一種用于預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物療效的試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物療效的試劑盒。本發(fā)明所提供的用于預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物療效的試劑盒，含有用于檢測(cè)MTNR1B基因的rs10830963位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)，如由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)。本發(fā)明從使用最為廣泛的磺脲類(lèi)降糖藥物入手，開(kāi)發(fā)出一種新的、能夠提前預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物的療效的產(chǎn)品，以指導(dǎo)實(shí)施更有效、更安全的糖尿病診療。從而進(jìn)一步提高藥物的療效并減少因?yàn)樗幬镌谝恍┎幻舾袀€(gè)體的微弱治療效果而帶來(lái)的病情延誤和不必要的醫(yī)療花費(fèi)。推進(jìn)更有效的新型“個(gè)體化用藥”進(jìn)程，最終達(dá)到視“每個(gè)人的遺傳學(xué)狀況”而用藥，使患者在獲得最大藥物療效的同時(shí)，只面臨最小的藥物不良反應(yīng)危險(xiǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種用于預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物療效的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種用于預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物療效的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]在糖尿病的治療領(lǐng)域，磺脲類(lèi)藥物是一類(lèi)非常重要的，使用最廣泛的降糖藥物。目前我國(guó)上市的磺脲類(lèi)藥物主要為格列苯脲、格列美脲、格列齊特、格列吡嗪和格列喹酮?；请孱?lèi)藥物和β細(xì)胞上的受體結(jié)合，促進(jìn)β細(xì)胞分泌胰島素而起到降糖作用。臨床研究顯示，磺脲類(lèi)藥物可以使HbAlc降低I % -2 %，是目前許多國(guó)家和國(guó)際組織制定的糖尿病指南中推薦的控制2型糖尿病患者高血糖的主要用藥。
[0003]在臨床上可以觀察到不同患者對(duì)磺脲類(lèi)藥物的反應(yīng)不一。部分患者對(duì)磺脲類(lèi)藥物非常敏感，在小劑量下就可能出現(xiàn)低血糖。但是也約有10-20%的患者磺脲類(lèi)治療無(wú)效。然而，目前在給患者使用磺脲類(lèi)藥物之前，尚沒(méi)有明確的檢測(cè)手段來(lái)預(yù)測(cè)患者用藥之后的反應(yīng)，無(wú)法提前預(yù)估藥物的療效，因此無(wú)法做到個(gè)體化治療。最新流行病學(xué)調(diào)查顯示在中國(guó)人群中2型糖尿病的患病率高達(dá)9.7%，而只有約30%的糖尿病患者的血糖水平得到滿(mǎn)意的控制。因此，開(kāi)發(fā)能夠預(yù)測(cè)藥物療效的產(chǎn)品，更好的進(jìn)行個(gè)體化的治療是提高糖尿病患者血糖控制率的一個(gè)重要因素。
[0004]藥物作用的個(gè)體差異在很大程度上是個(gè)體鑒于藥物作用和代謝相關(guān)的遺傳背景差異所決定的。
[0005]MTNRlB (Melato nin rec印torlB，褪黑素受體 1B)基因位于 11 號(hào)染色體 q21_q22?；騃D為4554。編碼褪黑素受體1B，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族?；A(chǔ)研究顯示MTNRlB基因mRNA除了在視網(wǎng)膜、腦內(nèi)表達(dá)之外，還可在人胰島細(xì)胞表達(dá)，并且免疫組化顯示主要分布在胰島β細(xì)胞。rsl0830963位點(diǎn)位于MTNRlB基因上，Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)中rsl0830963位點(diǎn)次要等位基因(G)頻率是47.8%。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MTNRlB基因rsl0830963位點(diǎn)和β細(xì)胞功能相關(guān)(Η0ΜΑ-Β，Ρ= 1.1 ΧΙΟ—15)，并且該位點(diǎn)是MTNRlB基因相關(guān)性分析中信號(hào)最強(qiáng)的位點(diǎn)。在一篇納入18236例糖尿病患者和64453例正常血糖對(duì)照的薈萃分析中，rsl0830963位點(diǎn)還和糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)(OR = 1.09,95% CIl.05-1.12，P = 3.3X10-7)。但是，目前的研究?jī)H發(fā)現(xiàn)MTNRlB基因和β細(xì)胞功能以及糖尿病存在關(guān)聯(lián)，國(guó)際和國(guó)內(nèi)均未將該基因用于糖尿病藥物療效的預(yù)評(píng)估。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種用于預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物對(duì)待測(cè)糖尿病患者療效的試劑盒。
[0007]本發(fā)明所提供的用于預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物對(duì)待測(cè)糖尿病患者療效的試劑盒，含有用于檢測(cè)MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)。
[0008]其中，所述用于檢測(cè)MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)可為任何能夠檢測(cè)所述MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)。
[0009]所述MTNRlB基因的核苷酸序列為GenBank:NC_000011.10的第1-13160位；相應(yīng)的，所述 MTNRlB 基因的 rsl0830963 位點(diǎn)對(duì)應(yīng) GenBank:NC_000011.10 的第 5922 位。
[0010]在本發(fā)明中，所述用于檢測(cè)MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)為引物對(duì)；所述引物對(duì)為用于擴(kuò)增所述MTNRlB基因上包含所述rsl0830963位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
[0011]更加具體的，所述引物對(duì)為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)。
[0012]在所述試劑盒中，還可含有如下中的至少一種:DNA聚合酶、PCR緩沖液、4種dNTP。
[0013]所述磺脲類(lèi)藥物可選自格列苯脲、格列美脲、格列齊特、格列吡嗪和格列喹酮。
[0014]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述磺脲類(lèi)藥物具體為格列苯脲。
[0015]另外，所述試劑盒中還可含有記載有如下內(nèi)容的說(shuō)明書(shū):
[0016]所述磺脲類(lèi)藥物對(duì)所述MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為G/G的所述待測(cè)糖尿病患者的療效在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著強(qiáng)于所述MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為C/C或C/G的所述待測(cè)糖尿病患者。
[0017]在本發(fā)明中，所述療效具體體現(xiàn)在所述待測(cè)糖尿病患者用藥后空腹血糖與用藥前空腹血糖相比的下降幅度上。
[0018]進(jìn)一步，可按照如下步驟確定所述MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型:
[0019](I)以所述待測(cè)糖尿病患者的基因組DNA為模板，采用由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0020](2)若經(jīng)過(guò)所述PCR擴(kuò)增得到如下(A)所示PCR產(chǎn)物，則所述MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為G/G ;若經(jīng)過(guò)所述PCR擴(kuò)增得到如下(B)所示PCR產(chǎn)物，則所述MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為C/C ;若經(jīng)過(guò)所述PCR擴(kuò)增得到如下(C)所示PCR產(chǎn)物，則所述MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為C/G ；
[0021](A)單一 PCR產(chǎn)物:核苷酸序列為序列表中序列3，第107位為G ；
[0022](B)單一 PCR產(chǎn)物:核苷酸序列為序列表中序列3，第107為C ;
[0023](C)兩種PCR產(chǎn)物:一種的核苷酸序列為序列表中序列3，第107位C ;另一種的核苷酸序列為序列表中序列3，第107位為G。
[0024]在本發(fā)明中，所述糖尿病患者具體為2型糖尿病患者。
[0025]另外，所述的試劑盒在制備用于預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物對(duì)待測(cè)糖尿病患者療效的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026]所述磺脲類(lèi)藥物可選自格列苯脲、格列美脲、格列齊特、格列吡嗪和格列喹酮。
[0027]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述磺脲類(lèi)藥物具體為格列苯脲。
[0028]在本發(fā)明中，所述糖尿病患者具體為2型糖尿病患者。
[0029]本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)MTNRlB基因rs 10830963位點(diǎn)，給出患者對(duì)磺脲類(lèi)降糖藥物的反應(yīng)的預(yù)測(cè)。從使用最為廣泛的磺脲類(lèi)降糖藥物入手，開(kāi)發(fā)出一種新的、能夠提前預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物的療效的產(chǎn)品，以指導(dǎo)實(shí)施更有效、更安全的糖尿病診療。從而進(jìn)一步提高藥物的療效并減少因?yàn)樗幬镌谝恍┎幻舾袀€(gè)體的微弱治療效果而帶來(lái)的病情延誤和不必要的醫(yī)療花費(fèi)。推進(jìn)更有效的新型“個(gè)體化用藥”進(jìn)程，最終達(dá)到視“每個(gè)人的遺傳學(xué)狀況”而用藥，使患者在獲得最大藥物療效的同時(shí)，只面臨最小的藥物不良反應(yīng)危險(xiǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0030]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0031]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032]實(shí)施例1、用于預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物對(duì)待測(cè)糖尿病患者療效的試劑盒的制備及應(yīng)用
[0033]一、用于預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物對(duì)待測(cè)糖尿病患者療效的試劑盒的制備
[0034]本發(fā)明中，用于預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物對(duì)待測(cè)糖尿病患者療效的試劑盒中最重要的組成為用于檢測(cè)人MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性的引物對(duì)。
[0035]本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)人MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)上下游的保守區(qū)序列涉及合成如下引物對(duì):
[0036]上游引物:5’-GATTTGCTTGCTGAACAC-3’(序列 I)；
[0037]下游引物:5’-GCATCATTTGCTGTCTCA-3’ (序列 2)。
[0038]理論上，以人的基因組DNA為模板，采用該引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，會(huì)得到序列表中序列3所示的DNA序列。其中，序列3的第107位對(duì)應(yīng)所述MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)，可為G或C。
[0039]二、用于預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物對(duì)待測(cè)糖尿病患者療效的試劑盒的應(yīng)用
[0040]供試群體:全國(guó)15家三級(jí)甲等醫(yī)院確診的719名2型糖尿病患者(患者同意，并簽署了知情同意書(shū))。其中，男性389名，女性330名(男女比例接近1:1)。他們的平均年齡為54.5±8.6歲，平均體重指數(shù)(BMI) 24.9±2.8kg/m2。入選患者的上述臨床特征和2008年發(fā)表在新英格蘭雜志上中國(guó)糖尿病流行病學(xué)調(diào)查顯示的我國(guó)糖尿病患者的臨床特征類(lèi)似(平均年齡為55.8 (54.2-57.4)歲，平均體重指數(shù)(BMI) 25.2 (24.9-25.6) kg/m2)，因此，入選人群具有普適性。
[0041]1、待測(cè)糖尿病患者的MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)
[0042]采用步驟一設(shè)計(jì)合成的引物對(duì)對(duì)上述供試群體的MTNRlB基因的rs 10830963位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，具體如下:
[0043](I)從每個(gè)待測(cè)糖尿病患者的血液樣本中提取基因組DNA。
[0044](2)以基因組DNA作為模板，采用步驟一設(shè)計(jì)合成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為265bp的目的產(chǎn)物(序列3)。
[0045](3) PCR產(chǎn)物電泳合格后，使用Sanger法進(jìn)行測(cè)序，獲得rs 10830963位點(diǎn)的基因型?艮告。
[0046]若所得PCR產(chǎn)物為單一 PCR產(chǎn)物，序列3的第107位為G，則該待測(cè)糖尿病患者的MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為G/G ；
[0047]若所得PCR產(chǎn)物為單一 PCR產(chǎn)物，序列3的第107位為C，則該待測(cè)糖尿病患者的MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為C/C ；
[0048]若所得PCR產(chǎn)物為兩種PCR產(chǎn)物，一種序列3的第107位為C，另一種序列3的第107位為G，則該待測(cè)糖尿病患者的MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為C/G。
[0049]結(jié)果顯示:719例待測(cè)糖尿病患者的MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)次要等位基因(G)頻率為43.2%，基本符合Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)中的檢索結(jié)果(47.8%)。具體而言，719例待測(cè)糖尿病患者中共有155例MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為G/G ；253例MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為C/C ；311例MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為C/G。
[0050]2、磺脲類(lèi)藥物對(duì)不同待測(cè)糖尿病患者的實(shí)際療效測(cè)定
[0051]格列苯脲是臨床試驗(yàn)以及糖尿病藥物比較研究中常用的經(jīng)典的磺脲類(lèi)藥物的代表。本發(fā)明選擇小劑量(1.25mg，一天一次)的格列苯脲對(duì)719例待測(cè)糖尿病患者進(jìn)行實(shí)際療效測(cè)定。整個(gè)隨訪過(guò)程中飲食、運(yùn)動(dòng)以及藥物劑量不變，隨訪4周。測(cè)定待測(cè)患者治療前后的空腹靜脈血糖，進(jìn)而計(jì)算血糖的下降幅度。
[0052]血糖的下降幅度=(治療前空腹血糖-治療后空腹血糖)/治療前空腹血糖 X100%o
[0053]結(jié)果顯示:G/G基因型患者(155例)格列苯脲的療效最好，血糖下降幅度均值達(dá)到14%，顯著高于C/C基因型患者(253例)的9.2%和C/G基因型患者(311例)的9.1%(P = 0.007)。根據(jù)《新藥西藥臨床研究指導(dǎo)原則》，血糖下降幅度超過(guò)10%提示該降糖藥物在該劑量下有效。本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果提示G/G基因型患者血糖下降幅度達(dá)到14%，該結(jié)果和《新藥西藥臨床研究指導(dǎo)原則》中療效判定結(jié)果一致。因此，使用本發(fā)明可以從由719例2型糖尿病患者組成的供試群體中篩查出22% (155例)對(duì)小劑量格列苯脲最為敏感，屬于血糖下降幅度最為明顯的患者。這部分G/G基因型的患者將從磺脲類(lèi)藥物的治療中得到最大的獲益。
[0054]3,MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與磺脲類(lèi)藥物療效時(shí)間的關(guān)系分析
[0055]本發(fā)明的發(fā)明人結(jié)合步驟I和步驟2得到的每個(gè)待測(cè)糖尿病患者的MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型及其采用格列苯脲治療后血糖的下降幅度兩方面的結(jié)果，通過(guò)Binary Logistic回歸分析觀察rsl0830963位點(diǎn)不同基因型患者血糖下降幅度的差別。OR= 1，表示該基因型對(duì)療效的變化不起作用；0R>1，表示該基因型是對(duì)藥物的療效即血糖的下降的有利因素；0R〈1表示該基因型是對(duì)藥物的療效不利的因素。
[0056]回歸分析顯示:MTNR1B基因rs 10830963位點(diǎn)在隱性遺傳模式下和格列苯脲的療效顯著相關(guān)，G/G基因型患者(155例)格列苯脲的療效最好(OR= 1.849,95 %CIl.283-2.665, P = 0.001)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物對(duì)待測(cè)糖尿病患者療效的試劑盒，含有用于檢測(cè)MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述用于檢測(cè)MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)為引物對(duì)； 所述引物對(duì)為用于擴(kuò)增所述MTNRlB基因上包含所述rsl0830963位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述引物對(duì)為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有如下中的至少一種:DNA聚合酶、PCR緩沖液、4種dNTP。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑盒，其特征在于:所述磺脲類(lèi)藥物選自格列苯脲、格列美脲、格列齊特、格列吡嗪和格列喹酮。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有記載有如下內(nèi)容的說(shuō)明書(shū): 所述磺脲類(lèi)藥物對(duì)所述MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為G/G的所述待測(cè)糖尿病患者的療效強(qiáng)于所述MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為C/C或C/G的所述待測(cè)糖尿病患者。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:按照如下步驟確定所述MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型: (1)以所述待測(cè)糖尿病患者的基因組DNA為模板，采用由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (2)若經(jīng)過(guò)所述PCR擴(kuò)增得到如下(A)所示PCR產(chǎn)物，則所述MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為G/G ;若經(jīng)過(guò)所述PCR擴(kuò)增得到如下(B)所示PCR產(chǎn)物，則所述MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為C/C ;若經(jīng)過(guò)所述PCR擴(kuò)增得到如下(C)所示PCR產(chǎn)物，則所述MTNRlB基因的rsl0830963位點(diǎn)的基因型為C/G ； (A)單一PCR產(chǎn)物:核苷酸序列為序列表中序列3，第107位為G ； (B)單一PCR產(chǎn)物:核苷酸序列為序列表中序列3，第107位為C ； (C)兩種PCR產(chǎn)物:一種的核苷酸序列為序列表中序列3,第107位為C;另一種的核苷酸序列為序列表中序列3，第107位為G。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的試劑盒，其特征在于:所述糖尿病患者為2型糖尿病患者。
9.權(quán)利要求1-8中任一所述的試劑盒在制備用于預(yù)測(cè)磺脲類(lèi)藥物對(duì)待測(cè)糖尿病患者療效的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104131090SQ201410342735
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】紀(jì)立農(nóng), 任倩, 韓學(xué)堯, 吳長(zhǎng)海, 張春波, 鄒琦, 耿春賢, 周杰, 劉珊珊 申請(qǐng)人:北京大學(xué)人民醫(yī)院, 廣州白云山中一藥業(yè)有限公司