一種枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法包括以下步驟：將枯草芽孢桿菌菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度34～38℃、pH值6.3～6.8條件下發(fā)酵培養(yǎng)48～72小時(shí)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：以質(zhì)量百分比計(jì)，乳糖1.5～2.5％、NH4Cl1～2％、MgSO40.5～0.7％，余量為水。本發(fā)明采用枯草芽孢桿菌1.1111(CCTCC NO:M2011286)為發(fā)酵菌株，通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵培養(yǎng)條件，使菌株產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的活性達(dá)到最佳，其中纖維素酶酶活達(dá)206.72U/ml，甘露聚糖酶酶活達(dá)1451.37U/ml，糖化酶酶活達(dá)254.72U/ml。本發(fā)明采用一菌多酶發(fā)酵法，能大幅度提高酶的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，并且由于各種酶來(lái)源于同一菌株，其安全性與復(fù)配性能更優(yōu)。
CCTCC NO.M2011286
2011.08.11
【專利說(shuō)明】一種枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，屬于微 生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 飼用酶制劑是一類高效、無(wú)毒副作用的環(huán)保型"綠色"飼料添加劑，廣泛應(yīng)用于在 動(dòng)物生產(chǎn)中。酶制劑可大大提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，緩解飼料資源短缺、人畜爭(zhēng)糧的局面，有 利于保障糧食安全，提供更為安全，優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物產(chǎn)品，有利于保障食品安全，減輕環(huán)境污染， 保障畜禽養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
[0003]早期的酶制劑以動(dòng)植物作為原料直接提取，但動(dòng)植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，原料有限，加之 酶提取工藝復(fù)雜等，不適于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。而微生物在酶制劑的生產(chǎn)中有其他生物不可 比擬的優(yōu)越性：微生物對(duì)外界環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)性和變異能力，人們可利用基因工程和生 物學(xué)技術(shù)按照自己的意愿對(duì)微生物進(jìn)行改造，生產(chǎn)出目的酶；微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求不 高，大部分是農(nóng)產(chǎn)品廢棄物，價(jià)格低廉，易得到，生產(chǎn)成本低；微生物繁殖快，生長(zhǎng)周期短，有 利于提商酶制劑的廣量等。
[0004]研究表明，復(fù)合酶制劑較單一酶制劑能更好地改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能，達(dá)到生物功 能的多樣化。但是，目前所應(yīng)用的復(fù)合酶制劑均由不同的菌株單獨(dú)發(fā)酵生產(chǎn)后按照一定的 比例混合制成，生產(chǎn)成本過高，復(fù)合酶產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，且使用不方便。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方 法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0007]-種枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，包括以下步驟：將枯 草芽孢桿菌菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度34?38 °C、pH值6. 3?6. 8條件下發(fā)酵培 養(yǎng)48?72小時(shí)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：以質(zhì)量百分比計(jì)，乳糖1. 5?2. 5%、NH4C11?2%、 MgS040. 5?0. 7%，余量為水。
[0008]所述發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)選條件為：溫度36°C，pH值6. 5,發(fā)酵時(shí)間60小時(shí)。
[0009] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為：以質(zhì)量百分比計(jì)，乳糖2%、見14(：11.5%、1%5040.6%，余 量為水。
[0010] 所述枯草芽孢桿菌菌液的制備方法為：將活化的枯草芽孢桿菌接種到種子培養(yǎng)基 中，在溫度37°C下（180r/min振蕩）培養(yǎng)18?24小時(shí)；所述種子培養(yǎng)基為：以質(zhì)量百分比 計(jì)，蛋白胨1 %、酵母浸出物〇. 5%、NaClO. 5%，余量為水，pH值7. 2?7. 6。
[0011] 所述枯草芽孢桿菌菌液的濃度為5X108?8X108CFU/ml，接種量為3?6%。優(yōu) 選接種量為4%。
[0012] 所述活化的枯草芽孢桿菌的制備方法為：將凍干保存的枯草芽孢桿菌接種到普通 瓊脂培養(yǎng)基中，在溫度37°c下培養(yǎng)18?24小時(shí)；所述普通瓊脂培養(yǎng)基為：以質(zhì)量百分比 計(jì)，蛋白胨l%、NaC10. 5%、牛肉膏1%、瓊脂粉2%，余量為水，pH值7. 2?7. 6。
[0013]所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌1. 1111 (Bacillus subtilis)，保藏編號(hào)： CCTCCN0:M2011286,保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期：2011年8月11日，保 藏地址：中國(guó)武漢市武漢大學(xué)。
[0014] 所述枯草芽孢桿菌1. 1111 (Bacillus subtilis)能產(chǎn)生木聚糖酶、蛋白酶、植酸 酶、果膠酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶、淀粉酶、纖維素酶等多種酶，并對(duì)膽酸鹽、人工 胃液及腸液等表現(xiàn)很強(qiáng)的耐受性。
[0015] 本發(fā)明的有益效果：
[0016] 本發(fā)明采用枯草芽孢桿菌1. 1111(CCTCCNO:M2011286)為發(fā)酵菌株，通過優(yōu)化發(fā) 酵培養(yǎng)基組成（如碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽）及發(fā)酵培養(yǎng)條件（如發(fā)酵溫度、pH值、發(fā)酵時(shí)間和 接種量），使菌株產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的活性達(dá)到最佳，其中纖維素酶酶活達(dá) 206. 72U/ml，甘露聚糖酶酶活達(dá)1451. 37U/ml，糖化酶酶活達(dá)254. 72U/ml。
[0017] 本發(fā)明采用一菌多酶發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶，能大幅度提高 酶的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，并且由于各種酶來(lái)源于同一菌株，其安全性與復(fù)配性能更 優(yōu)。為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)共發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果膠酶、脂肪酶、甘露聚糖 酶、糖化酶等奠定了基礎(chǔ)，具有重要的研究與開發(fā)意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為本發(fā)明試驗(yàn)例中不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響；
[0019] 圖2為試驗(yàn)例中不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響；
[0020] 圖3為試驗(yàn)例中不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響；
[0021] 圖4為試驗(yàn)例中葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0022] 圖5為試驗(yàn)例中甘露糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下述實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] 本實(shí)施例中枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，包括以下步 驟：
[0026] (1)將凍干保存的枯草芽孢桿菌接種到普通瓊脂培養(yǎng)基中，在溫度37°C下培養(yǎng) 21小時(shí)；枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌1. 1111 (Bacillus subtilis)，保藏編號(hào)：CCTCC N0:M2011286,保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期：2011年8月11日，保藏地 址：中國(guó)武漢市武漢大學(xué)；普通瓊脂培養(yǎng)基為：以質(zhì)量百分比計(jì)，蛋白胨l%、NaC10. 5%、牛 肉膏1%、瓊脂粉2%，余量為水，pH值7. 4;
[0027] (2)挑取活化的枯草芽孢桿菌單個(gè)菌落接種到種子培養(yǎng)基中，在溫度37°C下振蕩 (180r/min)培養(yǎng)21小時(shí)，得到枯草芽孢桿菌菌液，菌液濃度為6X108CFU/ml;種子培養(yǎng)基 為：以質(zhì)量百分比計(jì)，蛋白胨1 %、酵母浸出物〇. 5%、NaClO. 5%，余量為水，pH值7. 4 ;
[0028] (3)將枯草芽孢桿菌菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度36 °C、pH值6. 5條件下發(fā) 酵培養(yǎng)60小時(shí)（180r/min振蕩）；枯草芽孢桿菌菌液的接種量為4%;發(fā)酵培養(yǎng)基為：以質(zhì) 量百分比計(jì)，乳糖2%、NH4C11. 5%、MgS040 . 6%，余量為水。
[0029] 實(shí)施例2
[0030] 本實(shí)施例中枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，包括以下步 驟：將枯草芽孢桿菌菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度38 °C、pH值6. 3條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 小時(shí)（180r/min振蕩）；枯草芽孢桿菌菌液的接種量為3%;發(fā)酵培養(yǎng)基為：以質(zhì)量百分比 計(jì)，乳糖2. 5%、NH4C12%、MgS040. 7%，余量為水?？莶菅挎邨U菌菌液的制備方法同實(shí)施例 1〇
[0031] 實(shí)施例3
[0032] 本實(shí)施例中枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，包括以下步 驟：將枯草芽孢桿菌菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度34°C、pH值6. 8條件下發(fā)酵培養(yǎng)72 小時(shí)（180r/min振蕩）；枯草芽孢桿菌菌液的接種量為6%;發(fā)酵培養(yǎng)基為：以質(zhì)量百分比 計(jì)，乳糖1. 5 %、NH4C11 %、MgS040. 5 %，余量為水。枯草芽孢桿菌菌液的制備方法同實(shí)施例 1〇
[0033] 試驗(yàn)例
[0034] 一、菌種
[0035]菌種：枯草芽孢桿菌 1. 1111(Bacillussubtilis)，保藏編號(hào)：CCTCC N0:M2011286,保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期：2011年8月11日，保藏地 址：中國(guó)武漢市武漢大學(xué)。
[0036] 二、培養(yǎng)基
[0037] 普通瓊脂培養(yǎng)基：以質(zhì)量百分比計(jì)，蛋白胨1%、NaClO. 5%、牛肉膏1 %、瓊脂粉 2%，余量為水，pH值7.2?7.6;
[0038] 種子培養(yǎng)基：以質(zhì)量百分比計(jì)，蛋白胨1 %、酵母浸出物0. 5%、NaClO. 5%，余量為 水，pH值 7. 2 ?7.6 ;
[0039] 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：以質(zhì)量百分比計(jì)，蔗糖1 %、蛋白胨1%、NaClO. 5%，余量為水， pH值 7. 2 ?7. 6。
[0040] 三、枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的培養(yǎng)基組分、用量及發(fā)酵條 件優(yōu)化試驗(yàn)
[0041] 1、菌種的活化
[0042] 將凍干保存的枯草芽孢桿菌（CCTCCN0:M2011286)接種到普通瓊脂培養(yǎng)基中，在 溫度37°C下培養(yǎng)18?24小時(shí)，觀察結(jié)果，保存?zhèn)溆谩?br> [0043] 2、種子液的制備
[0044] 挑取活化的枯草芽孢桿菌單個(gè)菌落接種到種子培養(yǎng)基中，在溫度37°C下振蕩 (180r/min)培養(yǎng)18?24小時(shí)，觀察結(jié)果，保存?zhèn)溆谩?br> [0045] 3、分別將種子液按5%比例接入不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度37°C下振蕩（180r/ min)培養(yǎng)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組分、用量進(jìn)行優(yōu)化，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。
[0046]4、單因素試驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基組分
[0047] (1)不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響
[0048] 分別采用2%可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖作為碳源，替代基礎(chǔ)發(fā)酵培 養(yǎng)基中1 %蔗糖，培養(yǎng)基其他組分及用量不變。接種枯草芽孢桿菌，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)，取5ml枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，4000r/min離心lOmin，取上清液按體積比1:6 (1:5?1:8均 可）用乙酸-乙酸鈉稀釋后得到粗酶液，分別在540nm下測(cè)纖維素酶、甘露聚糖酶及糖化酶 的〇〇 54(|值，以確定最佳碳源，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。以不加碳源的培養(yǎng)基為空白對(duì)照。
[0049]從圖1可知，蔗糖為碳源時(shí)，甘露聚糖酶酶活最高；葡萄糖為碳源時(shí)，纖維素酶酶 活最高；乳糖為碳源時(shí)，甘露聚糖酶酶活最高。綜合各酶酶活，以乳糖為碳源的培養(yǎng)基中 各種酶的吸光值均較高，因此，乳糖是菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的最優(yōu)碳 源。
[0050] (2)不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響
[0051] 分別采用1%胰蛋白胨、酵母膏、（NH4)2S04、NH4N03、NH4C1替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng) 基中1%蛋白胨，培養(yǎng)基其他組分及用量不變。接種枯草芽孢桿菌，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)， 取5ml枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，4000r/min離心lOmin，取上清液按體積比1:6用乙酸-乙酸 鈉稀釋后得到粗酶液，分別在540nm下測(cè)纖維素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的0D54(I值，以確定 最佳氮源，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。以不加氮源的培養(yǎng)基為空白對(duì)照。
[0052] 由圖2可知，以NH4C1為氮源時(shí)，糖化酶酶活最高；以（NH4)2S04S氮源時(shí)，甘露聚 糖酶酶活最高；以NH4N03為氮源時(shí)，纖維素酶酶活最高。綜合各酶酶活，以NH4C1為氮源時(shí)， 纖維素酶、甘露聚糖酶及糖化酶酶活均相對(duì)較高。
[0053] (3)不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響
[0054] 分別采用0. 5%K2HP04、MgS04、FeS04替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中0. 5%NaCl，培養(yǎng)基其 他組分及用量不變。接種枯草芽孢桿菌，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)，取5ml枯草芽孢桿菌發(fā)酵 液,4000r/min離心lOmin,取上清液按體積比1:6用乙酸-乙酸鈉稀釋后得到粗酶液，分別 在540nm下測(cè)纖維素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的(?54(|值，以確定最佳無(wú)機(jī)鹽，試驗(yàn)結(jié)果見圖 3。以不加無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基為空白對(duì)照。
[0055] 由圖3可知，在以NaCl為無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，菌株產(chǎn)的甘露聚糖酶活性最高；在以 FeS04為無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，菌株產(chǎn)的纖維素酶活性最高；在以MgS04為無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中， 菌株產(chǎn)的糖化酶活性最高。綜合各酶酶活，以MgS04為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，纖維素酶、甘露聚糖酶及 糖化酶活性均相對(duì)較高。
[0056] 5、正交試驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基配方
[0057] 以單因素試驗(yàn)結(jié)果確定培養(yǎng)基組分，改變各組分的濃度，配制不同的培養(yǎng)基（濃 度設(shè)置見下見表1)。接種枯草芽孢桿菌，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)，取5ml枯草芽孢桿菌發(fā)酵 液,4000r/min離心lOmin,取上清液按體積比1:6用乙酸-乙酸鈉稀釋后得到粗酶液，分別 在540nm下測(cè)纖維素酶、甘露聚糖酶及糖化酶的0D54(I值，以確定最佳培養(yǎng)基配方，極差分析 結(jié)果見下表2。
[0058] 表1發(fā)酵培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)L9 (34)設(shè)計(jì)
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其特征在于：包括以 下步驟：將枯草芽孢桿菌菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度34?38 °C、pH值6. 3?6. 8 條件下發(fā)酵培養(yǎng)48?72小時(shí)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：以質(zhì)量百分比計(jì)，乳糖1. 5?2. 5%、 NH4C11 ?2%、MgS040. 5 ?0? 7%，余量為水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其 特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：溫度36°C，pH值6. 5,發(fā)酵時(shí)間60小時(shí)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其 特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：以質(zhì)量百分比計(jì)，乳糖2 %、NH4C11. 5 %、MgS040 . 6 %，余量為 水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其 特征在于：所述枯草芽孢桿菌菌液的濃度為5 X 108?8 X 108CFU/ml，接種量為3?6 %。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的 方法，其特征在于：所述枯草芽孢桿菌菌液的制備方法為：將活化的枯草芽孢桿菌接種到 種子培養(yǎng)基中，在溫度37°C下培養(yǎng)18?24小時(shí)；所述種子培養(yǎng)基為：以質(zhì)量百分比計(jì)，蛋 白胨1%、酵母浸出物〇? 5%、NaC10. 5%，余量為水，pH值7. 2?7. 6。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶、甘露聚糖酶和糖化酶的方法，其 特征在于：所述活化的枯草芽孢桿菌的制備方法為：將凍干保存的枯草芽孢桿菌接種到普 通瓊脂培養(yǎng)基中，在溫度37°C下培養(yǎng)18?24小時(shí)；所述普通瓊脂培養(yǎng)基為：以質(zhì)量百分比 計(jì)，蛋白胨l%、NaC10. 5%、牛肉膏1%、瓊脂粉2%，余量為水，pH值7. 2?7. 6。
【文檔編號(hào)】C12N9/34GK104328097SQ201410342627
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月17日
【發(fā)明者】劉一塵, 張謙, 丁軻, 趙敏, 張春杰, 余祖華, 程相朝, 汪洋, 李小康, 何雷, 宋敏杰, 白羽, 邢廣源, 王亞洲, 李毅恒, 張玉香 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)