表面水分，然后將其放在超凈工作臺上用濃度為0. 1 %?0. 15% 的升萊消毒5?8min，再用無菌水沖洗2?5次后用已滅菌的濾紙吸干表面的水分；（2) 愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)：將已消毒的山葵根切為l_2cm的長度，然后接入愈傷組織培養(yǎng)基 MS+6-BA0. 5 ?4. Omg .1^+2, 4-D-1. 0 ?6. 0-mg ?P+IAAO. 5 ?3. Omg .171 中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為：溫度10?28°C，每天光照4?10小時，光照強度為600?12001x ; (3)愈傷 組織的增殖培養(yǎng)：將步驟（2)制得的愈傷組織轉(zhuǎn)接入愈傷組織增殖培養(yǎng)基1/2MS+6-BA0? 1. Omg · L i+2, 4-D1. 0 ?4. Omg · L i+KTO. 5 ?1. Omg · L k 硫代硫酸納 0· 5 ?4. 0g · L 1 中 進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度10?28°C，每天光照6?12小時、光照強度為800? 15001x ;上述所有培養(yǎng)基的pH值為5. 6?6. 5、蔗糖15?30g · L-1、瓊脂5. 0?6. 0g · L-1。 其通過將山葵根作為外植體接入愈傷組織培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出了有效成分含量 高的山葵愈傷組織。專利CN103053426A公開了一種山葵幼苗培養(yǎng)方法，包括以下步驟：(A) 生根培育：將經(jīng)過滅菌脫毒初代培育的莖尖分生組織轉(zhuǎn)移到不加激素的1/2MS培養(yǎng)基中生 長；⑶移栽煉苗：步驟㈧持續(xù)28?32天后，將其移入到穴盤中；(C)大田種植：步驟⑶ 移栽煉苗75?85天后，將成品山葵幼苗移栽至大田。其采用在增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加 生根劑的方式來代替細胞分裂素，克服了生根較慢、根細長的問題，達到了短期內(nèi)迅速增加 單株苗的根長度的目的。專利CN103718963A公開了一種山葵脫毒苗的培養(yǎng)方法，其選用無 菌的山葵芽體為培養(yǎng)材料，經(jīng)變溫處理后，取其芽分生組織接入?yún)采糠只囵B(yǎng)基中，再經(jīng) 壯苗培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的誘導(dǎo)培養(yǎng)而獲得山葵脫毒苗，所培養(yǎng)的山葵脫毒苗具有生長速 度快、有效組分含量高等優(yōu)點。
[0005] 隨著當前生物技術(shù)的日益發(fā)展和成熟，目前借助發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)植物進 行遺傳轉(zhuǎn)化的研究已成為近些年的研究熱點。這是由于發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物產(chǎn)生的毛狀根 具有生長迅速、遺傳穩(wěn)定以及能在無激素培養(yǎng)基上自主生長的特點，并且它還能夠合成與 原植物含量相當或高于原植物含量的次生代謝產(chǎn)物；同時產(chǎn)生的毛狀根還具有生長成為轉(zhuǎn) 基因再生植株的潛力。然而到目前為止，由發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)山葵植物進行遺傳轉(zhuǎn)化的研究 文章還未見有報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，由發(fā)根農(nóng)桿菌 成功誘導(dǎo)山葵子葉實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了大量含有次生代謝產(chǎn)物、生長迅速、遺傳穩(wěn)定和能 快速生長的毛狀根。
[0007] 本發(fā)明提供一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括下述步驟：
[0008] 步驟1，農(nóng)桿菌菌種的活化培養(yǎng)：將發(fā)根農(nóng)桿菌在YEB固體培養(yǎng)基上劃線后，放在 26?30°C的溫度條件下進行暗培養(yǎng)24?36h后，挑取單菌落接入YEB液體培養(yǎng)基中，并于 25?30°C振蕩培養(yǎng)1?2天后，測得菌液0D_ = 0. 1?0. 3左右即可用于外植體浸染；
[0009] 步驟2,山葵無菌苗的獲得：將山葵種子放在超凈工作臺上，先用75%的酒精消 毒20?40s,再用0. 1 %升萊消毒3?8min,無菌水沖洗2?5次后，剝?nèi)シN皮接種在 MS+6-BA0. 5 ?4mg · L kNAA (或者 IAA) 0· 5 ?2mg · L k 鹿糖 20 ?50g · L k 瓊脂 3. 5 ? 4. 5g · Γ1的培養(yǎng)基上，并在22?28°C，光強1000?20001x,每天光照8?12h的條件下 培養(yǎng)，獲得山葵無菌苗；
[0010] 步驟3,山葵子葉的預(yù)培養(yǎng)：切取山葵無菌苗剛展開l-4d的子葉作為外植體，接種 于預(yù)培養(yǎng)基上，并在18?22°C、無光照條件下進行1?3d的預(yù)培養(yǎng)；
[0011] 步驟4,山葵子葉的遺傳轉(zhuǎn)化：選取預(yù)培養(yǎng)后在山葵子葉切口處產(chǎn)生膨大的外植 體放入步驟（1)活化好的農(nóng)桿菌菌液中浸染1?3分鐘，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸后，并 用無菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液后，再轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基中，在15?22°C的暗培養(yǎng)條件 下進行1?3d的共培養(yǎng)；隨后將其轉(zhuǎn)入含頭孢噻肟鈉的抗生素水中浸泡后，再轉(zhuǎn)入除菌培 養(yǎng)基中進行除菌培養(yǎng)，每隔2?4d轉(zhuǎn)接一次除菌培養(yǎng)基，直到毛狀根大量產(chǎn)生。
[0012] 步驟5,山葵毛狀根的快速增殖：切取長度為1. 5?3cm的毛狀根轉(zhuǎn)接在毛狀根快 速增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0013] 上述步驟（1)中采用的農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌A4或R1000,浸染山葵子葉外植體的 菌液 0D6(i(i = 0· 1 ?0· 3 ;
[0014] 上述步驟（2)中將消毒后的山葵種子剝?nèi)シN皮并接種在MS+6-BA0. 5? 4mg · L kNAA (或者 IAA) 0· 5 ?2mg · L k 鹿糖 20 ?50g · L k 瓊脂 3. 5 ?4. 5g · L 1 的培 養(yǎng)基上，并在22?28°C，光強1000?20001x，每天光照8?12h的條件下培養(yǎng)，獲得山葵 無菌苗；
[0015] 上述步驟⑶中，是選取山葵無菌苗剛展開l-4d的子葉作為外植體；
[0016] 上述步驟⑶中，預(yù)培養(yǎng)基是MS+2,4-Dl?2mg ?P+KTO. 1?0· 5mg ·Ι^+腺嘌呤 10 ?20mg · L k 鹿糖 20 ?50g · L k 瓊脂 5 ?7g · L 1 ;
[0017] 上述步驟（3)中，山葵子葉的預(yù)培養(yǎng)條件是在18?22°C、無光照條件下進行1? 3d的預(yù)培養(yǎng)；
[0018] 上述步驟（4)中是選取預(yù)培養(yǎng)后在山葵子葉切口處產(chǎn)生膨大的外植體放入活化 好的農(nóng)桿菌菌液中浸染1?3分鐘；
[0019] 上述步驟⑷中的共培養(yǎng)基為1/2MS+鄰苯二酚100?200mg · 1^+蔗糖10? 15g · 1^+瓊脂4?5. 5g · Γ1 ;并在15?22°C的暗培養(yǎng)條件下進行1?3d的共培養(yǎng)；
[0020] 上述步驟⑷中，把共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)入含頭孢噻肟鈉200?500mg · Γ1的抗 生素水中浸泡1?3小時后，再轉(zhuǎn)入除菌培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0. 1?0. 5mg · 1^+瓊脂5? 7g 鹿糖15?30g 頭孢噻廂鈉200?400mg 頭孢曲松鈉200?400mg .I71。
[0021] 上述步驟（5)中，毛狀根快速增殖培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0. 1?0· 5mg · 1^+蔗糖 10?20g · 頭孢霉素100?300mg · Γ1的液體培養(yǎng)基上進行毛狀根的快速增殖培養(yǎng)。
[0022] 本發(fā)明的有益效果有：由發(fā)根農(nóng)桿菌成功誘導(dǎo)山葵子葉實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了大 量含有次生代謝產(chǎn)物、生長迅速、遺傳穩(wěn)定和能快速生長的毛狀根，為山葵植物有效組分的 快速生產(chǎn)和獲得轉(zhuǎn)基因再生植株提供了一條的重要途徑。

【具體實施方式】
[0023] 通過下面給出的本發(fā)明的具體實施例和對比例可以進一步清楚地了解本發(fā)明，但 它們不是對本發(fā)明的限定。具體實施例和對比例中沒有詳細敘述的部分是采用現(xiàn)有技術(shù)、 公知技術(shù)手段和行業(yè)標準獲得的。
[0024] 除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分數(shù)均為重量百分數(shù)。
[0025] 實施例1
[0026] 按如下步驟實施以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化：
[0027] (1)菌種的活化培養(yǎng)：
[0028] 將發(fā)根農(nóng)桿菌A4在YEB固體培養(yǎng)基上劃線后，放在28°C的溫度條件下進行暗培 養(yǎng)30h后，挑取單菌落接入YEB液體培養(yǎng)基中，并于28°C振蕩培養(yǎng)2天后，測得菌液0D 6QQ = 0.2左右即可用于外植體浸染。
[0029] (2)無菌苗的獲得：
[0030] 將山葵種子放在超凈工作臺上，先用75%的酒精消毒30s，再用0. 1%升汞消毒 5min，無菌水沖洗4次后，剝?nèi)シN皮接種在MS+6-BA2mg · P+NAA或者IAAlmg · I/1-蔗糖 40g · 1^+瓊脂4g · L-1的培養(yǎng)基上，并在24°C，光強15001x，每天光照10h的條件下培養(yǎng)， 培養(yǎng)1周獲得山葵無菌苗；
[0031] ⑶山葵子葉的預(yù)培養(yǎng)：
[0032] 切取山葵無菌苗上剛展開3d的2片子葉作為外植體，接種于MS+2， 4-D1. 5mg · P+KTO· 3mg · 1^+ 腺嘌呤 15mg · 1^+ 蔗糖 30g · 1^+ 瓊脂 6g · L-1 的預(yù)培養(yǎng)基 上，并在20°C、無光照條件下進行2d的預(yù)培養(yǎng)；
[0033] (4)山葵子葉的遺傳轉(zhuǎn)化：
[0034] 選取預(yù)培養(yǎng)后在山葵子葉切口處產(chǎn)生膨大的外植體，放入菌液0D_ = 0. 2的農(nóng)桿 菌菌液中浸染2分鐘，其間注意搖動，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸后，并用無菌濾紙吸干外 植體表面多余的菌液后，再轉(zhuǎn)入1/2MS+鄰苯二酚lSOmg·!^蔗糖Ug·!^瓊脂4. Sg.L-1 的共培養(yǎng)基中，并在18°C的暗培養(yǎng)條件下進行2d的共培養(yǎng)；隨后將其轉(zhuǎn)入含頭孢噻肟鈉 300mg · I/1的抗生素水中浸泡2小時后，再轉(zhuǎn)入1/2MS+IBA0. 3mg · I/1-瓊脂5. 5g · 1^+鹿 糖20g · 1^+頭孢噻肟鈉300mg · 1^+頭孢曲松鈉300mg · L-1培養(yǎng)基中進行繼續(xù)除菌培養(yǎng)； 每隔3d轉(zhuǎn)接一次除菌培養(yǎng)基，在培養(yǎng)30天后統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為28. 91 %。
[0035] (5)山葵毛狀根的快速增殖：
[0036] 切取長度為2cm的毛狀根轉(zhuǎn)接入1/2MS+IBA0. 3mg · 1^+蔗糖15g · 1^+頭孢霉素 200mg 的液體培養(yǎng)基上進行毛狀根的快速增殖培養(yǎng)；在培養(yǎng)25天后統(tǒng)計毛狀根的增殖 倍數(shù)為4. 58。
[0037] 實施例2
[0038] 該實施例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0039] 步驟⑴中，將浸染山葵子葉外植體的發(fā)根農(nóng)桿菌改用為R1000。在步驟⑷山葵 子葉的除菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天后統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為26. 73%。
[0040] 實施例3
[0041] 該實施例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0042] 步驟⑴中，培養(yǎng)的發(fā)根農(nóng)桿菌Α4菌液濃度0D_ = 0. 1的農(nóng)桿菌菌液浸染山葵子 葉外植體。在步驟（4)山葵子葉的除菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天后統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為21. 71%。
[0043] 步驟⑴中，培養(yǎng)的發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液濃度0D_ = 0. 3的農(nóng)桿菌菌液浸染山葵子 葉外植體。在步驟（4)山葵子葉的除菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天后統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為27. 34%。
[0044] 實施例4
[0045] 該實施例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0046] 步驟⑶中，山葵子葉的預(yù)培養(yǎng)時間改為Id。在步驟⑷山葵子葉的除菌培養(yǎng)基 中培養(yǎng)30天后統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為20. 71 %。
[0047] 步驟⑶中，山葵子葉的預(yù)培養(yǎng)時間改為3d。在步驟⑷山葵子葉的除菌培養(yǎng)基 中培養(yǎng)30天后統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為23. 43%。
[0048] 實施例5
[0049] 該實施例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0050] 在步驟⑶中，選取山葵無菌苗上剛展開Id的子葉作為外植體，改接種于MS+2， 4-Dlmg · P+KTO· 5mg · 1^+ 腺嘌呤 10mg · 1^+ 蔗糖 50g · 1^+ 瓊脂 7g · L-1 的預(yù)培養(yǎng)基中， 在步驟（4)山葵子葉的除菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天后統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為21. 45%。
[0051] 在步驟（3)中，選取山葵無菌苗上剛展開4d的子葉作為外植體，改接種于MS+2， 4-D2mg · P+KTO. lmg · 1^+ 腺嘌呤 20mg · 1^+ 蔗糖 20g · 1^+ 瓊脂 5g · L-1 的預(yù)培養(yǎng)基中， 在步驟（4)山葵子葉的除菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天后統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為24. 15%
[0052] 實施例6
[0053] 該實施例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0054] 在步驟（4)中，選取預(yù)培養(yǎng)后在山葵子葉切口處產(chǎn)生膨大的外植體，放入農(nóng)桿菌 液中浸染時間改為3分鐘，共培養(yǎng)時間改為3天，在步驟（4)山葵子葉在除菌培養(yǎng)基中培養(yǎng) 30天后，統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為21. 31 %。
[0055] 在步驟（4)中，選取預(yù)培養(yǎng)后在山葵子葉切口處產(chǎn)生膨大的外植體，放入農(nóng)桿菌 液中浸染時間改為1分鐘，共培養(yǎng)時間改為1天，在步驟（4)山葵子葉在除菌培養(yǎng)基中培養(yǎng) 30天后，統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為25. 13%。
[0056] 實施例7
[0057] 該實施例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0058] 將步驟（4)中的共培養(yǎng)基改為1/2MS+鄰苯二酚lOOmg · 1^+蔗糖10g · 1^+瓊脂 4g噸4 ;并在15°C的暗培養(yǎng)條件下進行Id的共培養(yǎng)；山葵子葉培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn) 化率為22. 61%。
[0059] 將步驟（4)中的共培養(yǎng)基改為1/2MS+鄰苯二酚200mg · 1^+蔗糖15g · 1^+瓊脂 5. 5g噸4 ;并在15°C的暗培養(yǎng)條件下進行Id的共培養(yǎng)；山葵子葉培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計毛狀根 轉(zhuǎn)化率為19. 87%。
[0060] 實施例8
[0061] 該實施例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0062] 在步驟（4)中的除菌培養(yǎng)基改為1/2MS+IBA0. 5mg ·Ι^+瓊脂5g ·Ι^+蔗糖15g ·Ι^+ 頭孢噻肟鈉400mg · I/1-頭孢曲松鈉200mg · Γ1 ;山葵子葉培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率 為 25. 54%。
[0063] 在步驟（4)中的除菌培養(yǎng)基改為1/2MS+IBA0. lmg ·Ι^+瓊脂7g ·Ι^+蔗糖30g ·Ι^+ 頭孢噻肟鈉200mg · I/1-頭孢曲松鈉400mg · Γ1 ;山葵子葉培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率 為 20. 84%。
[0064] 實施例9
[0065] 該實施例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0066] 在步驟（5)中，山葵毛狀根增殖培養(yǎng)基改為1/2MS+IBA0. lmg · 1^+蔗糖10g · 1^+ 頭孢霉素 l〇〇mg · L'在培養(yǎng)25天后統(tǒng)計毛狀根的增殖倍數(shù)為3. 42。
[0067] 實施例10
[0068] 該實施例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0069] 在步驟（5)中，山葵毛狀根增殖培養(yǎng)基改為1/2MS+IBA0. 5mg · 1^+蔗糖10g · 1^+ 頭孢霉素300mg · L'在培養(yǎng)25天后統(tǒng)計毛狀根的增殖倍數(shù)為3. 89。
[0070] 在步驟（5)中，山葵毛狀根增殖培養(yǎng)基改為1/2MS+IBA0. lmg · 1^+蔗糖20g · 1^+ 頭孢霉素 l〇〇mg · L'在培養(yǎng)25天后統(tǒng)計毛狀根的增殖倍數(shù)為3. 27。
[0071] 對比例1
[0072] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0073] 步驟（1)中，將浸染山葵子葉外植體的發(fā)根農(nóng)桿菌改用為Ril5734。在步驟（4)山 葵子葉的除菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天后統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為Ο%。
[0074] 對比例2
[0075] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0076] 步驟⑴中，將Α4菌液濃度改用0D_ = 0. 6浸染山葵子葉外植體。在步驟⑷培 養(yǎng)30天后統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為5. 63%。這主要是由于山葵子葉外植體對高濃度的A4菌液 較敏感，在用濃度為〇D_ = 0. 6的菌液浸染外植體后，造成山葵子葉出現(xiàn)嚴重的褐化的原 因。
[0077] 對比例3
[0078] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0079] 取消步驟（3)的預(yù)培養(yǎng)步驟，直接采用未經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的山葵子葉切口處未產(chǎn)生膨 大的外植體進行農(nóng)桿菌浸染實驗。在步驟（4)山葵子葉培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為 4. 89%。這就說明在農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化的過程中，將轉(zhuǎn)化的外植體經(jīng)過一定時間的預(yù)培養(yǎng) 處理后，可以很好地把將要轉(zhuǎn)化的外植體細胞調(diào)整到最適宜農(nóng)桿菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的狀態(tài)。
[0080] 對比例4
[0081] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0082] 步驟⑶中，改選為山葵無菌苗已展開8d的子葉作為外植體，在步驟⑷培養(yǎng)30 天后，統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為8. 43 %。
[0083] 對比例5
[0084] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0085] 在步驟（3)中，去掉預(yù)培養(yǎng)基中添加的腺嘌呤，在步驟（4)培養(yǎng)30天后統(tǒng)計毛狀 根轉(zhuǎn)化率為10. 41%，說明腺嘌呤有明顯地調(diào)整山葵子葉外植體細胞產(chǎn)生活化狀態(tài)的作用， 使得農(nóng)桿菌更易轉(zhuǎn)化成功。
[0086] 對比例6
[0087] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0088] 將步驟（3)中的預(yù)培養(yǎng)條件改為在光強15001x，每天光照10h的條件下培養(yǎng)，在 步驟（4)中在培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為10. 24%。
[0089] 對比例7
[0090] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0091] 步驟（4)中，將山葵子葉外植體放入農(nóng)桿菌菌液中浸染時間改為10分鐘，共培養(yǎng) 時間改為5天，在步驟（4)山葵子葉培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為3. 69%。通過觀察 發(fā)現(xiàn)，山葵子葉在農(nóng)桿菌菌液中浸染時間過長，使得子葉受到較嚴重傷害，同時也造成轉(zhuǎn)化 后的子葉除菌較困難。
[0092] 對比例8
[0093] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0094] 步驟（4)中，將共培養(yǎng)基中添加的鄰苯二酚去掉，并改為在光強20001x，每天光照 8h的條件下培養(yǎng)進行共培養(yǎng)；山葵子葉培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為9. 59%。
[0095] 對比例9
[0096] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0097] 取消步驟⑷中的共培養(yǎng)步驟。在步驟⑷山葵子葉的除菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天 后，統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為2. 81%。由此說明，共培養(yǎng)步驟在山葵子葉的遺傳轉(zhuǎn)化過程起作重 要的作用。
[0098] 對比例10
[0099] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0100] 上述步驟（4)中，把經(jīng)共培養(yǎng)后的外植體直接轉(zhuǎn)入除菌培養(yǎng)基中，而取消在抗生 素水中的處理過程；山葵子葉培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為14. 23%。
[0101] 對比例11
[0102] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0103] 在步驟⑷中的除菌培養(yǎng)基改為MS+IBAO. 5mg · L-W瓊脂6g · L-W蔗糖20g · L-W 頭孢噻肟鈉200mg · Γ1 ;山葵子葉培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為12. 48%。
[0104] 對比例12
[0105] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0106] 在步驟⑷中的除菌培養(yǎng)基改為MS+IBAO. 5mg · 1^+瓊脂6g · 1^+蔗糖20g · 1^+ 頭孢曲松鈉200mg · Γ1 ;山葵子葉培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計毛狀根轉(zhuǎn)化率為7. 89%。
[0107] 對比例13
[0108] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0109] 在步驟（5)中，切取長度為0. 5cm的毛狀根進行增殖培養(yǎng)；在培養(yǎng)25天后統(tǒng)計毛 狀根的增殖倍數(shù)為2. 18。
[0110] 對比例14
[0111] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0112] 在步驟（5)中，將毛狀根快速增殖培養(yǎng)基中添加的頭孢霉素去掉，在培養(yǎng)25天后 統(tǒng)計毛狀根的增殖倍數(shù)為2. 01。
[0113] 對比例15
[0114] 該對比例的過程與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：
[0115] 在步驟（5)中，將毛狀根快速增殖培養(yǎng)基改為1/2MS+IBA0. lmg ·Ι^+蔗糖10g ·Ι^+ 頭孢霉素500mg · 1^+瓊脂7g · Γ1的固體培養(yǎng)基上進行毛狀根的快速增殖培養(yǎng)，在培養(yǎng)25 天后統(tǒng)計毛狀根的增殖倍數(shù)為1. 86。
[0116] 以上所揭露的僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，當然不能以此來限定本發(fā)明之權(quán)利 范圍，因此依本發(fā)明申請專利范圍所作的等同變化，仍屬本發(fā)明所涵蓋的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于包括如下步驟： 步驟1，農(nóng)桿菌菌種的活化培養(yǎng)：將發(fā)根農(nóng)桿菌在YEB固體培養(yǎng)基上劃線后，放在26? 30°C的溫度條件下進行暗培養(yǎng)24?36h后，挑取單菌落接入YEB液體培養(yǎng)基中，并于25? 30°C振蕩培養(yǎng)1?2天后，用于外植體浸染； 步驟2,山葵無菌苗的獲得：將山葵種子放在超凈工作臺上，先用75%的酒精消毒20? 40s，再用0. 1 %升汞消毒3?8min，無菌水沖洗2?5次后，剝?nèi)シN皮接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 獲得山葵無菌苗； 步驟3,山葵子葉的預(yù)培養(yǎng)：切取山葵無菌苗展開的子葉作為外植體，接種于預(yù)培養(yǎng)基 上，并進行預(yù)培養(yǎng)； 步驟4,山葵子葉的遺傳轉(zhuǎn)化：選取預(yù)培養(yǎng)后的山葵子葉外植體放入步驟（1)活化好的 農(nóng)桿菌菌液中浸染，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸后，并用無菌濾紙吸干外植體表面多余的 菌液后，再轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基中，在15?22°C的暗培養(yǎng)條件下進行1?3d的共培養(yǎng)；隨后將其 轉(zhuǎn)入抗生素水中浸泡后，再轉(zhuǎn)入除菌培養(yǎng)基中進行除菌培養(yǎng)，每隔2?4d轉(zhuǎn)接一次除菌培 養(yǎng)基，直到毛狀根大量產(chǎn)生； 步驟5,山葵毛狀根的快速增殖：切取長度為1. 5?3cm的毛狀根轉(zhuǎn)接在毛狀根快速增 殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于： 步驟（1)中采用的農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌A4或R1000,浸染山葵子葉外植體的菌液OD_ = 0. 1 ?0. 3。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于： 步驟⑵中將消毒后的山葵種子剝?nèi)シN皮并接種在MS+6-BA0. 5?^g^P+NAA(或者 ΙΑΑ)0· 5?2mg · 1^+蔗糖20?50g · 1^+瓊脂3. 5?4. 5g · L-1的培養(yǎng)基上，并在22? 28°C，光強1000?20001x，每天光照8?12h的條件下培養(yǎng)，獲得山葵無菌苗。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：步 驟（3)中，是選取山葵無菌苗剛展開l-4d的子葉作為外植體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：步 驟⑶中，預(yù)培養(yǎng)基是MS+2,4-Dl?2mg ?P+KTO. 1?0· 5mg ·Ι^+腺嘌呤10?20mg ·Ι^+ 鹿糖20?50g · L-1+瓊脂5?7g · Ι71。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：步 驟（3)中，山葵子葉的預(yù)培養(yǎng)條件是在18?22°C、無光照條件下進行1?3d的預(yù)培養(yǎng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：步 驟（4)中是選取預(yù)培養(yǎng)后在山葵子葉切口處產(chǎn)生膨大的外植體放入活化好的農(nóng)桿菌菌液 中浸染1?3分鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：步 驟⑷中的共培養(yǎng)基為1/2MS+鄰苯二酚100?200mg · 1^+蔗糖10?15g · 1^+瓊脂4? 5. 5g · Γ1 ;并在15?22°C的暗培養(yǎng)條件下進行1?3d的共培養(yǎng)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：步 驟⑷中，把共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)入含頭孢噻肟鈉200?500mg噸 4的抗生素水中浸泡1? 3小時后，再轉(zhuǎn)入除菌培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0. 1?0· 5mg · 1^+瓊脂5?7g · 1^+蔗糖15? 30g · 1^+頭孢噻肟鈉200?400mg · 1^+頭孢曲松鈉200?400mg · Γ1中進行除菌培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：步 驟（5)中，毛狀根快速增殖培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0. 1?0· 5mg · 1^+蔗糖10?20g · 1^+頭 孢霉素100?300mg · Γ1的液體培養(yǎng)基上進行毛狀根的快速增殖培養(yǎng)。
【文檔編號】C12N15/82GK104140978SQ201410353144
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】王躍華, 任三軍, 孫雁霞 申請人:成都大學