一種蟲草抗菌肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物領域，具體而言，涉及一種蟲草抗菌肽及其制備方法。該一種蟲草抗菌肽，所述蟲草抗菌肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。本發(fā)明提供的一種蟲草抗菌肽，其從蛹蟲草菌株中分離得到，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；經過抗菌實驗測定，其對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有抑菌作用，體現(xiàn)出了抑菌活性，實現(xiàn)了從蛹蟲草中獲取具有抑菌活性的抗菌肽的技術效果，進而可進行全面的推廣應用。
【專利說明】一種蟲草抗菌肽及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領域，具體而言，涉及一種蟲草抗菌肽及其制備方法。
【背景技術】
[0002]抗菌肽是生物體免疫系統(tǒng)為抵御外源性病原微生物入侵而產生的一類多肽物質，是先天免疫的重要組成成分。目前，在抗菌肽數(shù)據(jù)庫(Antimicrobial Peptide Database,APD)中已經有2353條抗菌肽，其中有215個細菌素，305個植物抗菌肽，12個真菌抗菌肽和1773個動物宿主防御肽。
[0003]由于抗菌肽能夠抑制革蘭氏陽性和陰性細菌、真菌、病毒及寄生物等。此外，抗菌肽還對免疫系統(tǒng)具有調控作用。相比傳統(tǒng)抗生素抗菌肽具有抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性好、殺菌快速、作用專一、多樣化的應用潛力以及不易產生耐藥性等優(yōu)點。因此，抗菌肽有望成為新型的抗菌藥物。目前，已有幾種抗菌肽進入臨床研究，多種抗菌肽應用于食品保鮮以及飼料添加劑。
[0004]抗菌肽的分布極為廣泛，在病毒、細菌到植物、昆蟲、軟體動物、甲殼動物、兩棲動物、魚類、鳥類及哺乳動物等生物中均有發(fā)現(xiàn)。具體的，抗菌肽是由基因編碼的一類多肽。所有抗菌肽均是由一段包含信號序列的前體翻譯后修飾而來。在不同生物體內，分泌抗菌肽的部位不盡相同，抗菌肽的氨基酸組成也相差甚遠。根據(jù)其氨基酸組成及結構特點，一般將抗菌肽分為以下五種類型:線性陽離子α-螺旋抗菌肽、富含特殊氨基酸的陽離子抗菌肽、含有二硫鍵的抗菌肽 、陰離子抗菌肽、大型蛋白質的片段。α -螺旋型抗菌肽是其中一大類，在自然界廣泛存在，它們與細菌細胞膜互作，依靜電引力靠近并結合在質膜表面，隨之疏水結構域插入質膜中，當抗菌肽達到一定濃度后，通過分子聚集和膜內分子間相互位移破壞細胞膜穩(wěn)定性，增加膜通透性，形成離子通道，引起去極化；或形成較大通道，使細胞內容物外泄，最終導致細胞死亡。
[0005]蛹蟲草是藥食兩用的新資源食品，是唯一實現(xiàn)規(guī)?；斯しN植的蟲草真菌。研究表明，蟲草多肽在毫克水平就能發(fā)揮作用，安全評價藥理和功能檢測結果也證明蟲草多肽無毒、無副作用、營養(yǎng)價值和生物利用率均極高。因此，以蛹蟲草為研究材料，制取蟲草多肽，并進行應用是相關領域中的研究熱點。
[0006]在相關技術中，通常利用堿性蛋白酶水解蛹蟲草子座熱水浸提蟲草素后的剩余物；再通過電泳進行分離純化，獲得分子量在3180~5620之間的多肽混合物。這些多肽混合物雖具有一定的清除自由基、抗脂質過氧化的能力；但是，均不能體現(xiàn)出抑菌活性。進而嚴重了限制了其推廣應用。
[0007]綜上，以蛹蟲草為了來源，制取一種具有抑菌活性的蟲草抗菌肽是本領域亟待解決的一個技術問題。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種蟲草抗菌肽及其制備方法，以解決上述的問題。[0009]在本發(fā)明的實施例中提供了一種蟲草抗菌肽，其從蛹蟲草菌株中分離得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；經過抗菌實驗測定，其對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有抑菌作用，體現(xiàn)出了抑菌活性，實現(xiàn)了從蛹蟲草中獲取具有抑菌活性的抗菌肽的技術效果，進而可進行全面的推廣應用。
[0010]本發(fā)明的實施例中提供的這種蟲草抗菌肽的制備方法具體包括以下步驟:
[0011]步驟A:將蛹蟲草菌株斜面菌種接入到薩氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至產生斜面孢子；利用無菌水將得到的所述斜面孢子洗下，并轉接到三角瓶中，振蕩培養(yǎng)，得到孢子懸液；
[0012]步驟B:將所述孢子懸液轉接到薩氏液體培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)之后靜置、過濾，得到菌絲體；
[0013]步驟C:將所述菌絲體烘干至粉末狀后加入蒸餾水，提取過夜后過濾，得到濾液；
[0014]步驟D:將所述濾液進行旋轉蒸發(fā)濃縮，并同時加入飽和硫酸銨溶液，靜置后離心，得到第一濃縮液，在所述第一濃縮液中再次加入飽和硫酸銨溶液，得到預定飽和度的第二濃縮液，將所述第二濃縮液離心，得到沉淀樣品，在所述沉淀樣品中加入蒸餾水進行溶解，得到樣品溶解液 ；將所述樣品溶解液利用蒸餾水透析后冷凍干燥，得到粗蛋白樣品；
[0015]步驟E:將所述粗蛋白樣品利用CM-52陽離子交換柱進行洗脫，得到洗脫組份，再將洗脫組份透析后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到14KD的蛋白質條帶；
[0016]步驟F:切下所述蛋白質條帶，并進行液質聯(lián)用質譜檢測，得到質譜數(shù)據(jù)，并進行分析，得到蟲草抗菌肽及其序列。
[0017]通過發(fā)明實施例提供的這種制備方法可實現(xiàn)以蛹蟲草菌株為來源，獲得具有抑菌活性的蟲草抗菌肽。
[0018]可選的，在步驟A中:所述薩氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基，按照重量份數(shù)計，其有效組份包括:
[0019]麥芽糖4-6份、蛋白胨8-12份、酵母膏4_6份、瓊脂18-22份、葡萄糖18-22份、水900-1100 份。
[0020]可選的，在步驟A中:
[0021]所述將蛹蟲草菌株斜面菌種接入到薩氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至產生斜面孢子具體包括:
[0022]將蛹蟲草菌株斜面菌種接入到薩氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基中，在25°C 土TC培養(yǎng)4-5 天。
[0023]可選的，在步驟B中:
[0024]所述孢子懸液與所述薩氏液體培養(yǎng)基的體積比為1:10 ;
[0025]所述恒溫振蕩培養(yǎng)的條件為:培養(yǎng)溫度為25_27°C，培養(yǎng)時間為4-5天，轉速為180-220r/min ；
[0026]所述靜置的時間為6-12小時。
[0027]可選的，在步驟C中，具體包括:稱取干燥菌絲體粉末，按質量比為1:8-14的比例加入蒸餾水，并在4°C提取過夜，過濾后，得到所述濾液。
[0028]可選的，在步驟D中:
[0029]所述將所述第二濃縮液離心，得到沉淀樣品具體包括:將所述第二濃縮液靜置后在8000r/min的轉速下離心18-22分鐘,除去上清液，得到所述沉淀樣品。
[0030]可選的，在步驟E中的所述SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中:
[0031]濃縮膠的濃度為10-16%、分離膠的濃度為4-5%、染色液為考馬斯亮藍R-250。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1示出了本發(fā)明實施例一提供的制備方法的流程圖；
[0033]圖2示出了本發(fā)明實施例二提供的制備方法中獲得的蟲草多肽的質譜數(shù)據(jù)圖。
【具體實施方式】
[0034]在本發(fā)明中，蟲草抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，具體的，其氨基酸序列為-M-A-1-T-A-A-K-V-L-E-T-R-;其命名為 cordyampin-2。分子式為 C56Hltl2N16O17S1,分子量為1303.59，為a-螺旋結構，疏水率30%，靜電荷為+1，90°C時穩(wěn)定。
[0035]下面通過具體的實施例子并結合附圖對本發(fā)明提供的這種蟲草抗菌肽的制備方法做進一步的詳細描述。
[0036]實施例一
[0037]在本發(fā)明的實施例中提供了一種蟲草抗菌肽的制備方法，包括以下步驟，請參考圖1:
[0038]步驟101:將蛹蟲草菌株斜面菌種接入到薩氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至產生斜面孢子；利用無菌水將得到的所述斜面孢子洗下，并轉接到三角瓶中，振蕩培養(yǎng)，得到孢子懸液；
[0039]在步驟101中，通過薩氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)，蛹蟲草菌株斜面菌種會生長至產生大量的斜面孢子，然后再利用無菌水即可將斜面孢子洗下，在進行振蕩培養(yǎng)，即可得到孢子懸液，備用。
[0040]步驟102:將所述孢子懸液轉接到薩氏液體培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)之后靜置、過濾，得到菌絲體；
[0041]得到的孢子懸液通過薩氏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)之后，再進行振蕩培養(yǎng)后過濾(去除濾液)，即可得到蛹蟲草菌種菌絲體，備用。
[0042]步驟103:將所述菌絲體烘干至粉末狀后加入蒸餾水，提取過夜后過濾，得到濾液。
[0043]得到的菌絲體通過烘干之后，需用蒸餾水對其進行溶解(在4°C過夜提取)，過濾取濾液，再進行旋轉蒸發(fā)濃縮。
[0044]步驟104:將所述濾液進行旋轉蒸發(fā)濃縮，并同時加入飽和硫酸銨溶液，靜置后離心，得到第一濃縮液，在所述第一濃縮液中再次加入飽和硫酸銨溶液，得到預定飽和度的第二濃縮液，將所述第二濃縮液離心，得到沉淀樣品，在所述沉淀樣品中加入蒸餾水進行溶解，得到樣品溶解液；將所述樣品溶解液利用蒸餾水透析后冷凍干燥，得到粗蛋白樣品。
[0045]步驟104為通過旋轉蒸發(fā)濃縮將菌絲體制備成粗蛋白樣品的操作，具體的，在加入飽和硫酸銨溶液的過程中，需要緩慢加入，且第一濃縮液具體為濃縮汁飽和度為35%的液體；第二濃縮液為濃縮至飽和度為70%的液體。在得到第一濃縮液的過程中，加入了飽和硫酸銨溶液的濾液需靜置6-8小時，然后再在8000r/min離心20min，取上清棄沉淀，獲得第一濃縮液。根據(jù)上清體積(第一濃縮液)再次加入飽和硫酸銨溶液至70%飽和度，充分攪拌后，4°C冰箱靜置過夜，再次離心(8000r/min離心20min)取沉淀，此為35-70%飽和度的硫Ife按沉淀樣品。
[0046]步驟105:將所述粗蛋白樣品利用CM-52陽離子交換柱進行洗脫，得到洗脫組份，再將洗脫組份透析后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到14KD的蛋白質條帶。
[0047]粗蛋白樣品再溶(20mmol/L pH6.0PBS緩沖液)后利用CM-52陽離子交換柱進行洗脫，得到洗脫組份；洗脫組份經過透析(具體為水透析)、凍干(至粉末狀)后，再進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為15%，上樣量25微升)，得到14KD的蛋白質條帶。
[0048]步驟106:切下所述蛋白質條帶，并進行液質聯(lián)用質譜檢測，得到質譜數(shù)據(jù)，并進行分析，得到蟲草抗菌肽及其序列。
[0049]具體的，在步驟106中，肽段檢測的操作可以利用液質聯(lián)用質譜(tandem highperformance liquid chromatography with mass spectrometry, LC-MS/MS)檢測，獲得的質譜數(shù)據(jù)利用DataAnalysis軟件標峰后，進行分析，即可獲得知曉其序列的蟲草抗菌肽。
[0050]接下來，為了使得本發(fā)明實施例一的制備方法得到更好的應用，本發(fā)明還在上述實施例一的基礎之上提供了實施例二，實施例二是實施例一的蟲草抗菌肽的進一步限定和增加，現(xiàn)做詳細的闡述和解釋，請參考圖1-圖2:
[0051]實施例二 [0052]本實施例的蟲草抗菌肽包括以下步驟:
[0053]1、將蛹蟲草菌株斜面菌種接入到薩氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至產生斜面孢子；利用無菌水將得到的所述斜面孢子洗下，并轉接到三角瓶中，振蕩培養(yǎng)，得到孢子懸液；
[0054]具體的，在該步驟中，所述薩氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基，按照重量份數(shù)計，其有效組份包括:麥芽糖4-6份、蛋白胨8-12份、酵母膏4-6份、瓊脂18-22份、葡萄糖18-22份、水900-1100份；更具體的，麥芽糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、瓊脂20g、葡萄糖20g、水1000ml，pH 自然，121。。，滅菌 20min。
[0055]在所述將蛹蟲草菌株斜面菌種接入到薩氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至產生斜面孢子具體包括:將蛹蟲草菌株斜面菌種接入到薩氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基中，在250C ±1°C培養(yǎng) 4-5 天。
[0056]2、將所述孢子懸液轉接到薩氏液體培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)之后靜置、過濾，得到菌絲體。
[0057]具體的，步驟2按照以下具體步驟操作:按照10% (v/v)將孢子懸液接種于裝有250ml薩氏液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，26°C，200r/min,恒溫振蕩培養(yǎng)4d，然后靜置培養(yǎng)6-12d。過濾得蛹蟲草菌株Cmamp-1菌絲體。
[0058]3、將所述菌絲體烘干至粉末狀后加入蒸餾水，提取過夜后過濾，得到濾液。
[0059]具體的，上述步驟具體按照以下操作進行:將菌絲體在40°C -60°C烘干得到蛹蟲草菌株Cmamp-1干菌絲體，然后再稱取干燥菌絲體粉末，按質量比為1:8-14的比例加入蒸餾水，并在4 °C提取過夜，過濾后，得到濾液。
[0060]4、所述濾液進行旋轉蒸發(fā)濃縮，并同時加入飽和硫酸銨溶液，靜置后離心，得到第一濃縮液，在所述第一濃縮液中再次加入飽和硫酸銨溶液，得到預定飽和度的第二濃縮液，將所述第二濃縮液離心，得到沉淀樣品，在所述沉淀樣品中加入蒸餾水進行溶解，得到樣品溶解液；將所述樣品溶解液利用蒸餾水透析后冷凍干燥，得到粗蛋白樣品。
[0061]具體的，上述步驟按照以下操作進行:將濾液進行旋轉蒸發(fā)濃縮，根據(jù)濃縮液體積緩慢加入飽和硫酸銨溶液至35%飽和度，4°C冰箱靜置6-8h，8000r/min離心18-22分鐘，取上清棄沉淀。根據(jù)上清體積再次加入飽和硫酸銨溶液至70%飽和度，充分攪拌后，4°C冰箱靜置過夜，再如前法離心(8000r/min離心18-22分鐘)取沉淀，此為35-70%飽和度的硫酸銨沉淀樣品。加入適量蒸餾水將沉淀重新溶解，裝入已預處理的透析袋內，用蒸餾水4°C透析，透析過夜徹底除去硫酸銨離子，冷凍干燥得到粗蛋白樣品。
[0062]5、將所述粗蛋白樣品利用CM-52陽離子交換柱進行洗脫，得到洗脫組份，再將洗脫組份透析后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到14KD的蛋白質條帶。
[0063]具體的，在改步驟中，具體按照以下操作進行洗脫:凍干的粗蛋白樣品用20mmol/L pH6.0PBS緩沖液溶解，上樣預先用20mmol/L pH6.0PBS緩沖液平衡好的CM-52陽離子交換柱，流動相是20mmol/LPBS緩沖液，ρΗ6.0,并加入NaCl至濃度梯度為0.1,0.3,0.6、
0.9mol/L，流速15ml/h，收集組分。操作前將流動相和樣品溶液過濾(0.22um)。組分檢測波長280nm，室溫進行。從柱子上洗脫得到Cm-Ol蛋白質組分(即洗脫組份)。將Cm-Ol蛋白質組分轉入透析袋用水透析12h，取出凍干得到Cm-Ol蛋白質組分凍干樣品。
[0064]對Cm-Ol蛋白質組分凍干樣品的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作條件具體為:將Cm-Ol蛋白質組分凍干樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠濃度為4-5%，分離膠濃度為10-16%，上樣 量25uL ；電泳條件為濃縮膠70V下電泳40min，分離膠電泳4_5h，用考馬斯亮藍R-250染色，甲醇-乙酸為脫色液)，得到約14KD的蛋白質條帶；通過上述的洗脫以及電泳操作，即可獲得14KD的蛋白質條帶(即蟲草抗菌肽)。
[0065]6、切下所述蛋白質條帶，并進行液質聯(lián)用質譜檢測，得到質譜數(shù)據(jù)，并進行分析，得到蟲草抗菌肽及其序列。
[0066]具體的，在該步驟中，切下SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳14KD的蛋白質膠條，用液質聯(lián)用質譜(tandem high performance liquid chromatography with massspectrometry, LC-MS/MS)檢測。檢測條件如下:
[0067]1、還原烷基化蛋白質消化操作流程
[0068]a.將膠點樣品加50 μ L DD.H2O洗兩次，1min/次；
[0069]b.加50mM NH4HCO3/乙腈=1:1溶液(考染脫色液)50 μ L，超聲脫色5min或37°C脫色20min,吸干；
[0070]c.重復步驟2，直至藍色褪去；
[0071 ] d.加乙腈50 μ L脫水至膠粒完全變白，真空抽干1min ；
[0072]e.力卩 1mM DTT (10 μ LlM DTT, 990 μ L25mM NH4HCO3 配制)20 μ L，56°C水浴 Ih ；
[0073]f.冷卻到室溫后，吸干，快速加 55mM IAM(55 μ LlM ΙΑΜ, 945 μ L25mM NH4HCO3 配制)20 μ L，置于暗室45min ；
[0074]g.依次用 25禮 NH4HCO3 (2X10 分鐘)、25禮 NH4HC03+50 % 乙腈溶液(2XlO 分鐘)和乙腈洗(10分鐘)，乙腈脫水到膠粒完全變白為止，真空抽干1min ；
[0075]h.將0.1 μ g/ μ L的酶儲液以25mM NH4HCO3稀釋10~20倍，每EP管加2~3 μ L，稍微離心一下，讓酶液充分與膠粒接觸，4°C或冰上放置30min，待溶液被膠塊完全吸收，加25mM NH4HCO3至總體積10-15 μ L置37°C，消化過夜；
[0076]1.加入I % TFA終止反應，使TFA終濃度為0.1 %，振蕩混勻，離心，上清液為進樣樣品。
[0077]2、LC_MS/MS 鑒定
[0078]取1ul進樣樣品上機進行LC-MS/MS檢測，具體儀器型號和參數(shù)如下:
[0079]液相:prominence nano2D (shimazhu)
[0080]柱料:Cl8,5Um, I5OA (Eprogen)
[0081]流速:400nl/min
[0082]液相梯度:
[0083]
【權利要求】
1.一種蟲草抗菌肽，其特征在于，所述蟲草抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一種根據(jù)權利要求1所述的蟲草抗菌肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟A:將蛹蟲草菌株斜面菌種接入到薩氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至產生斜面孢子；利用無菌水將得到的所述斜面孢子洗下，并轉接到三角瓶中，振蕩培養(yǎng)，得到孢子懸液； 步驟B:將所述孢子懸液轉接到薩氏液體培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)之后靜置、過濾，得到菌絲體； 步驟C:將所述菌絲體烘干至粉末狀后加入蒸餾水，提取過夜后過濾，得到濾液； 步驟D:將所述濾液進行旋轉蒸發(fā)濃縮，并同時加入飽和硫酸銨溶液，靜置后離心，得到第一濃縮液，在所述第一濃縮液中再次加入飽和硫酸銨溶液，得到預定飽和度的第二濃縮液，將所述第二濃縮液離心，得到沉淀樣品，在所述沉淀樣品中加入蒸餾水進行溶解，得到樣品溶解液；將所述樣品溶解液利用蒸餾水透析后冷凍干燥，得到粗蛋白樣品； 步驟E:將所述粗蛋白樣品利用CM-52陽離子交換柱進行洗脫，得到洗脫組份，再將洗脫組份透析后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到13KD的蛋白質條帶； 步驟F:切下所述蛋白質條帶，并進行液質聯(lián)用質譜檢測，得到質譜數(shù)據(jù)，并進行分析，得到蟲草抗菌肽及其序列。
3.根據(jù)權利要 求2所述的蟲草抗菌肽的制備方法，其特征在于，在步驟A中:所述薩氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基，按照重量份數(shù)計，其有效組份包括: 麥芽糖4-6份、蛋白胨8-12份、酵母膏4-6份、瓊脂18-22份、葡萄糖18-22份、水900-1100 份。
4.根據(jù)權利要求3所述的蟲草抗菌肽的制備方法，其特征在于，在步驟A中: 所述將蛹蟲草菌株斜面菌種接入到薩氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至產生斜面孢子具體包括: 將蛹蟲草菌株斜面菌種接入到薩氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基中，在25°C ± 1°C培養(yǎng)4-5天。
5.根據(jù)權利要求4所述的蟲草抗菌肽的制備方法，其特征在于，在步驟B中: 所述孢子懸液與所述薩氏液體培養(yǎng)基的體積比為1:10 ; 所述恒溫振蕩培養(yǎng)的條件包括:培養(yǎng)溫度為25-27 °C，培養(yǎng)時間為4-5天，轉速為180-220r/min ； 所述靜置的時間為6-12小時。
6.根據(jù)權利要求2-5任一項所述的蟲草抗菌肽的制備方法，其特征在于，在步驟C中，具體包括:稱取干燥菌絲體粉末，按質量比為1:8-14的比例加入蒸餾水，并在4°C提取過夜，過濾后，得到所述濾液。
7.根據(jù)權利要求6所述的蟲草抗菌肽的制備方法，其特征在于，在步驟D中: 所述將所述第二濃縮液離心，得到沉淀樣品具體包括:將所述第二濃縮液靜置后在8000r/min的轉速下離心18-22分鐘,除去上清液，得到所述沉淀樣品。
8.根據(jù)權利要求7所述的蟲草抗菌肽的制備方法，其特征在于，在步驟E中的所述SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中: 濃縮膠的濃度為10-16%、分離膠的濃度為4-5%、染色液為考馬斯亮藍R-250。
【文檔編號】C12R1/645GK104031121SQ201410276114
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月19日 優(yōu)先權日:2014年6月19日
【發(fā)明者】周禮紅, 高燕燕, 丁旭 申請人:周禮紅