一種利用阻斷巴氏鹽藻代謝通路生產(chǎn)番茄紅素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用阻斷巴氏鹽藻代謝通路生產(chǎn)番茄紅素的方法，包括如下步驟：(1)配制杜氏藻基本培養(yǎng)液，向培養(yǎng)液中加入A5微量元素溶液，調(diào)節(jié)pH，滅菌、冷卻至室溫；(2)將杜氏藻細胞加入培養(yǎng)液中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待OD600達到0.7的時候加入阻斷劑三乙胺200-800ppm，繼續(xù)培養(yǎng)24～72小時，然后提取色素，得到番茄紅素。本發(fā)明相對傳統(tǒng)從番茄表皮提取番茄紅素的方法，提取方法更加簡單、方便快捷，提取周期短。相對于利用三孢布拉氏霉等自養(yǎng)微生物，更利于大規(guī)模養(yǎng)殖，養(yǎng)殖所需環(huán)境要求簡單，符合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的標準。
【專利說明】一種利用阻斷巴氏鹽藻代謝通路生產(chǎn)番茄紅素的方法

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品科學【技術(shù)領域】。具體涉及利用一種阻斷劑阻斷杜氏鹽藻的代謝通 路來生產(chǎn)番茄紅素的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 杜氏鹽藻（Dunaliella salina)是一種嗜鹽的綠色微藻，是一種嗜鹽的單細胞真 核藻類，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最耐鹽的真核生物之一。它屬于高鹽逆境生物，適應性很強，繁 殖快，其自然生活環(huán)境多為鹽池、鹽湖等地方，特殊的環(huán)境造就了獨特的生長機制。杜氏鹽 藻屬于光合自養(yǎng)生物，含有豐富的油脂、胡蘿卜素。蛋白質(zhì)、多糖等，同時含有較高的Ca、P、 Zn等礦物質(zhì)，還含有包括人類必須氨基酸在內(nèi)的18中氨基酸，累積的甘油為干重的40%? 50%。在適當條件下，體內(nèi)合成的β -胡蘿卜素可達細胞干重的14%以上，遠遠高于其他 動物和植物體內(nèi)的含量，是β -胡蘿卜素極好的天然產(chǎn)源，具有很大的開發(fā)應用價值。β -胡蘿卜素可以作為維生素 Α的前提，能使皮膚和黏膜細胞正?；⒖梢跃S持視網(wǎng)膜正常的 功能。
[0003] 番茄紅素是一種類胡蘿卜素，作為植物所含的一種天然色素，主要存在于茄科植 物西紅柿的成熟果實中。研究證明番茄紅素具有提高人體免疫力、抗癌、抗氧化、降血脂、 保護皮膚等功效。隨著人們越來注重綠色、健康，番茄紅素不斷受到人們的廣泛關注。但 是作為功能性天然色素的番茄紅素，人類自身不能合成，需要通過膳食等方式補充。據(jù)美國 CPM (客戶管理關系）國際公司預測，番茄紅素產(chǎn)品銷售將年增35 %，預計兩三年內(nèi)到達200 億美元的銷售量，世界跨國醫(yī)藥巨頭和國內(nèi)的醫(yī)藥巨頭們紛紛進軍番茄紅素產(chǎn)業(yè)。
[0004] 當前番茄紅素的生產(chǎn)方法主要有天然提取、化學合成、微生物發(fā)酵等。目前，已證 實天然番茄紅素比化學合成的番茄紅素更易吸收。而且，化學合成化學物殘留的存在，因 此，近年來已轉(zhuǎn)向天然產(chǎn)品的開發(fā)。目前兩種主流生產(chǎn)番茄紅素的方法，一是番茄表皮中提 取，二是利用三孢布拉氏霉生產(chǎn)。然而從番茄表皮中提取，提取效率低，提取工藝繁瑣，需要 耗費大量的番茄，非常浪費；三孢布拉氏霉屬于異養(yǎng)霉菌類微生物，養(yǎng)殖所需碳源、氮源以 及生長環(huán)境要求高，難以工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，且生產(chǎn)成本較高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的利用一種阻斷劑，阻斷杜氏鹽藻的代謝通路中由番茄紅素向β -胡 蘿卜素的環(huán)化反應，實現(xiàn)了利用杜氏鹽藻生產(chǎn)番茄紅素的突破。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0007] -種利用阻斷巴氏鹽藻代謝通路生產(chǎn)番茄紅素的方法，包括如下步驟：
[0008] (1)配制杜氏藻基本培養(yǎng)液，向培養(yǎng)液中加入Α5微量元素溶液，調(diào)節(jié)pH，滅菌、冷 卻至室溫；
[0009] (2)將杜氏藻細胞加入培養(yǎng)液中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中用分光光度 計測定藻液的光密度（0D值），待0D600達到0. 7的時候加入阻斷劑三乙胺200-800ppm，繼 續(xù)培養(yǎng)24?96小時，然后提取色素，得到番茄紅素。
[0010] 所述杜氏藻基本培養(yǎng)液，其成分為：NaN030 . 420g/L，NaC187. 69g/L， NaH2P04 · 2H200. 156g/L, NaHC030. 840g/L, KC10. 074g/L, MgS04 · 7H201. 230g/L, CaCl2 · 2H200. 044g/L，0· 1 % EDTA 鐵 0· 5ml/L，調(diào) pH 至 7. 5。
[0011] 所述的 A5 微量元素溶液，其成分如下：H3B03286, MnCl2 · 4H20181，ZnS04 · 7H2022， CuS04 · 5Η207· 9,（NH4)6Mo7024 · 4Η203· 9,單位均為 mg/100ml，加入的量為 lml/L。
[0012] 所述的滅菌條件：壓力102. 9kPa，溫度121°C，時間20min。
[0013] 所述的培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為：在光照度為6000Lx，光暗周期為14h:10h，溫度為 26°C，以轉(zhuǎn)速50r/min的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)。
[0014] 所述的阻斷劑三乙胺的加入量為500ppm。
[0015] 所述的提取色素的方法為：取l〇ml藻液在lOOOOrpm轉(zhuǎn)速下離心lmin，棄上清液， 向藻泥中加入2ml丙酮，潤旋分散，8000rpm轉(zhuǎn)速下離心lmin，取上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中， 加入0· 2ml60% K0H，去除葉綠素，過0· 45um的濾膜。
[0016] 加入阻斷劑后繼續(xù)培養(yǎng)48?72小時。
[0017] 本發(fā)明的藻種來源：
[0018] 所涉及的巴氏杜氏藻（Dunaliella bardawil FACHB-847)購于中國科學院典型培 養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫（湖北武漢），并采用液體培養(yǎng)基弱光保存。
[0019] HPLC測定本發(fā)明中藻液番茄紅素的含量，表明加入阻斷劑前后番茄紅素是一個從 無到有的變化，另外在阻斷劑加入后的一段時間內(nèi)，番茄紅素的含量不斷積累并在48h? 72h時達到最大值，其中加入三乙胺的量在500ppm時，番茄紅素產(chǎn)量最高。
[0020] 本專利的發(fā)明效果在于：加入三乙胺后能夠有效抑制環(huán)化酶的活性，阻斷巴氏杜 氏藻代謝通路中番茄紅素向β -胡蘿卜素的進一步轉(zhuǎn)化，將僅僅作為巴氏杜氏藻代謝通路 中的中間產(chǎn)物的番茄紅素作為終產(chǎn)物出現(xiàn)在培養(yǎng)基中，是一種新的生產(chǎn)番茄紅素的方法。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0022] (1)本發(fā)明相對傳統(tǒng)從番茄表皮提取番茄紅素的方法，提取方法更加簡單、方便快 捷，提取周期短，產(chǎn)量也相對較高。
[0023] (2)巴氏杜氏藻屬于真核自養(yǎng)微生物，在養(yǎng)殖過程中，無需碳源、氮源等有機物，相 對于目前兩種主流生產(chǎn)番茄紅素的方法成本更低。
[0024] (3)本發(fā)明中利用的巴氏杜氏藻相比于三孢布拉氏霉，更利于大規(guī)模養(yǎng)殖，養(yǎng)殖所 需環(huán)境要求簡單，符合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的標準。
[0025] (4)本發(fā)明在高鹽、強光、缺氮等極端環(huán)境的脅迫下，番茄紅素會有更高的產(chǎn)率，獲 得更高的收益。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為杜氏鹽藻中番茄紅素的代謝途徑，抑制代謝路徑中的番茄紅素環(huán)化酶，將 終產(chǎn)物停留在番茄紅素；圖中的英文縮寫示意：MEP:2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸；PDS: 八氫番茄紅素脫氫酶；ZIS0: ζ -胡蘿卜素異構(gòu)酶；ZDS: ζ -胡蘿卜素脫氫酶；CRTIS0:類胡 蘿卜素異構(gòu)酶。
[0027] 圖2為加入500ppm三乙胺阻斷12小時后的液相圖譜，沒有番茄紅素峰。
[0028] 圖3為加入500ppm三乙胺阻斷24小時后的液相圖譜，峰8為番茄紅素峰。圖2 和圖3的比對說明，確實是三乙胺起到的阻斷效果，產(chǎn)生的番茄紅素。
[0029] 圖4為加入500ppm三乙胺阻斷48小時后的液相圖譜，峰9為番茄紅素峰。
[0030] 圖5為加入500ppm三乙胺阻斷72小時后的液相圖譜，峰15為番茄紅素峰。
[0031] 圖6為圖4中峰9的波段掃描圖。
[0032] 圖7為番茄紅素標準品全波段掃描圖。

【具體實施方式】
[0033] 實施例1
[0034] (1)杜氏藻培養(yǎng)液配制
[0035] 配制鹽藻培養(yǎng)液：NaN030 . 42〇g/L，NaCl87· 69g/L，NaH2P04 · 2Η200· l56g/L， NaHC030 . 840g/L，KC10. 074g/L，MgS04 · THAI. 230g/L，CaCl2 · 2Η200· 044g/L，0. 1% EDTA 鐵 0. 5ml/L。向培養(yǎng)液中加入A5微量元素溶液lml/L，調(diào)pH至7. 5。A5微量元素溶液，其成分 如下：H3B03286, MnCl2 · 4H20181，ZnS04 · 7H2022, CuS04 · 5Η207· 9,（ΝΗ4)6Μ〇Α4 · 4Η203· 9,單 位均為mg/100ml。鹽藻培養(yǎng)液按100ml每瓶分裝至500ml的三角瓶中，四層紗布封口，在 lOOkPa大氣壓下高溫滅菌20min。室溫冷卻后使用。
[0036] (2)接種培養(yǎng)
[0037] 將處于代數(shù)生長期的藻液于5000r/min下離心lOmin，棄除培養(yǎng)液，按1%的接種 量將藻細胞加入裝有新鮮培養(yǎng)液的三角瓶中，用四層紗布包裹瓶口。將三角瓶置于光照培 養(yǎng)箱中，在光照度為6000Lx (光暗周期為14h: 10h)，溫度為26°C，以轉(zhuǎn)速50r/min的轉(zhuǎn)速震 蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中用分光光度計測定藻液的光密度（0D值），當其0D600達到0. 7時加入 三乙胺500ppm，繼續(xù)培養(yǎng)4天。
[0038] (3)色素的提取
[0039] 加入阻斷劑后每個12小時，取10ml藻液在lOOOOrpm轉(zhuǎn)速下離心lmin，棄上清液， 向藻泥中加入2ml丙酮，潤旋分散，8000rpm轉(zhuǎn)速下離心lmin，取上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中， 加入0. 2ml60% K0H，去除葉綠素的影響。過0. 45um的濾膜待測液相。
[0040] (4)含量測定
[0041] 利用高效液相（HPLC)來測定番茄紅素的含量
[0042] 液相條件：流動相：45%乙腈45%異丙醇10%甲醇，流速1.21111/1^11，柱溫251：， 色譜柱 Welch Ultimate XB-C18。
[0043] 加入三乙胺12小時，沒有番茄紅素的峰。（見圖2)
[0044] 加入三乙胺24小時，番茄紅素的峰高0· 974mAU。（見圖3)
[0045] 加入三乙胺48小時，番茄紅素的峰高11. 020mAU。（見圖4)
[0046] 其中在加入阻斷劑72小時番茄紅素的峰高度達到最大值為16. 203mAU(見圖5)。
[0047] 實施例2
[0048] (1)杜氏藻培養(yǎng)液配制（同實施例1)
[0049] (2)接種培養(yǎng)
[0050] 同實施例1，不同之處在于加入阻斷劑的量不同，本實施例加入三乙胺的量為 200ppm〇
[0051] (3)含量測定（同實施例1)
[0052] 加入三乙胺12小時，沒有番茄紅素的峰。
[0053] 加入三乙胺24小時，番茄紅素的峰高1. 938mAU。
[0054] 加入三乙胺48小時，番茄紅素的峰高7. 224mAU。
[0055] 加入三乙胺72小時，番茄紅素的峰高6. 310mAU。
[0056] 其中在加入阻斷劑48小時番茄紅素的峰高度達到最大值為7. 224mAU。
[0057] 實施例3
[0058] (1)杜氏藻培養(yǎng)液配制（同實施例1)
[0059] (2)接種培養(yǎng)
[0060] 同實施例1，不同之處在于加入阻斷劑的量不同，本實施例加入三乙胺的量為 800ppm〇
[0061] ⑶含量測定（同實施例1)
[0062] 加入三乙胺12小時，沒有番茄紅素的峰。
[0063] 加入三乙胺24小時，番茄紅素的峰高1. 598mAU。
[0064] 加入三乙胺48小時，番茄紅素的峰高4. 357mAU。
[0065] 其中在加入阻斷劑72小時番茄紅素的峰高度達到最大值為7. 570mAU。
【權(quán)利要求】
1. 一種利用阻斷巴氏鹽藻代謝通路生產(chǎn)番茄紅素的方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 配制杜氏藻基本培養(yǎng)液，向培養(yǎng)液中加入A5微量元素溶液，調(diào)節(jié)pH，滅菌、冷卻至 室溫； (2) 將杜氏藻細胞加入培養(yǎng)液中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待0D600達到0. 7的時候加 入阻斷劑三乙胺200-800ppm，繼續(xù)培養(yǎng)24?96小時，然后提取色素，得到番茄紅素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述杜氏藻基本培養(yǎng)液，其成分為： NaN030 . 420g/L, NaC187. 69g/L, NaH2P04 · 2H200. 156g/L, NaHC030 . 840g/L, KC10. 074g/L, MgS04 · 7H20L 230g/L，CaCl2 · 2H200. 044g/L，0· 1 % EDTA 鐵 0· 5ml/L，調(diào) pH 至 7. 5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的A5微量元素溶液，其成分如下： H3B03286, MnCl2 · 4H20181，ZnS04 · 7H2022, CuS04 · 5Η207· 9,（ΝΗ4)6Μ〇7024 · 4Η203· 9,單位均為 mg/100ml，加入的量為lml/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的滅菌條件：壓力102. 9kPa，溫度 121°C，時間 20min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為：在光照度為 6000Lx，光暗周期為14h:10h，溫度為26°C，以轉(zhuǎn)速50r/min的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阻斷劑三乙胺的加入量為500ppm。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?6任意一項所述的方法，其特征在于，所述的提取色素的方法為： 取10ml藻液在lOOOOrpm轉(zhuǎn)速下離心lmin，棄上清液，向藻泥中加入2ml丙酮，潤旋分散， 8000rpm轉(zhuǎn)速下離心lmin，取上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入0. 2Π 11601% K0H，去除葉綠素， 過0. 45um的濾膜。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟（2)加入阻斷劑后繼續(xù)培養(yǎng)48?72 小時。
【文檔編號】C12R1/89GK104087617SQ201410267336
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】姜建國, 李一萌 申請人:華南理工大學