蘋果潛隱病毒和類病毒的多重rt-pcr檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種可同時檢測蘋果樹葉片、枝條、花和果實是否攜帶3種潛隱病毒(蘋果褪綠葉斑病毒、蘋果莖溝病毒和蘋果莖痘病毒)和蘋果銹果類病毒屬3種類病毒(蘋果銹果類病毒、蘋果凹果類病毒、蘋果皺果類病毒)的多重RT-PCR檢測方法。利用該方法進行檢測，具有檢測結(jié)果易于判別、操作簡便、反應快速、靈敏度高等優(yōu)勢，克服了現(xiàn)有技術(shù)中耗時、步驟繁瑣、條帶不易區(qū)分、靈敏度低等缺點，為蘋果病毒病的檢測提供了一種便于推廣應用的快速檢測方法。
【專利說明】蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測方法

【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物保護領域及分子生物學檢測領域，具體地說，涉及蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002]在蘋果栽培生產(chǎn)過程中，病毒病害一直是嚴重影響果品產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素之一。蘋果樹被病毒侵染后，終生帶毒，病毒在樹體內(nèi)增殖，干擾、破壞樹體的正常生理機能，導致長勢減退，產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣，不耐貯藏，給我國的蘋果生產(chǎn)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。目前，我國已發(fā)現(xiàn)和鑒定的病毒主要包括:蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus, ACLSV)、蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)、蘋果莖痕病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)、蘋果鎊果類病毒(Apple scar skin viroid, ASSVd) >蘋果凹果類病毒(Apple dimple fruit viroid, ADFVd) ? 前 3 種(ACLSV、ASGV、ASPV)為潛隱性病毒，侵染蘋果樹不引起明顯癥狀，但導致樹勢衰弱，果實產(chǎn)量和品質(zhì)嚴重下降；后2種(ASSVd和ADFVd)為類病毒，同為蘋果銹果類病毒屬(Apscarviroid)成員，在果實上表現(xiàn)銹果、花臉、凹陷等癥狀，嚴重降低果實經(jīng)濟價值，甚至完全喪失經(jīng)濟價值。ADFVd是于2013年在我國首次發(fā)現(xiàn)并報道的危險性類病毒，在我國蘋果主產(chǎn)區(qū)山東和新疆局部發(fā)生，但有快速蔓延趨勢。此外，日本學者報道了蘋果皺果類病毒(AFCVd)的發(fā)生和危害，盡管AFCVd還未在我國發(fā)現(xiàn)，因其危害嚴重，有必要進行監(jiān)測。
[0003]與其他病害相比，蘋果病毒病的發(fā)生與危害有幾大明顯特點，一是多數(shù)為潛隱性發(fā)生，難以通過觀察癥狀判斷是否有病毒；二是類病毒對蘋果果實危害嚴重，在枝條和幼樹上無任何癥狀，經(jīng)3~5年生長到了結(jié)果期，果實發(fā)病，果農(nóng)損失慘重，所以育苗和生產(chǎn)中對蘋果銹果類病毒屬的3種類病毒應為零容忍；三是一旦被侵染，果樹將終生帶毒，受到長期且持續(xù)的危害；四是目前沒有有效的藥劑防治，特別是類病毒病發(fā)生后，應將病樹刨除。這些特點給病害的診斷和控制造成了困難，在蘋果嫁接生產(chǎn)過程中不能輕易分辨健康苗和帶毒苗，容易造成帶毒苗的亂用，使得后續(xù)病害大范圍快速擴散。為此，亟待開發(fā)一種簡單、快速、靈敏的檢測方法用于檢測蘋果樹和果實是否攜帶病毒和類病毒。
[0004]目前常見的檢測病毒的方法有2種，一是以ELISA為主的血清學檢測方法，因該方法靈敏度低，果樹病毒含量低，該方法不適合蘋果病毒的檢測；二是常規(guī)PCR方法，由于侵染蘋果的病毒種類多，需對每種病毒進行PCR檢測，操作繁瑣，耗時長，花費高。近些年逐漸發(fā)展起來的多重PCR(Multiplex Polymerase Chain React1n),由于可以在一個反應管中同時擴增多個序列，大大縮短了檢測時間，實現(xiàn)了對多種病毒的同步檢測，逐漸被廣泛用于病毒病的檢測工作中。相比常規(guī)PCR，多重PCR效率高，系統(tǒng)性強，節(jié)省了檢測成本與檢測時間，在果樹病害的檢測中多有報道，但沒有關于同時檢測3種潛隱病毒與蘋果銹果類病毒屬3種類病毒的相關文獻和專利。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測引物組合。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供含有上述引物組合的用于多重RT-PCR檢測蘋果潛隱病毒和類病毒的試劑盒。
[0007]本發(fā)明的再一目的是提供蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測方法。
[0008]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，首先參考現(xiàn)有文獻與GenBank中已報道的序列，篩選和設計多重RT-PCR引物，旨在使選擇的引物可以適用于我國現(xiàn)有已確定的蘋果所有潛隱病毒與類病毒，可特異地獲得目標片段，且各目標片段可以用瓊脂糖凝膠電泳清晰、明確地區(qū)分開。由于類病毒基因組較小(僅約330nt)，ASSVd、ADFVd、AFCVd同屬Apscarviroid，且蘋果栽培生產(chǎn)中，僅一種類病毒存在即引起嚴重危害，實際生產(chǎn)中不允許任一種類病毒存在，因此根據(jù)蘋果銹果類病毒屬3種類病毒設計通用引物檢測3種類病毒。
[0009]本發(fā)明的蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測引物組合，所述引物組合包括:
[0010]用于特異性RT-PCR檢測蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spotvirus, ACLSV)的引物對 I:
[0011]ACLSV-F5; -GAGANTTTCAGTTTGCTMGA-3'
[0012]ACLSV-R5; -AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT-3;
[0013]其中，N為A或 G，M為A或C;
[0014]用于特異性RT-PCR檢測蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving vir us, ASGV)的引物對II:
[0015]ASGV-F 5' -TGGAAACCGAGGATGGACAG-3;
[0016]ASGV-R 5' -CTGGTACCCAAACCCAAGCCTTAG-3'；
[0017]用于特異性RT-PCR檢測蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)的引物對III:
[0018]ASPV-F 5' -GAAGTAATCGCATCATTCAC-3'
[0019]ASPV-R 5' -GATATGTACCTATTGATGGTTTC-3';以及
[0020]用于特異性RT-PCR檢測蘋果銹果類病毒屬(Apscarviroid) 3種類病毒:蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid)、蘋果凹果類病毒(Apple dimple fruit viroid)和蘋果皺果類病毒(AFCVd)的通用引物對IV:
[0021]apscarviroids-F 5' -AGACCCTTCGTCGACGACGA-3'
[0022]apscarviroids-R 5' -TGTCCCGCTAGTCGAGCGGA-3'。
[0023]為了減少假陽性的產(chǎn)生，加入了更加特異的EF-1 α作為內(nèi)標基因。因此，所述引物組合中還包括用于特異性RT-PCR檢測內(nèi)參基因ER-1 α的引物對V:
[0024]ER-1a-F 5' -TCATCATGAACCACCCCG-3'
[0025]ER-1a-R 5' -CCTGTCC AGAACCCAATTC-3'。
[0026]本發(fā)明還提供含有上述引物組合的用于多重RT-PCR檢測蘋果潛隱病毒和類病毒的試劑盒。
[0027]所述試劑盒還包括反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、DNase 1、DEPC水、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液等中的至少一種。更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
[0028]本發(fā)明還提供所述試劑盒在多重RT-PCR檢測蘋果潛隱病毒和類病毒中的應用。
[0029]本發(fā)明進一步提供蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測方法，包括以下步驟:
[0030]I)提取待測蘋果樣品中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得第一條cDNA鏈；
[0031]2)以步驟I)中獲得的cDNA為模板，利用上述引物組合進行特異性PCR擴增反應；
[0032]3)分析PCR產(chǎn)物。若794bp處有條帶表明ACLSV為陽性，若666bp處有條帶表明ASGV為陽性，若346bp處有條帶表明ASPV為陽性，若220bp處有條帶表明apscarviroids為陽性。
[0033]前述的方法，步驟I)具體為:提取待測蘋果樣品中的總RNA，向反應管中加入蘋果樣品 RNA3.5μ L、10yM 隨機引物 0.5 μ LUO μ M Oligo dT0.5 μ L,5XM-MLV 酶緩沖液
4.0 μ LUOmM dNTPsl.0 μ L、RNA 酶抑制劑 0.5 μ L、200U/μ L M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μ L，加DEPC ddH20至總體積20 μ L，于42°C反應lh，即得第一條cDNA鏈。
[0034]其中，所述隨機引物為5' -d(NNNNNN)，N*A、G、C*T。
[0035]步驟2)中進行PCR擴增使用的PCR反應體系以25 μ I計為:
[0036]

【權(quán)利要求】
1.蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測引物組合，其特征在于，所述引物組合包括: 用于特異性RT-PCR檢測蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus)的引物對1:
ACLSV-F 5' -GAGANTTTCAGTTTGCTMGA-3'
ACLSV-R 5' -AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT-3' 其中，N為A或G，M為A或C; 用于特異性RT-PCR檢測蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving vir us)的引物對II: ASGV-F 5' -TGGAAACCGAGGATGGACAG-3'
ASGV-R 5' -CTGGTACCCAAACCCAAGCCTTAG-3'； 用于特異性RT-PCR檢測蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus)的引物對III: ASPV-F 5' -GAAGTAATCGCATCATTCAC-3' ASPV-R 5' -GATATGTACCTATTGATGGTTTC-3';以及 用于特異性RT-PCR檢測蘋果銹果類病毒屬(Apscarvi1id) 3種類病毒:蘋果銹果類病毒(Apple scar skin vi roid)、蘋果凹果類病毒(A pple dimple fruit viroid)和蘋果皺果類病毒(AFCVd)的通用引物對IV:
apscarviroids-F 5' -AGACCCTTCGTCGACGACGA-3'
apscarviroids-R 5' -TGTCCCGCTAGTCGAGCGGA-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合，其特征在于，所述引物組合中還包括用于特異性RT-PCR檢測內(nèi)參基因ER-1 α的引物對V:
ER-1a-F 5' -TCATCATGAACCACCCCG-3' ER-1a-R 5' -CCTGTCCAGAACCCAATTC-3'。
3.含有權(quán)利要求1或2所述引物組合的用于多重RT-PCR檢測蘋果潛隱病毒和類病毒的試劑盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、DNase 1、DEPC水、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
6.權(quán)利要求3-5任一項所述試劑盒在多重RT-PCR檢測蘋果潛隱病毒和類病毒中的應用。
7.蘋果潛隱病毒和類病毒的多重RT-PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取待測蘋果樣品中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得第一條cDNA鏈； 2)以步驟I)中獲得的cDNA為模板，利用權(quán)利要求2所述引物組合進行特異性PCR擴增反應； 3)分析PCR產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟I)具體為:提取待測蘋果樣品中的總RNA，向反應管中加入蘋果樣品RNA3.5 μ L、10 μ M隨機引物0.5 μ L、10 μ M OligodT0.5 μ L、5 XM-MLV 酶緩沖液 4.0 μ L、1mM dNTPs 1.0 μ L、RNA 酶抑制劑 0.5 μ L、200U/ μ LM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μ L，加DEPC ddH20至總體積20 μ L，于42°C反應lh，即得第一條cDNA鏈。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟2)中進行PCR擴增使用的PCR反應體系以25 μ I計為:cDNA 模板2.0μ1 1mM dNTPs0.5μ1 20μΜ ACLS^FΙ.Ομ! 20μΜ ACLSV-RΙ,ΟμΙ 20μΜ ASGV^FΙ.ΟμΙ
20μΜ ASGV-R1.ΟμΙ
20μΜ ASPV-F0.4μΙ
20μΜ ASPV-R0.4μ1
20μΜ apscarviroids-F0.5μΙ 20μΜ apscarviroids-R0.5 μL 20μΜ ER-1tt-F0.5μΙ 20μΜ ER-1a-R0.5μΙ SU/μΙ Taq DNA聚合轉(zhuǎn)0,5μΙ 10 X PCR反應緩沖液5.0μ1ddH20補足至 25μ1?PCR反應條件為:94°C 3分鐘；94°C 30秒，53°C 45秒，68°C 2分鐘，共35個循環(huán)；72°C 10分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項所述的方法，其特征在于，待測蘋果樣品來自于蘋果的葉片、枝條、花或果實。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164517SQ201410347974
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月21日
【發(fā)明者】周濤, 郝璐, 陳善義, 范在豐, 國立耘, 葉婷 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學