基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型檢測(cè)方法及試劑盒。所述的方法包括PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化、單堿基延伸的步驟；所述的試劑盒包括PCR擴(kuò)增試劑、PCR產(chǎn)物純化試劑和單堿基延伸反應(yīng)試劑。本發(fā)明的方法和試劑盒能夠簡(jiǎn)捷、直觀、準(zhǔn)確的檢測(cè)小鼠肝炎病毒分型，靈敏度高，臨床樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確性為100%，特異性強(qiáng)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，快速高效，可應(yīng)用于臨床檢測(cè)工作。
【專利說(shuō)明】基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型檢測(cè)方法及試劑 合 Sl

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及基于SNaPshOt技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型 檢測(cè)方法及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 小鼠肝炎病毒（Murine H印atitis Virus, MHV)為RNA病毒，是清潔級(jí)及以上級(jí)別 實(shí)驗(yàn)小鼠微生物檢測(cè)中的必檢項(xiàng)目，其主要包括4個(gè)常見(jiàn)毒株，即MHVp MHV3、JHM、A59。MHV 感染可引起小鼠病毒性腦炎、病毒性肝炎或病毒性腸炎。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB14922. 2-2011)規(guī)定 小鼠每三個(gè)月至少檢測(cè)一次MHV，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性者，將直接淘汰。檢測(cè)MHV是控制實(shí)驗(yàn)小 鼠質(zhì)量的重要舉措。
[0003] 不同的MHV毒株因其嗜組織性不同而導(dǎo)致感染小鼠后具有不同的致病性，如MHVl 和MHV3為嗜肝性，JHM為嗜神經(jīng)毒性，A59同時(shí)具有嗜神經(jīng)毒性和嗜肝性。不同的毒株感染 小鼠可建立不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，如MHV 3可誘導(dǎo)建立小鼠爆發(fā)型或病毒性肝炎模型，A59感 染可構(gòu)建因慢性病毒性肝炎誘發(fā)肝組織脂肪變性的動(dòng)物模型和濕熱證小鼠模型。不同的毒 株感染將對(duì)不同的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生不同的影響，如在應(yīng)用仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞干擾素分泌 的研究中，MHV 3的感染將增強(qiáng)仙臺(tái)病毒的易感性，在T細(xì)胞缺陷鼠免疫學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中， A59感染將導(dǎo)致其巨型膠質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等清除病毒抗原的能力延遲。建立MHV常見(jiàn)毒株 的分型檢測(cè)技術(shù)對(duì)保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性具有重要意義。
[0004] 小鼠肝炎病毒具有潛伏期，發(fā)病傳播均無(wú)明顯規(guī)律，故極易引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大范圍 爆發(fā)性感染。目前，用于MHV檢測(cè)的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫酶試驗(yàn)和免疫熒光 試驗(yàn)。此類方法雖然操作簡(jiǎn)便，但是不適用于免疫缺陷小鼠或處于MHV感染初期的小鼠的 檢測(cè)。最重要的是，現(xiàn)今所能用于MHV檢測(cè)的方法均不能對(duì)MHV常見(jiàn)毒株感染的具體情況 進(jìn)行分型檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒 分型檢測(cè)方法，該方法能夠簡(jiǎn)捷、直觀、準(zhǔn)確的檢測(cè)小鼠肝炎病毒分型，MHV cDNA最低檢測(cè) 濃度為I. 25ng/^L，靈敏度高；臨床樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確性為100%。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種檢測(cè)小鼠肝炎病毒分型的試劑盒，操作方便快 捷，可應(yīng)用于臨床檢測(cè)工作。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為： 基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型檢測(cè)方法，具體包括以下步驟： I) PCR擴(kuò)增 以樣本MHV病毒RNA的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有目的基因的PCR產(chǎn)物；所 述PCR擴(kuò)增采用的是序列為SEQ ID No :1和SEQ ID No :2的PCR引物，和/或序列為SEQ ID No :3 和 SEQ ID No :4 的 PCR 引物； 2) PCR產(chǎn)物純化 對(duì)步驟1)中得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化PCR產(chǎn)物； 3) 單堿基延伸 使用單堿基延伸酶、ddNTPs、延伸反應(yīng)緩沖液和特異性的單堿基延伸引物對(duì)步驟2)中 得到的純化PCR產(chǎn)物進(jìn)行單堿基延伸；延伸完畢后，向反應(yīng)體系中加入蝦堿性磷酸酶SAP處 理，得處理液I，取處理液I，加入Lizl20 size standard內(nèi)標(biāo)和Hi-Di甲酰胺處理，得處 理液II，取處理液II進(jìn)行測(cè)序儀電泳分析所述樣本的基因型，進(jìn)而得出樣本分型結(jié)果；所述 特異性的單堿基延伸引物為T(mén)1、T2、T3和T4中的一條或多條，所述T1、T2、T3和T4的序列 如 SEQ IDNo:5、SEQ ID No:6、SEQ ID Νο:7 和 SEQ ID Νο:8 所示，所述 ddNTPs 進(jìn)行熒光標(biāo) 記，所述T1、T2、T3和T4序列中的一個(gè)或多個(gè)序列的5'端用poly T修飾。本發(fā)明中，單 堿基延伸引物用不同數(shù)量的PolyT修飾，經(jīng)SNaPshot反應(yīng)，延伸引物后一個(gè)堿基而停止，四 種堿基用不同顏色熒光標(biāo)記，經(jīng)測(cè)序儀電泳后，通過(guò)位置和顏色組合，可直接判斷樣本基因 型。PCR引物和特異性的單堿基延伸引物詳見(jiàn)表1和表2。
[0008] 表I MHV PCR擴(kuò)增引物

【權(quán)利要求】
1. 基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型檢測(cè)方法，其特征在于，具體包括以下步 驟： 1. PCR擴(kuò)增 以樣本MHV病毒RNA的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有目的基因的PCR產(chǎn)物；所 述PCR擴(kuò)增采用的是序列為SEQ ID No:l所示的P1和SEQ ID No:2所示的P2 PCR引物， 和/或序列為SEQ ID No :3所示的P3和SEQ ID No :4所示的P4PCR引物； 2. PCR產(chǎn)物純化 對(duì)步驟1)中得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化PCR產(chǎn)物； 3) 單堿基延伸 使用單堿基延伸酶、ddNTPs、延伸反應(yīng)緩沖液和特異性的單堿基延伸引物對(duì)步驟2)中 得到的純化PCR產(chǎn)物進(jìn)行單堿基延伸；延伸完畢后，向反應(yīng)體系中加入蝦堿性磷酸酶SAP處 理，得處理液I，取處理液I，加入Liz 120 size standard內(nèi)標(biāo)和Hi-Di甲酰胺處理，得處 理液II，取處理液II進(jìn)行測(cè)序儀電泳分析所述樣本的基因型，進(jìn)而得出樣本分型結(jié)果；所述 特異性的單堿基延伸引物為T(mén)1、T2、T3和T4中的一條或多條，所述T1、T2、T3和T4的序列 如 SEQ IDNo:5、SEQ ID No:6、SEQ ID Νο:7 和 SEQ ID Νο:8 所示，所述 ddNTPs 進(jìn)行熒光標(biāo) 記，所述T1、T2、T3和T4序列中的一個(gè)或多個(gè)序列的5'端用poly T修飾。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型檢測(cè)方法，其特征在 于：所述步驟1)中，所述MHV病毒為MHVpMHVyJHM和A 59中的一種或多種，所述MHVpMHVy JHM、A59病毒的基因序列分別為CGCT、TATT、TGCT、TGTC。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型檢測(cè)方法，其特征在 于：所述步驟3)中，所述特異性的單堿基延伸引物為T(mén)1、T2、T3和T4,所述T1引物上poly T修飾的數(shù)量為0個(gè)，所述T2引物上poly T修飾的數(shù)量為3或5個(gè)，所述T3引物上poly T修飾的數(shù)量為10,所述T4引物上poly T修飾的數(shù)量為15。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型檢測(cè)方法，其特征在 于：所述T1、T2、T3和T4引物摩爾比例為2:3:2. 5:5。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型檢測(cè)方法，其特征 在于：所述步驟1)中，所述PCR擴(kuò)增的條件為：第一步：94°C處理5min ;第二步：按照94°C 30s，51°C 30s，72°C 45s，進(jìn)行 32 個(gè)循環(huán)；最后：72°C 處理 7min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型檢測(cè)方法，其特征在 于：所述步驟2)中，所述純化的步驟為：步驟1)得到的PCR產(chǎn)物，加入SAP和位 〇 I混勻， 于PCR儀中37° C處理lh，再于75° C處理15min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型檢測(cè)方法，其特征在 于：所述步驟3)中，所述單堿基延伸的條件為PCR儀中按照96°C 10s，50°C 10s，60°C 30s， 進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型檢測(cè)方法，其特征在 于：所述步驟3)中，所述蝦堿性磷酸酶SAP處理的條件為先于37° C處理lh，再于75° C處 理 15min〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型檢測(cè)方法，其特征 在于：所述步驟3)中，所述加入Lizl20 size standard內(nèi)標(biāo)和Hi-Di甲酰胺于95°C處理 5min，再于冰上放置5min。
10.基于SNaPshot技術(shù)的小鼠肝炎病毒分型檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，包括以下試 劑： (1) PCR擴(kuò)增試劑，包括PCR引物、DNA聚合酶、dNTPs、PCR反應(yīng)緩沖液；所述PCR引物 是序列為SEQ ID No :1和SEQ ID No :2的PCR引物或序列為SEQ ID No :3和SEQ ID No : 4的PCR引物； (2) PCR產(chǎn)物純化試劑，包括I ; (3) 單堿基延伸反應(yīng)試劑，包括：延伸引物、單堿基延伸酶、ddNTPs、延伸反應(yīng)緩沖液； 所述單堿基延伸酶是TaqDNA聚合酶；所述延伸引物為序列如SEQ IDNo :5、SEQ ID No :6、 SEQ ID No :7和SEQ ID No :8所示引物中的一條或多條，所述ddNTPs進(jìn)行熒光標(biāo)記，所述 T1、T2、T3和T4序列中的一個(gè)或多個(gè)序列的5'端用poly T修飾。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104263850SQ201410275214
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】賴國(guó)旗, 譚毅, 潘永全, 何明忠, 趙婷婷, 嚴(yán)磊 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)