紫腳板薯組織rna的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了紫腳板薯組織RNA的提取方法，在SDS法的基礎(chǔ)上，于粉碎材料時，用水不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)防止酚類物質(zhì)氧化，同時高鹽溶液去除多糖污染，采用0.1倍的3M的KAC（pH5.2）和2.5倍的乙醇沉淀RNA。所提取的RNA純度和完整性均良好，不存在DNA、蛋白、多糖等雜質(zhì)的污染，便于進行下游的分子生物學(xué)實驗。
【專利說明】紫腳板薯組織RNA的提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及RNA提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002]紫腳板薯系薯菌科(D1scoreaceae)薯菌屬(D1scorea)多年生纏繞性藤本植物，由于其薯型為腳板狀，肉為紫色而得名。紫腳板薯含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、多糖、微量元素以及膳食纖維，是集食、藥為一體的保健食品。淀粉的糖技術(shù)發(fā)展在中國有很大的市場，可通過現(xiàn)代生物工程技術(shù)將其轉(zhuǎn)化制造酒精、醋、糖飴等工業(yè)原料[2]，而紫腳板薯以其產(chǎn)量高(畝產(chǎn)量可達數(shù)噸)，淀粉含量高的特點，逐漸嶄露頭角，有望成為食、藥、能源三位一體的“超級作物”。
[0003]隨著對其重要性的認識，對于紫腳板薯的研究也廣泛的展開。其中，對紫腳板薯進行基因克隆，功能分析，遺傳改良等，首先是要得到高質(zhì)量的RNA。然而，紫腳板薯體內(nèi)富含多酚和次生代謝物，嚴重地影響了紫腳板薯RNA的提取。目前，國內(nèi)廣泛應(yīng)用的Trizol法、異硫氰酸狐一步法(Ghawana, Paul et al.2011 ；Eldh, Lotvall et al.2012),以及己報道的其他植物組織總RNA提取的方法在應(yīng)用于紫腳板薯組織RNA的提取時都不能得到滿意的效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種從能夠有效從紫腳板薯組織中提取高質(zhì)量總RNA的方法。具體技術(shù)方案如下 :
紫腳板薯組織RNA的提取方法，包括如下步驟:(I)將RNA提取液65度水浴15 min ;所述 RNA 提取液為 2% SDS, 10mM Tris, 25mM EDTA, 2M NaCl 溶液；(2)每取 0.5 g 紫腳板薯組織材料放入預(yù)先加好0.03 g聚乙烯吡咯烷酮PVPP的研缽中，加液氮迅速研磨至粉末；
(3)粉末轉(zhuǎn)移至離心管中，加0.6 ml RNA提取液和24 μ I β -巰基乙醇，渦旋數(shù)秒后水浴10 min ； (4)加0.6 ml體積比24:1氯仿異戍醇后劇烈震蕩I min后，13000 rpm離心8min ； (5)取上清，加2.5倍體積的乙醇和0.1倍體積的3 mo I/L pH5.2 KAC，混勻，冰浴10min, 13000 rpm離心 10 min ； (6)棄上清,加 I ml 70% 乙醇洗漆，13000 rpm離心 5 min,棄上清，稍離心，使殘液集于管底，用移液器吸去，置于超凈工作臺上用無菌風(fēng)吹2-5 min,加43 μ I 水溶解；(7)加 5 μ I DNase Buffer, 2 μ I DNase，溫和混勻，37°C 30 min ； (8)加350 μ I水、200 μ I酸酚、200 μ I氯仿異戊醇，震蕩I min，13000 rpm離心10 min ；
(9)取上清,加等體積的氯仿異戍醇,氯仿異戍醇體積比24:1，震蕩I min,13000 rpm離心10 min ； (10)取上清，加2.5倍體積的乙醇和0.1倍體積的3 mo I/L ρΗ5.2 KAC，混勻，冰浴 10 min, 13000 rpm 離心 10 min ； (11)棄上清，加 I ml 70% 乙醇洗漆，13000 rpm 離心5 min,棄上清，稍離心，使殘液集于管底，用移液器吸去，置于超凈工作臺上用無菌風(fēng)吹2-5min,加適量水溶解。
[0005]為達到更好的提取效果:配置的試劑均用RNase-free ddH20配置；實驗所用槍頭、離心管均用0.1% DEPC水浸泡過夜后高壓滅菌；所用研缽和玻璃器皿經(jīng)錫紙包裹后200°C烘烤4-6h。
[0006]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明方法能高效的從紫腳板薯各個組織中提取高質(zhì)量總 RNA。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1本發(fā)明方法不同組織RNA電泳圖。注:M為maker ;1為根；2為莖；3為雌蕊；4為萼片；5為花瓣；6為葉子；7為雄蕊。
[0008]圖2其他方法所提取的RNA電泳圖。注:A為Trizol法，B為某知名生物公司的RNA提取試劑盒。

【具體實施方式】
[0009]實施例1 1.1植物材料
紫腳板薯種苗由南昌綰翠園實業(yè)有限公司提供，于開花時取植物的根、莖、葉、花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊，置于液氮中保存。
[0010]1.2主要試劑和用具
實驗中所使用的SDS、水平衡酚、氛仿、異戊醇、乙醇、DEPC等試劑均購自南京基天生物公司；DNase Buffer、DNase、RNase抑制劑等均購Takara公司。所有配置的試劑均用RNase-free ddH20配置。槍頭、離心管等耗材均用0.1% DEPC水浸泡過夜后高壓滅菌。研缽和玻璃器皿錫紙包裹后200°C烘烤4 h以上。
[0011]1.3 RNA提取過程
(I)將 RNA 提取液(2% SDS, 10mM Tris, 25mM EDTA, 2M NaCl) 65 度水浴 15 min; (2)取約0.5 g材料放入預(yù)先加好聚乙烯吡咯烷酮PVPP (約0.03 g)的研缽中，加液氮迅速研磨至粉末；(3)粉末轉(zhuǎn)移至2.0 ml離心管中，加0.6 ml RNA提取液和24 μ I β-巰基乙醇，渦旋數(shù)秒后水浴10 min ； (4)加0.6 ml氯仿異戊醇(24:1)后劇烈震蕩I min后13000rpm離心8 min ；(5)取上清，加2.5倍體積的乙醇和0.1倍體積的3 M KAC (ρΗ5.2)，混勻，冰浴10 min, 13000 rpm離心10 min ; (6)棄上清,加I ml 70%乙醇洗漆，13000 rpm離心5 min,棄上清，稍離心，使殘液集于管底，用移液器吸去，置于超凈工作臺上用無菌風(fēng)吹
2-5 min,加43 μ I 水溶解；(7)加5 μ I DNase Buffer,2 μ I DNase，溫和混勻，37°C 30min; (8)加350 μ I水、200 μ I酸酹、200 μ I氯仿異戍醇，震蕩I min, 13000 rpm離心10 min ; (9)取上清至另一管中,加等體積的氯仿異戍醇(24:1),震蕩I min, 13000 rpm離心10 min ;(10)取上清至另一管中，加2.5倍體積的乙醇和0.1倍體積的3 M KAC(pH5.2)，混勻，冰浴10 min, 13000 rpm離心10 min ;(11)棄上清,加I ml 70%乙醇洗漆，13000 rpm離心5 min，棄上清，稍離心，使殘液集于管底，用移液器吸去，置于超凈工作臺上用無菌風(fēng)吹2-5 min,加適量水溶解。
[0012]1.4 RNA質(zhì)量分析
通過1.5%的瓊脂糖膠電泳分析RNA完整性；同時通過Eppendorf公司的核酸儀測定RNA 的 A23Q、A260, A280 和 A32tl,并計算 A26Q/A23Q 和 A26Q/A23Q 分析 RNA 純度。
[0013]2結(jié)果分析
2.1 RNA完整性分析
提取的RNA通過1.5%的瓊脂糖膠電泳檢測，采用本方法所提取的RNA能看其285和185兩條帶帶型清楚，28s rRNA帶的亮度明顯高于18s rRNA帶，2條帶之間無彌散和拖尾，點樣孔中無雜質(zhì)(圖1)。這說明用改良的SDS/酚法從紫腳板薯各個組織器官內(nèi)提出的總RNA比較完整,無降解,也沒有蛋白質(zhì)，多糖和DNA的污(Chomczynski and Sacchi 2006)。
[0014]2.2 RNA樣品純度分析
核酸樣品的純度和濃度一般通過測定其在230 nm、260 nm、280 nm和320 nm的紫外吸光度來分析。其中，A230> A260, A280和A32tl分別表示苯酚或芳香族雜質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)和微生物大顆粒的吸光度。對于純凈的RNA，A260A230在1.8-2.2, A260A230大于2，A32tl小于0.01(Azam, Peiffer et al.2006)。
[0015]取2 μ I RNA用水稀釋到70 μ 1，用印pendorf公司的生物分光光度計測A23。、A260^A280和A32tl,每個樣品重復(fù)3次，并計算A26(i/A23(i和A26(i/A28(i。所得結(jié)果見表1。有結(jié)果我們可以看出，各個RNA樣品的A260A230均在1.8-2.2之間，A260A230大于2，A320均小于0.01，A230小于0.01。所有這些數(shù)據(jù)表明，RNA樣品純凈，無蛋白質(zhì)，酚類和其他雜質(zhì)的污染。
[0016]表1:各組織RNA的紫外吸收檢測結(jié)果

【權(quán)利要求】
1.紫腳板薯組織RNA的提取方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將RNA提取液65度水浴15min ;所述RNA提取液為2% SDS, 100 mM Tris, 25mMEDTA, 2M NaCl 溶液； (2)每取0.5g紫腳板薯組織材料放入預(yù)先加好0.03 g聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)的研缽中，加液氮迅速研磨至粉末； (3)粉末轉(zhuǎn)移至離心管中，加0.6 ml RNA提取液和24 μ I β-巰基乙醇，渦旋數(shù)秒后水浴10 min ； (4)加0.6 ml體積比24:1氯仿異戍醇后劇烈震蕩I min后，13000 rpm離心8 min ； (5)取上清，加2.5倍體積的乙醇和0.1倍體積的3 mo I/L pH5.2 KAC，混勻，冰浴10min, 13000 rpm 離心 10 min ； (6)棄上清,加Iml 70%乙醇洗漆，13000 rpm離心5 min,棄上清,再稍離心,使殘液集于管底，用移液器吸去，置于超凈工作臺上用無菌風(fēng)吹2-5 min，加43 μ I水溶解；
(7)加5 μ I DNase Buffer, 2 μ I DNase，溫和混勻，37°C 30 min ； (8)加350μ I水、200 μ I酸酚、200 μ I氯仿異戊醇，震蕩I min，13000 rpm離心10 min ； (9)取上清,加等體積的 氯仿異戍醇,氯仿異戍醇體積比24:1，震蕩I min, 13000 rpm離心10 min ； (10)取上清，加2.5倍體積的乙醇和0.1倍體積的3 mo I/L pH5.2 KAC，混勻，冰浴10min, 13000 rpm 離心 10 min ； (11)棄上清，加Iml 70%乙醇洗漆，13000 rpm離心5 min,棄上清,使殘液集于管底，用移液器吸去，置于超凈工作臺上用無菌風(fēng)吹2-5 min,加適量水溶解。
2.如權(quán)利要求1所述紫腳板薯組織RNA的提取方法，其特征在于配置的試劑均用RNase-free ddH20 配置。
3.如權(quán)利要求1所述紫腳板薯組織RNA的提取方法，其特征在于實驗所用槍頭、離心管均用0.1% DEPC水浸泡過夜后高壓滅菌；所用研缽和玻璃器皿經(jīng)錫紙包裹后200°C烘烤4_6h。
【文檔編號】C12N15/10GK104164419SQ201410351850
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】羅火林, 楊柏云, 羅麗萍, 熊冬金, 黃學(xué)勇 申請人:南昌大學(xué)