檢測細(xì)胞內(nèi)標(biāo)靶的顆粒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了描述用結(jié)合部分修飾的納米顆粒的用途的方法。
【專利說明】檢測細(xì)胞內(nèi)標(biāo)靶的顆粒
[0001]分案說明
[0002]本申請為申請日為2008年2月11日、申請?zhí)枮?00880011218.X、發(fā)明名稱為“檢測細(xì)胞內(nèi)標(biāo)靶的顆粒”的專利申請的分案申請。
[0003]資助公開
[0004]本發(fā)明由政府支持，資助來自Cancer Center for NanotechnologyExcellence (NCI/CCNE)獎(jiǎng)勵(lì)的資金 IU54_CA119341、NIH Director’s Pioneer Award 獎(jiǎng)勵(lì)的資金roP10D000285，和NSEC獎(jiǎng)勵(lì)的資金EEC-0647560。政府對(duì)本發(fā)明具有一定權(quán)利。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本發(fā)明涉及使用納米顆粒檢測細(xì)胞內(nèi)標(biāo)靶分子濃度的方法，其中所述納米顆粒包括可以特異性連接標(biāo)靶分子的結(jié)合部分，且其中所述連接導(dǎo)致在連接標(biāo)靶分子后可檢測標(biāo)靶中可測定的變化。 【背景技術(shù)】
[0006]標(biāo)記的寡核苷酸廣泛地用作檢測特異性大分子標(biāo)靶如核酸和蛋白質(zhì)的探針。它們與標(biāo)靶高特異性結(jié)合的能力使得它們可以用在體外分析如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法中。然而，將這些類型的標(biāo)靶特異性探針遞送進(jìn)入活細(xì)胞存在很大挑戰(zhàn)，因?yàn)榧?xì)胞對(duì)核酸攝入具有天生的抗性，且包含除去這些外源遺傳物質(zhì)的多種途經(jīng)。因此，人們對(duì)將這些物質(zhì)以保持其特異性結(jié)合性質(zhì)和熒光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的方式遞送進(jìn)入細(xì)胞的方法很感興趣。
[0007]寡核苷酸-納米顆粒綴合物的發(fā)現(xiàn)和隨后的發(fā)展為分子診斷學(xué)(Elghanian等，1997，Sciencelll:1078-1081 ;Nam 等，2003，Science308:1884-1886)和材料設(shè)計(jì)(Mirkin 等，1996，Nature382:607_609 ;Alivisatos 等，1996，Nature382:609-611 ;Demers 等，2003，Angew.Chem.1nt.Ed.40:3071-3073)提供了多種新的機(jī)會(huì)。最近，已經(jīng)表明寡核苷酸功能化的納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞并起到控制基因表達(dá)的反義試劑的作用(Rosi等，2006，Science312:1027-1030)。這些“反義顆?！辈皇呛唵蔚倪f送載體(Sandhu 等，2002，Bioconjugate Chem.13:3-6 ;Tkachenko 等，2003，J.Am.Chem.Soc.125:4700-4701)，而是單個(gè)實(shí)體調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)染試劑，所述試劑經(jīng)歷細(xì)胞內(nèi)在化，抵抗酶促降低并以比游離寡核苷酸大兩個(gè)數(shù)量級(jí)的親和常數(shù)結(jié)合細(xì)胞內(nèi)標(biāo)靶(Lytton-Jean和Mirkin, 2005, J.Am.Chem.Soc.127:12754-12755)。此外，它們可以很容易地被強(qiáng)力的(即高度穩(wěn)定的)標(biāo)記材料如鎖核酸修飾(Seferos等，2007，ChemBioChem8:1230-1232)且在基因調(diào)節(jié)所需的條件下沒有毒性。實(shí)際上，已經(jīng)顯示出，與溶液中缺少寡核苷酸不同，寡核苷酸修飾的金納米顆粒容易大量被細(xì)胞吸收。此性質(zhì)導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)可將寡核苷酸修飾的金納米顆粒用作細(xì)胞內(nèi)基因控制的試劑，在此處它們提供DNA的快速細(xì)胞內(nèi)遞送，且還增加細(xì)胞中基于協(xié)同性質(zhì)的寡核苷酸的功效。這些寡核苷酸功能化的納米顆粒已經(jīng)顯示出進(jìn)入各種細(xì)胞類型，且可以用來引入寡核苷酸的高局部濃度。
[0008]以前也顯出與DNA致密功能化的金納米顆粒以高度協(xié)同方式結(jié)合互補(bǔ)DNA，導(dǎo)致結(jié)合強(qiáng)度比未與金納米顆粒連接的類似DNA鏈的所測結(jié)合強(qiáng)度高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。除上述那些用途之外，此性質(zhì)使得納米顆粒對(duì)DNA和蛋白質(zhì)診斷分析特別有用。
[0009]一類感興趣的寡核苷酸是可以檢測具有識(shí)別序列的特異性標(biāo)靶的那些寡核苷酸。醫(yī)學(xué)診斷、藥物開發(fā)和發(fā)育和分子生物學(xué)應(yīng)用對(duì)這些結(jié)構(gòu)類型(如果將其引入活細(xì)胞)特別感興趣。然而，目前的遞送/轉(zhuǎn)染策略缺少其用途所需的特征，如I)低毒性，2)高細(xì)胞攝入，和3)提供對(duì)引起假陽性信號(hào)的酶的抗性。
[0010]顯像并檢測細(xì)胞內(nèi)RNA的探針包括原位染色中所用的那些(Femino等,Science280:585-590, 1998 ；Kloosterman 等，Nat.Methods3:27-29，2006)、分子信標(biāo)(Tyagi 等，1996，Nat.Biotechnol.14:303-308 ;Sokol 等，1998，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:11538-11543；Peng 等，2005，Cancer Res.65:1909-1917 ；Perlette等，2001，Anal.Chem.73:5544-5550 ；Nitin 等，2004，Nucleic Acids Res.32: e58)、和 FRET對(duì)(Santangelo 等，2004，Nucleic Acids Res.32:e57 ;Bratu 等，2003，Proc.Natl Acad.Sc1.USAlOO: 13308-13313)，每個(gè)都是測定和定量活體系應(yīng)答外部刺激活性的重要生物學(xué)工具(Santangelo 等，2006，Annals of Biomedical Engineering34:39-50)。然而，已經(jīng)證明將基于寡核苷酸的報(bào)道物遞送進(jìn)入細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞是對(duì)細(xì)胞內(nèi)檢測的巨大挑戰(zhàn)?；诠押塑账岬奶结樀募?xì)胞內(nèi)在化通常需要轉(zhuǎn)染試劑如脂類(Zabner等，1995，J.Bi0.Chem.270:18997-19007)或樹枝狀化合物(Kukowska-Latal1 等,1996, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:4897-4902)，其可以是有毒的或改變細(xì)胞過程。此外，寡核苷酸易于在細(xì)胞內(nèi)降解(Opalinska 和 Gewirtz, 2002，Nat.Rev.Drug Disc.1:503-514),且在突光團(tuán)標(biāo)記的探針的情況中，這可以引起無法區(qū)別于真正識(shí)別事件的高背景信號(hào)(Li等，2004，Nucleic AcidsRes.28:e52 ;Rizzo 等，2002，Molecular and Cellular Probesl6:277-283)。
[0011]因此，雖然已經(jīng)設(shè)計(jì)出可以以高特異性識(shí)別標(biāo)靶的納米顆粒，但是很難檢測源自特異相互作用的陽性作用，特別是以高靈敏度在單細(xì)胞水平上檢測此相互作用。
[0012] 因此本領(lǐng)域需要開發(fā)能夠進(jìn)入細(xì)胞去連接特異標(biāo)靶的材料和檢測并定量得到細(xì)胞內(nèi)相互作用的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明提供了測定細(xì)胞內(nèi)標(biāo)靶分子濃度的方法，包括在允許標(biāo)靶分子與納米顆粒連接的條件下使標(biāo)靶分子接觸納米顆粒的步驟，所述納米顆粒包含特異于所述標(biāo)靶分子的結(jié)合部分，所述結(jié)合部分標(biāo)記有標(biāo)記物，其中標(biāo)靶分子和納米顆粒的連接導(dǎo)致標(biāo)記物中可檢測的變化，且其中可檢測標(biāo)記物中的變化與細(xì)胞內(nèi)所述標(biāo)靶分子的濃度成比例。
[0014]在此方法的一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合部分是多核苷酸，且在另一方面，結(jié)合部分是多肽。在結(jié)合部分是多核苷酸的實(shí)施方案中，其它方面包括其中結(jié)合部分是DNA分子或RNA分子的那些方面。在此方法的其它實(shí)施方案中，標(biāo)靶分子是多核苷酸或多肽。在標(biāo)靶分子是多核苷酸的實(shí)施方案中，其它方面包括其中結(jié)合部分是DNA分子或RNA分子的那些方面。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了方法，其中結(jié)合部分是與納米顆粒共價(jià)連接的多核苷酸，且標(biāo)記物是連接與結(jié)合部分多核苷酸雜交的多核苷酸的標(biāo)記，其中結(jié)合部分多核苷酸和標(biāo)靶分子的連接釋放出雜交的多核苷酸，且釋放后標(biāo)記物是可檢測的。一方面，標(biāo)記物連接雜交的多核苷酸，且當(dāng)具有標(biāo)記物的雜交的多核苷酸與結(jié)合部分雜交時(shí)，標(biāo)記物淬滅。
[0016]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了方法，其中結(jié)合部分是與納米顆粒共價(jià)連接的多肽，且標(biāo)記物是連接與結(jié)合部分多肽相連的試劑的標(biāo)記，其中結(jié)合部分多肽和標(biāo)靶分子的連接替代相連的試劑，且釋放后標(biāo)記物是可檢測的。一方面，標(biāo)記物連接試劑，且當(dāng)試劑與結(jié)合部分多肽連接時(shí)，標(biāo)記物淬滅。
[0017]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了方法，其中結(jié)合部分標(biāo)記有標(biāo)記物，且只有當(dāng)結(jié)合部分連接標(biāo)靶分子時(shí)標(biāo)記物才可被檢測。在結(jié)合部分是多核苷酸的實(shí)施方案中，其它方面包括其中結(jié)合部分是DNA分子或RNA分子的那些方面。在此方法的其它實(shí)施方案中，標(biāo)靶分子是多核苷酸或多肽。在標(biāo)靶分子是多核苷酸的實(shí)施方案中，其它方面包括其中結(jié)合部分是DNA分子或RNA分子的那些方面。
[0018]在一個(gè)方面，結(jié)合部分是多核苷酸且標(biāo)記物與多核苷酸結(jié)合部分連接，使得當(dāng)多核苷酸結(jié)合部分不與標(biāo)靶分子連接時(shí)，標(biāo)記物淬滅。因此，只有當(dāng)多核苷酸結(jié)合部分連接標(biāo)靶分子時(shí)與多核苷酸結(jié)合部分相連的標(biāo)記物才可被檢測。
[0019]在另一個(gè)方面，結(jié)合部分是多肽且標(biāo)記物與多肽結(jié)合部分連接，使得當(dāng)多肽結(jié)合部分不與標(biāo)靶分子連接時(shí)，標(biāo)記物淬滅。因此，只有當(dāng)多肽結(jié)合部分連接標(biāo)靶分子時(shí)多肽結(jié)合部分才可被檢測。
[0020]本發(fā)明還提供了方法，其中所述納米顆粒包含多個(gè)結(jié)合部分。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了方法，其中多個(gè)結(jié)合部分特異地連接一個(gè)標(biāo)靶分子。在另一個(gè)方面，其中多個(gè)結(jié)合部分特異地連接多于一個(gè)標(biāo)靶分子。
[0021]本發(fā)明的其它方面將從以下具體描述中清楚得出。然而，應(yīng)該理解以下詳細(xì)描述和實(shí)施例，盡管說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，僅以列舉的方式給出，因?yàn)楸景l(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對(duì)此詳細(xì)描述的領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1提供了能夠檢測細(xì)胞內(nèi)標(biāo)靶的修飾有包含熒光團(tuán)的寡核苷酸的金納米顆粒的圖。
[0023]圖2顯示了用于mRNA檢測和定量的納米-flares。
[0024]圖3描述了使用納米-flares對(duì)生存素敲除的定量。(a)在siRNA處理的SKBR3細(xì)胞上收集的流式細(xì)胞數(shù)據(jù)，(b)作為siRNA濃度的函數(shù)的平均熒光(黑圈)和生存素表達(dá)(灰柱圖)的圖。
【具體實(shí)施方式】 [0025]本文提供的方法利用了修飾有包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部分的納米顆粒的物理性質(zhì)和用途，所述結(jié)合部分特異地識(shí)別并連接一個(gè)或多個(gè)特異標(biāo)靶部分。本文顯出可以使用包含特異于標(biāo)靶分子的結(jié)合部分的納米顆粒來測定細(xì)胞內(nèi)標(biāo)靶分子的濃度。在本發(fā)明中，結(jié)合部分標(biāo)記有標(biāo)記物，其中標(biāo)靶分子和納米顆粒的連接導(dǎo)致標(biāo)記物中可檢測的變化，且其中可檢測標(biāo)記物中的變化與細(xì)胞內(nèi)所述標(biāo)靶分子的濃度成比例。要意識(shí)到細(xì)胞內(nèi)標(biāo)靶包括標(biāo)靶細(xì)胞中那些天然存在的標(biāo)靶，已經(jīng)被引入細(xì)胞中的那些天然存在標(biāo)靶(但在此細(xì)胞類型中通常無法發(fā)現(xiàn))或本身不存在但已被引入標(biāo)靶細(xì)胞中的合成標(biāo)靶。[0026]在本發(fā)明的另一方面，也可以使用本文概括的方法來測定細(xì)胞內(nèi)所期望標(biāo)靶的定位。
[0027]如本文所用，應(yīng)理解術(shù)語“結(jié)合部分”涵蓋多核苷酸和多肽，或可以與目的標(biāo)靶連接的前述分子的任何其它片段或部分。此術(shù)語包括但不限于目的小分子。如本領(lǐng)域所理解，術(shù)語“小分子”包括有機(jī)和無機(jī)化合物，它們或是天然存在化合物、天然存在化合物的修飾物、或合成的化合物。
[0028]所提供的方法特別適于使用識(shí)別并連接細(xì)胞內(nèi)標(biāo)靶分子的結(jié)合部分，其中結(jié)合部分是多核苷酸和/或多肽，且標(biāo)靶分子是多核苷酸和/或多肽。在簡單的方面，多核苷酸結(jié)合部分特異地連接多核苷酸標(biāo)靶分子，或多肽結(jié)合部分特異地連接多肽標(biāo)靶分子。然而，也可以預(yù)期這樣的方法，其中多核苷酸結(jié)合部分特異地連接多肽標(biāo)靶分子，或多肽結(jié)合部分特異地連接多核苷酸標(biāo)靶分子。
[0029]如本文所用，術(shù)語“特異地識(shí)別”或“特異地連接”是指與全部其它標(biāo)靶分子相比，結(jié)合部分可以以更高的親和力和/或活動(dòng)性鑒別和/或與一種標(biāo)靶分子相互作用。 [0030]本方法提供功能，基于的原理是用標(biāo)記物直接或間接地標(biāo)記結(jié)合部分，且結(jié)合部分與標(biāo)靶分子的連接導(dǎo)致標(biāo)記物變得可以檢測或更易檢測。因此，當(dāng)結(jié)合部分不與標(biāo)靶分子連接時(shí)，標(biāo)記物相對(duì)不可檢測或淬滅。雖然本領(lǐng)域中理解術(shù)語“淬滅”通常與熒光標(biāo)記物有關(guān)，但是本文中預(yù)期當(dāng)其相對(duì)不可檢測時(shí)，任何標(biāo)記物的信號(hào)是淬滅的。因此，應(yīng)理解所提供的本說明書中列舉的應(yīng)用熒光標(biāo)記物的方法僅作為預(yù)期方法的一種實(shí)施方案，且任何可以淬滅的標(biāo)記物可以替代示例型熒光標(biāo)記物。
[0031]一方面，標(biāo)記物是直接連接結(jié)合部分的標(biāo)記，且另一方面，標(biāo)記物是連接與結(jié)合部分相連的試劑的標(biāo)記，此試劑對(duì)于結(jié)合部分具有較低的結(jié)合親和力或結(jié)合活動(dòng)性，使得標(biāo)靶分子與結(jié)合部分的連接引起試劑從與其連接的結(jié)合部分上被替代。
[0032]當(dāng)標(biāo)記物直接連接結(jié)合部分時(shí),可以這樣定位標(biāo)記物,使得其在結(jié)合部分未連接標(biāo)靶分子時(shí)是相對(duì)不可檢測或淬滅的。例如，對(duì)于未連接標(biāo)靶分子的多核苷酸結(jié)合部分，通過在多核苷酸結(jié)合部分內(nèi)部形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以將標(biāo)記物定位于靠近納米顆粒本身，或標(biāo)記物可以在水環(huán)境中自由地?cái)[動(dòng)，使得在任何給定時(shí)間標(biāo)記物可以靠近納米顆粒且其信號(hào)淬滅，或標(biāo)記物可以遠(yuǎn)離納米顆粒的在水環(huán)境中自由地?cái)[動(dòng)(雖然仍連接納米顆粒)，使得信號(hào)不淬滅。在沒有二級(jí)結(jié)構(gòu)將標(biāo)記物保持在靠近納米顆粒的淬滅位置的實(shí)施方案中，當(dāng)多核苷酸結(jié)合部分未連接標(biāo)靶分子時(shí)，必需檢測背景信號(hào)的水平，且多核苷酸結(jié)合部分與標(biāo)靶分子的連接將使信號(hào)超過背景，原因是更多的標(biāo)記物從足夠接近給予淬滅作用的納米顆粒處被替代。
[0033]類似地，當(dāng)結(jié)合部分是多肽時(shí)，可以這樣定位結(jié)合部分上的標(biāo)記物，使得在多肽結(jié)合部分連接標(biāo)靶分子時(shí)發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致標(biāo)記物充分遠(yuǎn)離納米顆粒，以使其信號(hào)相對(duì)不淬滅。
[0034]在標(biāo)記物未直接連接結(jié)合部分的方法方面，結(jié)合部分和標(biāo)靶分子的連接引起標(biāo)靶的物理釋放，使得納米顆粒不能發(fā)揮對(duì)標(biāo)記物的淬滅作用。例如，對(duì)于多核苷酸結(jié)合部分，可以將標(biāo)記物標(biāo)記在與多核苷酸結(jié)合部分雜交的第二多核苷酸上，所在位置使得標(biāo)記物充分接近納米顆粒，以使納米顆粒發(fā)揮其淬滅作用。當(dāng)多核苷酸結(jié)合分子識(shí)別并連接標(biāo)靶分子時(shí)，雜交和標(biāo)記的多核苷酸被替代，且納米顆粒的淬滅作用終止。[0035]因此，一方面，例如，本發(fā)明提供了方法，其中可以將修飾為包含多核苷酸結(jié)合部分的金納米顆粒用作轉(zhuǎn)染劑和活細(xì)胞內(nèi)成像和定量RNA的細(xì)胞“納米-flares”，所述多核苷酸結(jié)合部分反過來雜交標(biāo)記有熒光團(tuán)標(biāo)記物的互補(bǔ)的多核苷酸。納米-flares的優(yōu)點(diǎn)是金的高效突光淬滅性質(zhì)(Dubertret等,2001, Nat.Biotechnol.19:365-370)，細(xì)胞攝取寡核苷酸納米顆粒綴合物而不使用轉(zhuǎn)染劑，和此綴合物的酶穩(wěn)定性(Rosi等，2006, Science312:1027-1030)，因此克服了許多挑戰(zhàn)來產(chǎn)生敏感和有效的細(xì)胞內(nèi)探針。特別地，納米-flares顯示出高信號(hào)傳導(dǎo)，具有低背景熒光，且對(duì)細(xì)胞內(nèi)RNA轉(zhuǎn)錄物數(shù)量變化敏感。因此，本文所述的納米-flares是設(shè)計(jì)為提供與特定細(xì)胞內(nèi)RNA相對(duì)量直接或間接相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)的寡核苷酸功能化的納米顆粒綴合物。所公開方法中期望檢測的RNA包括但不限于mRNA和hnRNA。
[0036]類似的機(jī)制適用于多肽結(jié)合部分，其中標(biāo)記有標(biāo)記物和試劑的試劑能夠如此連接多肽結(jié)合部分，以致其連接引起試劑盒標(biāo)記物充分地接近納米顆粒，以使標(biāo)記物相對(duì)淬滅。當(dāng)多肽結(jié)合部分連接特定標(biāo)祀分子，如同上述納米-flare試劑被釋放或替代,且納米顆粒的淬滅作用終止。
[0037]不管結(jié)合部分的特定性質(zhì)，通過使用熒光團(tuán)標(biāo)記的寡核苷酸或多肽致密功能化的納米顆粒，可以降低通常與細(xì)胞內(nèi)分子檢測有關(guān)的一些困難。這些結(jié)合部分不需要顯微注射或輔助轉(zhuǎn)染劑來進(jìn)入細(xì)胞，對(duì)酶促降解具有很高的抗性，且在研究的條件下無毒。
[0038]多核苷酸
[0039]如本文所使用，術(shù)語“多核苷酸”，或在納米顆粒上功能化或作為標(biāo)靶分子，可以與術(shù)語寡核苷酸互換使用。
[0040]本文所用的術(shù)語“ 核苷酸”可以與本文所述的和本領(lǐng)域已知的修飾形式互換使用。在某些實(shí)例中，本領(lǐng)域使用術(shù)語“核堿基”，其涵蓋天然存在的核苷酸以及可以聚合的核苷酸的修飾物。
[0041]本領(lǐng)域熟知制備預(yù)定序列多核苷酸的方法。參見，如Sambrook等，MolecularCloning:A Laboratory Manual(2nd ed.1989)和 F.Eckstein(ed.)寡核苷酸 andAnalogues, 1st Ed.(Oxford University Press, New York, 1991)。固相合成方法優(yōu)選用于寡核糖核苷酸和寡脫氧核糖核苷酸(熟知的合成DNA的方法也可用于合成RNA)。寡核糖核苷酸和寡脫氧核糖核苷酸也可以用酶法制備。優(yōu)選用固相合成法進(jìn)行寡核糖核苷酸和寡脫氧核糖核苷酸的合成(合成DNA的公知方法也用于合成RNA)。寡核糖核苷酸和寡脫氧核糖核苷酸也可用酶法制備。
[0042]在各個(gè)發(fā)明，本發(fā)明提供的方法包括多核苷酸的用途，該多核苷酸為DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸或這兩種類型的組合。也可考慮使用寡核苷酸的修飾形式，包括那些具有至少一個(gè)修飾的核苷酸間鍵合。修飾的多核苷酸或寡核苷酸在下文中詳細(xì)描述。
[0043]修飾的寡核苷酸
[0044]寡核苷酸的具體實(shí)例包括那些含有修飾的骨架或非天然的核苷酸間鍵合。具有修飾的骨架的寡核苷酸包括那些在骨架中保留磷原子和那些在骨架中沒有磷原子的寡核苷酸。在核苷酸間骨架中沒有磷原子的修飾的寡核苷酸涵蓋在"寡核苷酸"的含義之內(nèi)。
[0045]包含磷原子的修飾的寡核苷酸骨架包括例如:具有正常3’ -5’連接的磷硫酰、手性磷硫酰、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3’ -烷撐膦酸酯、5’ -烷撐膦酸酯和手性膦酸酯的甲基和其他烷基膦酸酯、phosphinates、包括3’ -氨基氨基磷酸酯和氣基烷基氣基勝酸酷的氣基憐酸酷、硫擬氣基憐酸酷、硫擬烷基勝酸酷、硫擬烷基憐酸二酯、硒代磷酸酯和boranophosphates ;其2’_5’連接類似物；和具有反轉(zhuǎn)極性的其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸間鍵合是3’到3’、5’到5’或2’到2’連接的骨架。還涉及具有反轉(zhuǎn)極性的寡核苷酸，其在3’ -most核苷酸間連接處包括單純的3’到3’連接，即，單獨(dú)的反轉(zhuǎn)核苷酸殘基，其可以是abasic (該核苷酸丟失或在其位置具有一個(gè)羥基)。也可以是鹽、混合鹽和游離酸形式。教導(dǎo)上述含磷連接的制備的美國專利包括，美國專利3，687，808 ;4，469，863 ；4，476，301 ;5，023，243 ;5，177，196 ;5，188，897 ;5，264，423 ;5，276，019 ;5，278，302 ；5，286，717 ;5，321, 131 ;5，399，676 ;5，405, 939 ;5，453, 496 ;5，455, 233 ;5，466，677 ；5，476，925 ;5，519，126 ;5，536，821 ;5，541，306 ;5，550，111 ;5，563，253 ;5，571，799 ；5，587，361 ;5，194，599 ;5，565，555 ;5，527，899 ;5，721，218 ;5，672，697 和 5，625，050，其公開通過引用合并于此。
[0046]不包括磷原子的修飾的寡核苷酸骨架具有通過短鏈烷基或環(huán)烷基核苷酸間鍵合、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷酸間鍵合、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷酸間鍵合形成的骨架。這些骨架包括那些具有嗎啉代連接；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；formacetyl 和 thioformacetyl 骨架；亞甲基 formacetyl 和 thioformacetyl 骨架；riboacetyl骨架；含烯烴骨架；氨基磺酸鹽骨架；亞甲基亞胺基和亞甲基肼基骨架；磺酸鹽和氨苯磺胺骨架；酰胺骨架；和其他具有混合的N、O、S和CH2組成部分的骨架。參見，例如，美國專利 5，034，506 ;5，166，315 ;5，185，444 ;5，214，134 ;5，216，141 ;5，235，033 ；5，264，562 ;5，264，564 ;5，405，938 ;5，434，257 ;5，466，677 ;5，470，967 ;5，489，677 ；5，541，307 ;5，561，225 ;5，596，086 ;5，602，240 ;5，610，289 ;5，602，240 ;5，608，046 ；5，610，289 ;5，618，704 ;5，623，070 ;5，663，312 ;5，633，360 ;5，677，437 ;5，792，608 ；5，646，269和5，677，439，其公開通過引用整體合并于此。
[0047]在又一個(gè)實(shí)施方式中，還包括其中核苷酸單元中一個(gè)或多個(gè)糖和/或一個(gè)或多個(gè)核苷酸間鍵合被“非天然產(chǎn)生”的基團(tuán)取代的寡核苷酸模擬物。在一個(gè)方面，該實(shí)施方式涉及肽核酸(PM)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架所取代。參見，例如美國專利 5，539，082 ;5，714，331 ；和 5，719，262，和 Nielsen etal, 1991，Science,，254:1497-1500，其公開通過引用合并于此。
[0048]在又一個(gè)實(shí)施方式中，提供具有磷硫酰骨架的寡核苷酸和具有雜原子骨架和包括-CH2-NH- O -CH2-、-CH2-N (CH3) -O-CH2-、-CH2-O-N (CH3) -CH2-、-CH2-N (CH3) -N (CH3) -CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-的寡核苷酸(如美國專利5，489，677和5，602，240所述)。還提供了具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，如美國專利5，034，506所述。
[0049]在各種形式中，該寡聚體中兩個(gè)連續(xù)單體間的連接由2-4個(gè)，優(yōu)選3個(gè)基團(tuán)/原子組成，這些基團(tuán) / 原子選自-CH2-、-O-、-S-、-NRh-、>C = 0、>C = NRh、>C = S、-Si (R〃) 2_、-SO-、-S (0) 2-、-P (0) 2-、-PO (BH3) -、-P (0，S) -、-P (S) 2-、-PO (R") -、-PO (OCH3)-和-PO (NHRh)-， 其中，Rh選自氫和CV4烷基；R〃選自C^6烷基和苯基。這些連接的示例性實(shí)例為-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH =(當(dāng)用作與后續(xù)單體的連接時(shí)包括 R5)、-CH2-CH2-O-, -NRh-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NRh' -CH2-NRh-CH2' -O-CH2-CH2-NRh-, -NRh-CO-O-, -NRh-C0_NRh-、-NRh-CS_NRh-、-NRh-C ( = NRh) -NRh-、-NRh-C0_CH2-NRh-0-Co-o-、-o-co-ch2-o-、-o-ch2-co-o-、-ch2-co-nrh-、-o-co-nrh-、-NRh-CO-CH2-、-o-ch2-co-nrh-、-O-CH2-CH2-NRh-、-CH = N_0_、-CH2-NRh-O-、-CH2-O-N =(當(dāng)用作與后續(xù)單體的連接時(shí)包括R5)、-CH2-O-NRh-' -CO-NRh-CH2-' -CH2-NRh-O' -CH2-NRh-CO-, -O-NRh-CH2-, -O-NRh, -O-CH2-S-、-S-CH2-O-、-CH2-CH2-S-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH =(當(dāng)用作與后續(xù)單體的連接時(shí)包括 R5)，-S-CH2-CH2-, -S-CH2-CH2-0-，-S-CH2-CH2—S-，-CH2-S_CH2-，-CH2-SO-CH2-, -CH2-S02_CH2-
,_o_so_o_, _o_s (ο) 2~0—, _o_s (o) 2_ch2_, _o_s (o) 2_nrh_、_nrh_s (o) 2_ch2_ ；_0_S (0) 2_CH2_,-
O-P (O) 2-o-, -O-P (0，s) -0-，-O-P (S) 2-o-, -S-P (0) 2-o-, -S-P (0，s) -0-，-S-P (S) 2-o-, -O-P (0)2-s-，-O-P (O5S) -s-、-O-P (S) 2-s-，-S-P (O) 2-s-，-S-P (0，S) -S-, -S-P (S) 2-s-，-0-P0 (R") -o-，-0-P0 (OCH3) -0-，-0-P0 (0 CH2CH3) -0-，-0-P0 (0 CH2CH2S-R) -0-，-0-P0 (BH3) -0-，-0-P0 (NHRn) -0-，-O-P (0) 2-NRh H-, -NRh-P (0) 2~0~, -O-P (0，NRh) -0-，-CH2-P (0) 2~0~, -O-P (0) 2_CH2-，和-O-Si (R") 2-0-;其中，考慮-CH2-C0-NRh-、-CH2-NRh-0-、-S-CH2-0-、-0-P (0) 2-0-0-P (-0，S) -0-、-0-P (S) 2-0-,-NRh P (0) 2-0-,-O-P (0，NRh) -0-,-O-PO (R") -0-,-O-PO (CH3) -0-和-0-P0 (NHRn) -0-，其中Rh選自氫和Ch烷基，且R〃選自CV6烷基和苯基。進(jìn)一步的示例性實(shí)例列于Mesmaeker et.al, 1995, Current Opinion in Structural Biology, 5:343-355和 SusanM.Freier and Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol25:pp4429_4443中。
[0050]寡核苷酸的另外的修飾形式詳細(xì)描述于美國專利申請?zhí)?0040219565中，其公開通過引用整體合并于此。
[0051]修飾的寡核苷酸也可含有一個(gè)或多個(gè)取代的糖部分。在某些方面，寡核苷酸在2’位置包含下列基團(tuán)中的一個(gè):0H;F;0-，S-，或N-烷基；0-，S-，或N-烯基；0-，S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可是取代或未取代的Cl至ClO烷基或C2至ClO烯基和炔基。其他實(shí)施方式包括0[ (CH2)n0]mCH3, O(CH2)n0CH3, O(CH2)nNH2, 0 (CH2) nCH3, 0 (CH2) n0NH2 和 0 (CH2) nON [ (CH2) nCH3] 2，其中 n 和 m在 I 至大約 10。其他寡核苷酸在2’位置包含下列基團(tuán)中的一個(gè):C1至ClO低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3> 0CN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3> SOCH3>S02CH3、ONO2, NO2, N3> NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、多聚氨基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)、嵌入劑、改善寡核苷酸的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)、或改善寡核苷酸藥效的基團(tuán)、和其他具有相似性質(zhì)的取代基。在一個(gè)方面，修飾包括2’-甲氧基乙氧基(2，—O-CH2CH20CH3,也稱為2’ —O-(2—甲氧基乙氧基)或2’ —Μ0Ε) (Martin etal, 1995，HeIv.CMm.Acta, 78:486-504)即，烷氧基烷氧基基團(tuán)。其他修飾包括2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即，0(CH2)20N(CH3)2基團(tuán)，也稱為2’-DMA0E，如下列實(shí)施例中所述，和2’ - 二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域也稱為2’ -O- 二甲基_氨基_乙氧基_以及或2’ -DMAE0E)，即，2’ -O-CH2-O-CH2-N (CH3)2,也描述于下列實(shí)施例中。
[0052]其他修飾包括2’ -甲氧基(2’ -O-CH3)，2’ -氛基丙氧基(2’ -OCH2CH2CH2NH2)，2’ -稀丙基(2’ -CH2-CH = CH2)，2’ -O-烯丙基(2’ -O-CH2-CH = CH2)和 2’ -氟代(2’ -F)。該 2’ 修飾可以在阿拉伯糖(arabino)(上)位置或核糖(ribo)(下)位置，在一方面，2’-阿拉伯糖修飾是2’-F。也可在寡核苷酸上進(jìn)行相似修飾，例如在3’末端核苷酸或在2’-5’連接的寡核苷酸中的糖的3’位置，和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可具有糖類似物，例如環(huán)丁基部分取代戍呋喃(pentofuranosyl)糖。參見,例如美國專利4，981,957 ;5，118,800 ；5，319，080 ；5, 359，044 ；5, 393，878 ；5, 446，137 ；5, 466，786 ；5, 514，785 ；5, 519，134 ；5，567，811 ；5, 576，427 ；5, 591，722 ；5, 597，909 ；5, 610，300 ；5, 627，053 ；5, 639，873 ；5，646，265 ；5, 658，873 ；5, 670，633 ；5, 792，747 ;和 5，700，920，其公開通過引用整體合并于此。
[0053]在一方面,糖的修飾包括鎖定的核酸(Locked Nucleic Acids, LNAs),其中2’-輕基被連接到糖環(huán)的3’或4’碳原子上，從而形成雙環(huán)糖部分。該連接在某些方面是亞甲基(-CH2-)n基團(tuán)，橋接2’氧原子和4’碳原子，其中η是I或2。LNAs及其制備記載于W098/39352 和 W099/14226 中。 [0054]寡核苷酸也可包括堿基修飾或取代，此處使用的“未修飾”或“天然的”堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，和嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的堿基包括其他合成和天然的堿基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-甲基和其他烷基取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，2-丙基和其他烷基取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶堿基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫脲嘧啶，8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵代、特別是5-溴代、5-三氟代甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基鳥嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮鳥嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤和3-脫氮鳥嘌呤(deazaguanine)和3_脫氮腺嘌呤(deazaadenine)。進(jìn)一步修飾的堿基包括三環(huán)嘧啶，例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b] [I, 4]苯并噁嗪-2(3H)_酮)，吩塞秦胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b] [1，4]苯并塞嗪-2(3H)_酮)，G-clamps例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b] [1,4]苯并噁嗪-2(3H)_酮)，咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)，嘧啶吲哚胞苷(H-嘧啶并[3，，2’:4，5]吡咯并[2，3-d]pyrimidin-2-酮)。修飾的堿基還可包括那些其中嘌呤或嘧啶堿基被其他雜環(huán)取代的堿基，例如7-脫氮-腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤，2-氨基吡啶和2-吡啶酮。另外的堿基包括公開于美國專利3，687，808 中的喊基，公開于The Concise Encyclopedia Of Polymer ScienceAnd Engineering, pages858_859, Kroschwitz, J.L, ed.John ffiley&Sons, 1990 中的喊基,公開于 Englisch et al, 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30:613 和Sanghvi, Y.S., Chapterl5, Antisense Research and Applications,pages289_302,Crooke, S.T.and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993中的喊基。這些喊基中的某些用于提高親和性，包括5-取代的嘧啶，6-氮嘧啶和N-2，N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔尿嘧啶和5-丙炔胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已經(jīng)證明提高核酸雙鏈的穩(wěn)定性0.6-1.2°C，而且在某些方面，與2’-O-甲氧基乙基糖修飾結(jié)合。參見，例如美國專利 3，687，808，美國專利 4，845，205 ;5，130，302 ;5，134，066 ;5，175，273 ;5，367，066 ；5，432，272 ;5，457，187 ;5，459，255 ;5，484，908 ;5，502，177 ;5，525，711 ;5，552，540 ；5，587，469 ;5，594，121，5，596，091 ;5，614，617 ;5，645，985 ;5，830，653 ;5，763，588 ；6，005，096 ;5，750，692和5，681，941，其公開通過引用合并于此。
[0055]“修飾的堿基”或其他先死屬于指能夠與天然堿基(例如，腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和/或胸腺嘧啶)配對(duì)的組合物，和/或能夠與非天然產(chǎn)生的堿基配對(duì)的組合物。在某些方面，該修飾的堿基提供15，12，10，8，6，4，或2°C的Tm差異。示例性修飾堿基記載于EP1072679 和 W097/12896 中。
[0056]“核酸堿基”指的是天然產(chǎn)生的核酸堿基腺嘌呤㈧、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及非天然產(chǎn)生的核酸堿基，例如黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧-N6-甲基腺嘌呤、7-脘氮雜黃嘌呤、7-脘氮雜鳥嘌呤、N4, N4-乙氧基胞嘧啶、N’，N’ -乙氧基-2，6- 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mC)、5- (C3-C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并嘧啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷和在Benneret al, U.S.Pat.N0.5，432，272 和 Susan M.Freier and Karl-Heinz Altmann, 1997, NucleicAcids Research, vol.25: pp4429_4443中公開的“非天然產(chǎn)生”核酸堿基。因此，術(shù)語“核酸堿基”不僅包括已知的嘌呤和嘧啶雜環(huán)，還包括它們的雜環(huán)類似物及互變異構(gòu)體。進(jìn)一步地，天然和非天然產(chǎn)生的核酸堿基包括在U.S.Pat.N0.3, 687, 808 (Merigan, et al), inChapterl5by Sanghvi, in Antisense Research and Application,Ed.S.T.Crooke andB.Lebleu, CRC Press, 1993, in Englisch et al, 1991, Angewandte Chemie, InternationalEdition, 30:613-722 (具體參見 622 和 623 頁，和 Concise Encyclopedia of PolymerScience and Engineering, J.1.Kroschwitz Ed., John ffiley&Sons, 1990，pages858_859, Cook, Ant1-Cancer Drug Designl991, 6, 585-607,其各自通過引用合并于此)中公開的核酸堿基。術(shù)語“核苷酸堿基”和“堿基單元”進(jìn)一步包括化合物，例如可以作為核苷酸使用的雜環(huán)化合物，包括確定的“通用堿基”，傳統(tǒng)上其不是核苷酸堿基但是發(fā)揮核苷酸堿基的作用。特別提及的通用的堿基為3-硝基吡咯，可以被吲哚類(例如，5-硝基吲哚)取代，還可以被次黃嘌呤取代。另外需要的通用堿基包括，吡咯、二唑或三唑衍生物，包括在本領(lǐng)域中已知的通用喊基。
[0057]多肽
[0058]此處所以的屬于“多肽”是指天然產(chǎn)生的、合成制備的或重組制備的肽、蛋白質(zhì)、氨基酸聚合物、激素、病毒和抗體。多肽還包括脂蛋白和翻譯后修飾的蛋白質(zhì)，例如，糖基化蛋白，以及在其D-或L-構(gòu)型和/或擬肽單元中作為其結(jié)構(gòu)的部分具有D-氨基酸、修飾、衍生或非天然產(chǎn)生的氨基酸的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)物質(zhì)。
[0059]用于本發(fā)明的方法的肽包括來自可商購來源的肽。肽庫包括:⑴結(jié)構(gòu)性肽庫，包含小的、二硫鍵約束的環(huán)肽化合物，大小為六至十二個(gè)氨基酸，其中各個(gè)庫中不同肽結(jié)構(gòu)的數(shù)量超過十億；(ii)線性肽庫，其中在20-mer肽中各個(gè)位點(diǎn)的19個(gè)氨基酸(無半胱氨酸)允許形成100億個(gè)肽的庫；(iii)底物噬菌體肽庫，其中在13-mer肽中各個(gè)位點(diǎn)的所有的19個(gè)氨基酸允許形成大約1000億個(gè)肽的庫。
[0060]可商購的妝庫包括來自Peptide libraries Eurogentec s.a.(Belgium)，DyaxCorp.(Cambridge, MA)和 Cambridge Peptide (Cambridge, UK)的妝庫。
[0061]本領(lǐng)域公知用于本發(fā)明的方法實(shí)施的肽庫的制備，如Jung (ed) CombinatorialPeptide and Nonpeptide Libraries:A Handbook and in Devlin et al, 1990, Science, VoI249, Issue4967:404-406所述,還可以通過利用可商購的合成試劑盒制備,該試劑盒例如可以購自 Sigma-Genosys。
[0062]用于本發(fā)明的方法的蛋白質(zhì)包括衍生自合成的蛋白質(zhì)庫(記載于Matsuura, etal,2002,Protein Sciencel1:2631-2643，Ohuchi et al., 1998, Nucleic Acids Res.Octoberl ；26(19): 4339-4346, W0/1999/011655, W0/1998/047343, US 專利號(hào) 6844161 和 US專利號(hào)6403312)的蛋白質(zhì)。用來生產(chǎn)蛋白質(zhì)庫的可商購的試劑盒也為本領(lǐng)域已知，并且可以購自，例如 BioCat GmbH(Heidelberg)。
[0063]用于本發(fā)明的方法的實(shí)施的蛋白質(zhì)庫也可以商購，例如購自Dyax公司(馬薩諸塞州劍橋)。
[0064]可檢測標(biāo)記物/標(biāo)記
[0065]不管相互作用的所鑒定的化合物的類型是什么，此處所用的術(shù)語“標(biāo)記物”可以和“標(biāo)記”互換，本發(fā)明提供方法，其中多核苷酸或多肽復(fù)合物形成通過可視的改變而被檢測到。在一個(gè)方面，復(fù)合物形成提供顏色改變，可以用裸眼或分光鏡觀察。當(dāng)使用金納米顆粒時(shí)，隨著納米顆粒的聚集，發(fā)生紅色至藍(lán)色的改變，經(jīng)常用裸眼觀察到。本發(fā)明中，認(rèn)為所述聚集的發(fā)生是分離的納米顆粒結(jié)合到同樣的標(biāo)靶分子的結(jié)果，各個(gè)分離的納米顆粒含有結(jié)合到特異性但是位于標(biāo)靶分子的不同部分的結(jié)合部分。
[0066]在另一方面，多核苷酸或多肽復(fù)合物形成引起聚集的發(fā)生，其可以用電子顯微鏡或比濁法觀察到。一般情況下，納米顆粒的聚集導(dǎo)致等離子體激元共振的減低。在又一方面，復(fù)合物形成導(dǎo)致聚集的納米顆粒的沉淀，其可以用裸眼或顯微鏡觀察。
[0067]在一個(gè)方面，用裸眼進(jìn)行的顏色改變的觀察在對(duì)比色的背景下進(jìn)行。例如，當(dāng)使用金納米顆粒時(shí)，通過將雜交溶液樣本點(diǎn)到固體白色表面上來促進(jìn)顏色改變的觀察(例如但不限于，二氧化硅或氧化鋁TLC板、濾紙、硝酸纖維素膜、尼龍膜或C-18 二氧化硅TLC板)，然后干燥該點(diǎn)樣。最初，該點(diǎn)樣保留雜交溶液的顏色，沒有雜交時(shí)其顏色大致為粉紅/紅色，如果發(fā)生了雜交，則為略帶紫色-紅色/紫色。當(dāng)在室溫或80°C干燥時(shí)(溫度并不是關(guān)鍵)，如果納米顆粒-寡核苷酸綴合物在點(diǎn)樣之前已經(jīng)通過雜交連接，則形成藍(lán)色點(diǎn)。沒有雜交時(shí)，點(diǎn)是粉紅色的。藍(lán)色和粉紅色的點(diǎn)是穩(wěn)定的，不會(huì)在后面的冷卻或加熱中改變，也不會(huì)隨著時(shí)間改變，提供了該檢測的方便的永久記錄。其他步驟(例如將雜交和未雜交的納米顆粒-寡核苷酸綴合物分離的步驟)對(duì)于觀察該顏色改變不是必須的。
[0068]用于使本發(fā)明的實(shí)施的結(jié)果可視化的備選方法是將納米顆粒探針的樣本點(diǎn)樣到薄膜纖維濾器上(例如，硼硅酸鹽微纖維濾器，0.7微米孔徑，F(xiàn)G75級(jí)別，用于13nm大小的金納米顆粒)，同時(shí)通過該濾器抽去液體。然后通過該濾器漂洗掉過量的未雜交的探針，剩下可觀察到的點(diǎn)，該點(diǎn)中包含由于納米顆粒探針的雜交產(chǎn)生的聚集物(因?yàn)檫@些聚集物大于該濾器的孔)。由于可以使用過量的納米顆粒，這個(gè)技術(shù)允許了更大的敏感度。
[0069]應(yīng)理解所述標(biāo)記物包括此處所述的任何熒光團(tuán)以及本領(lǐng)域已知的其他可檢測標(biāo)記物。例如，標(biāo)記物也可包括但不限于，氧化-還原活性探針(redox active probes)其他納米顆粒，和量子點(diǎn)，以及任何能夠用分光鏡手段檢測的標(biāo)記物，即可以使用顯微鏡和血細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測的標(biāo)記物。
[0070]標(biāo)記寡核苷酸的方法
[0071] 用熒光分子標(biāo)記寡核苷酸和測量熒光的方法為本領(lǐng)域所公知。適宜的熒光分子也為本領(lǐng)域所公知，包括但不限于:1，8-ANS(l-苯胺基萘-8-磺酸)、1_苯胺基萘-8-磺酸(I, 8-ANS)、5-(和-6) -羧基-2’，7’ - 二氯熒光素 pH9.0、5_FAMpH9.0、5-R0X(5_ 羧基-X-羅丹明，三乙基銨鹽)、5-R0X pH7.0、5-TAMRA、5-TAMRA pH7.0,5-TAMRA-MeOH,6JOE,6，8- 二氟-7-羥基-4-甲基香豆素pH9.0、6-羧基羅丹明6G pH7.0、6_羧基羅丹明6G、鹽酸化物、 6-HEX、SE ρΗ9.0、6_ΤΕΤ、SE ρΗ9.0、7_ 氨基-4-甲基香豆素 ρΗ7.0、7_ 羥基-4-甲基香 ? 素、7_ 羥基 _4_ 甲基香 ? 素 ρΗ9.0、Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa Fluor430 抗體綴合物 ρΗ7.2、Alexa Fluor488 抗體綴合物 ρΗ8.0、AlexaFluor488hydrazide-water> Alexa Fluor532 抗體綴合物 pH7.2、Alexa Fluor555 抗體綴合物ρΗ7.2、Alexa Fluor568抗體綴合物ρΗ7.2、Alexa Fluor610R-藻紅蛋白鏈霉素pH7.2、AlexaFluor647 抗體綴合物 ρΗ7.2、Alexa Fluor647R-藻紅蛋白鏈霉素 ρΗ7.2、AlexaFluor660 抗體綴合物 ρΗ7.2、Alexa Fluor680 抗體綴合物 ρΗ7.2、Alexa Fluor700 抗體綴合物 ρΗ7.2、Allophycocyanin ρΗ7.5、AMCA 綴合物、氨基香豆素、APC (別藻藍(lán)蛋白)，Atto647、BCECF pH5.5、BCECF pH9.0、BFP (藍(lán)色熒光蛋白)、BO-PRO-1-DNA、B0-PR0-3-DNA、BOBO-1-DNA、B0B0-3-DNA、B0DIPY650/665-X、MeOH, BODIPY FL 綴合物、BODIPY FL、MeOH,Bodipy R6G SE、BODIPY R6G、MeOH、BODIPY TMR-X 抗體綴合物 ρΗ7.2、Bodipy TMR-X 綴合物、BODIPY TMR-X、MeOH、BODIPY TMR-X、SE、BODIPY TR-X 類鬼筆環(huán)肽 pH7.0、BODIPYTR-X, MeOH、BODIPY TR-X, SE、BOPRO-1、B0PR0-3、鈣黃綠素、鈣黃綠素 pH9.0、鈣深紅、鈣深紅Ca2+、鈣綠、鈣綠-1Ca2+、鈣橙、鈣橙Ca2+、羧基萘并熒光素pH10.0Xascade藍(lán)、Cascade藍(lán)BSA pH7.0、Cascade 黃、Cascade 黃抗體綴合物 ρΗ8.0、CFDA, CFP(氰熒光蛋白)、C1-NERFpH2.5,C1-NERF ρΗ6.0、檸檬黃、香豆素、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5,CyQUANT GR-DNA、丹磺酰尸胺、丹磺酰尸胺、MeOH、DAP1、DAP1-DNA, Dapoxyl (2-氨乙基)氨苯磺胺、DDAO pH9.0、二 -8ANEPPS、二 -8-ANEPPS-脂、DiI, DiO, DM-NERF ρΗ4.0、DM-NERF ρΗ7.0、DsRecU DTAF,dTomato、eCFP(增強(qiáng)的氰突光蛋白)、eGFP(增強(qiáng)的綠色突光蛋白)、Eosin、Eosin抗體綴合物PH8.0、赤蘚紅-5-異硫氰酸酯pH9.0、溴化乙錠、胡米胺同二聚體、胡米胺同二聚體-1-DNA、eYFP(增強(qiáng)的黃色熒光蛋白)、FDA、FITC、FITC抗體綴合物pH8.0、FlAsH、Fluo_3、Fluo-3Ca2+、Fluo-4、Fluor-Ruby、熒光素、熒光素0.1M NaOH、熒光素抗體綴合物ρΗ8.0、熒光素葡聚糖 ρΗ8.0、熒光素 pH9.0、Fluoro-Emerald、FMl-43、FMl-43 脂、FM4_64、FM4_64、2%CHAPS>Fura 紅 Ca2+、Fura 紅，高 Ca、Fura 紅，低 Ca、Fura-2Ca2+、Fura_2,高 Ca、Fura_2,無 Ca、GFP (S65T)、HcRed, Hoechst33258、Hoechst33258_DNA、Hoechst33342、Indo-lCa2+、Indo-1,無 Ca、Indo-1, Ca 飽和、JC-1, JC-1 ρΗ8.2、Lissarnine 羅丹明、LOLO-1-DNA、熒光黃、CH、LysoSensor 藍(lán)、LysoSensor 藍(lán) pH5.CKLysoSensor 綠、LysoSensor 綠 pH5.CKLysoSensor 黃ρΗ3.0、LysoSensor 黃 ρΗ9.0、LysoTracker 藍(lán)、LysoTracker 綠、LysoTracker 紅、續(xù)綠、續(xù)綠 Mg2+、續(xù)澄、Marina 藍(lán)、mBanana、mCherry、mHoneydew、MitoTracker 綠、MitoTracker 綠FM、MeOH、Mito Tracker 澄、MitoTracker 澄、MeOH、MitoTracker 紅、MitoTracker 紅、MeOH、mOrange、mPlum、mRFP、mStrawberry、mTangerine、NBD_X、NBD-X、MeOH、NeuroTrace500/525、綠色突光 Nissl 染色的 RNA、Nile 藍(lán)、EtOH、Nile 紅、Nile 紅-脂、Nissl、Oregon 綠488、Oregon 綠 488 抗體綴合物 ρΗ8.0、Oregon 綠 514、Oregon 綠 514 抗體綴合物 ρΗ8.0、Pacific 藍(lán)、Pacific 藍(lán)抗體綴合物 ρΗ8.0、Phycoerythrin、PicoGreen dsDNA 定量試劑、PO-PRO-1、PO-PRO-1-DNA、PO-PRO-3、P0-PR0-3-DNA、POPO-1, POPO-1-DNA、P0P0-3、普羅匹定碘化物、普羅匹定碘化物-DNA、R-Phycoerythrin pH7.5、ReAsH、Resorufm、ResorufinρΗ9.0、Rhod-2、Rhod-2Ca2+、羅丹明、羅丹明 110、羅丹明 110ρΗ7.0、羅丹明 123、MeOH、羅丹明綠、羅丹明鬼筆環(huán)肽PH7.0、羅丹明Red-X抗體綴合物pH8.0、羅丹明綠pH7.0、Rhodol綠抗體綴合物 ρΗ8.0、Sapphire、SBF1-Na+、鈉綠 Na+、硫代羅丹明 101、EtOH、SYBR 綠 1、SYPRORuby, SYT013-DNA、SYT045-DNA、SYTOX 藍(lán)-DNA、四甲基羅丹明抗體綴合物 pH8.0、四甲基羅丹明葡聚糖 ρΗ7.0、Texas 紅-X 抗體綴合物 ρΗ7.2、TO-PRO-1-DNA、T0-PR0-3-DNA、T0T0-1-DNA、T0T0-3-DNA、TRITC、X-Rhod-lCa2+、YO-PRO-1-DNA、Y0-PR0-3-DNA、YOYO-1-DNA和 Y0Y0-3-DNA。
[0072]在又一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用連接到兩種不同的顆粒上的兩種類型的熒光標(biāo)記的寡核苷酸，只要該納米顆粒具有淬滅所使用的可檢測標(biāo)記物的能力。適宜的顆粒包括聚合物顆粒(例如但不限于聚苯乙烯顆粒、聚乙烯顆粒、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯顆粒)、玻璃顆粒、膠乳顆粒、瓊脂糖顆粒和其他本領(lǐng)域公知的類似顆粒。將寡核苷酸連接到這些顆粒上的方法為本領(lǐng)域公知，在本領(lǐng)域中常規(guī)使用。參見:Chrisey et al, 1996, Nucleic AcidsResearch, 24: 3O31-3O39 (玻璃)和 Charreyre et al, 1997Langmuir, 13:3103-3110, Fahyet al, 1993, Nucleic Acids Research,21:1819-1826, Elaissari et al, 1998, J.ColloidInterface ScI,202:251-260, Kolarova et al,1996，Biotechniques, 20:196-198 和 Wolfet al, 1987, Nucleic Acids Research, 15:2911-2926 (聚合物 / 膠乳).[0073]可以使用除了突光分子之外的其他標(biāo)記,例如化學(xué)發(fā)光分子(chemiluminescentmolecules)，其在雜交時(shí)會(huì)給予可檢測信號(hào)或可檢測信號(hào)的改變。
[0074]納米顆粒
[0075]此處使用的〃納米顆?！ㄉ婕霸谌魏畏较蛐∮?0微米的小結(jié)構(gòu)，優(yōu)選小于5微米?？偟膩碚f，所述納米顆粒包括對(duì)本文中所述寡核苷酸具有高負(fù)載容量的具有任何化合物或物質(zhì)。用于本發(fā)明實(shí)施的納米顆粒包括金屬(例如金、銀、銅和鉬)、半導(dǎo)體(例如CdSeXdS和CdS或包被有的ZnS的CdSe)和磁性(例如鐵磁體)膠體材料，只要這些納米顆粒具有淬滅另外的可檢測標(biāo)記物的能 力。用于本發(fā)明實(shí)施的其他納米顆粒包括ZnS、ZnO、TiO2、Ag1、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3' In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs 和 GaAs。納米顆粒的大小優(yōu)選為大約5nm至大約150nm (平均直徑),更優(yōu)選大約5至大約50nm,最優(yōu)選大約10至大約30nm。也可以考慮納米顆粒的大小為大約5至大約10nm、或者大約5至大約20nm、或者大約5至大約30nm、或者大約5至大約40nm、或者大約5至大約60nm、或者大約5至大約70ran、或者大約5至大約80nm、或者大約5至大約90nm、或者大約5至大約100nm、或者大約5至大約llOnm、或者大約5至大約120nm、或者大約5至大約130nm、或者大約5至大約140nm、或者大約10至大約20nm、或者大約10至大約40nm、或者大約10至大約50nm、或者大約10至大約60nm、或者大約10至大約70nm、或者大約10至大約80nm、或者大約10至大約90nm、或者大約10至大約100nm、或者大約10至大約llOnm、或者大約10至大約120nm、或者大約10至大約130nm、或者大約10至大約140nm、或者大約10至大約150nm。納米顆粒也可以是桿、棱柱或四面體。
[0076]因此，納米顆粒考慮在本方法中使用的，其包括利用各種無機(jī)材料，包括但不僅限于，金屬，半導(dǎo)體材料，或在US patent application No20030147966中描述的陶瓷。例如，金屬納米顆粒包括那些本文所描述的。陶瓷納米顆粒材料，包括但不限于，磷酸氫鈣，磷酸三鈣，氧化鋁，二氧化硅和氧化鋯。制造納米顆粒的有機(jī)材料包括碳素材料。納米顆粒聚合物包括聚苯乙烯，硅橡膠，聚碳酸酯，聚氨酯，聚丙烯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚氯乙烯，聚酯，聚醚，和聚乙烯?？缮锝到?，生物聚合物(如:多肽如BSA，多糖等)，其他生物材料(如糖)和/或聚合化合物也考慮為生產(chǎn)納米顆粒使用。
[0077]在實(shí)踐中，本發(fā)明的方法是提供使用任何合適的納米顆粒及其所具有附分子一般在本領(lǐng)域已知的范圍內(nèi)檢測化驗(yàn)使用合適的，不符合多核苷酸復(fù)合物形成，即雜交干擾，形成雙重鏈或三鏈復(fù)雜。顆粒的大小，形狀和化學(xué)成分有助于產(chǎn)生寡核苷酸功能化納米顆粒的屬性。這些屬性包括，例如，光學(xué)性能，光電性能，電化學(xué)性能，電子性能，穩(wěn)定的各種解決方案，磁性和孔徑大小的變化和渠道。對(duì)具有不同尺寸，形狀和/或化學(xué)成分，以及具有統(tǒng)一的尺寸，形狀和化學(xué)成分利用納米顆粒，顆?；旌衔锟紤]使用。適當(dāng)顆粒的例子包括但不限于納米顆粒聚合顆粒，各向同性(如球形顆粒)和各向異性微粒(如非球面桿，四面體，棱鏡)和核殼，如 2002 年 12 月 28 日提出的 US patent application Ser.N0.10/034，451和 2002 年 12 月 28 日提出的 International application n0.PCT/US01/50825 中描述的那些顆粒，其公開以整體引入本文作為參考文獻(xiàn)。
[0078]制作金屬，半導(dǎo)體和磁性納米顆粒的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。見，例如，Schmid, G.(ed.) Clusters and Colloids (VCH, ffeinheim, 1994) ；Hayat, MA(ed.) ColloidalGold:Principles, Methods, and Applications(Academic Press, San Diego, 1991)；Massart, R., IEEE Transactions On Magnetics, 17, 1247 (1981) ；Ahmadi, TS etal, Science, 272, 1924(1996) ；Henglein, A.et al, J.Phys.Chem., 99, 14129 (1995)；Curtis, AC et al., Angew.Chem.1nt.Ed.Engl, 27, 1530 (1988).制備氰基丙烯酸酯納米顆粒的制備在 Fattal, et al., J.Controlled Release (1998) 53:137-143 和 US PatentN0.4，489，055 中描述。Liu 等人，在 J.Am.Chem.Soc.(2004) 126:7422-7423 中描述用于制造包括聚(D-glucaramidoamine)的納米顆粒的方法。Tondelli等人在Nucl.(1998)26:5425-5431中描述了包括聚合的甲基丙烯酸甲酯(MMA)的納米顆粒的制備，和例如 Kukowska-Lata l1 等人在 Proc.Natl.Acad.ScL USA (1996) 93:4897-4902 (Starburstpolyamidoamine dendrimers)(星爆樹枝狀聚酰胺)中描述的樹枝狀納米顆粒的制備。
[0079]適用于納米顆粒也可以商業(yè)獲得，例如，Ted Pella, Inc.(金)，AmershamCorporation (金)和 Nanoprobes, Inc.(金).。
[0080]另外，US patent application No20030147966中也描述,含有本文所述材料的納米顆粒，均可以商業(yè)獲得，或可以從溶液中漸進(jìn)成核獲得(如膠體反應(yīng))，或通過各種物理和化學(xué)氣相沉積過程獲得，如濺射沉積。見，例如，HaVashi，(1987) Vac.Sc1.Technol.July/Augustl987, A5(4):1375-84 ；Hayashi, (1987)Physics Today, Decemberl987, pp.44-60 ；MRS Bulletin, Januaryl990, pgs.16-47。
[0081]為進(jìn)一步在US patent application No20030147966所述，考慮的納米顆粒是利用HAuCl4和檸檬酸-還原劑，使用本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)。見，例如Marinakos etal, (1999)Adv.Mater.11:34-37 ；Marinakos et al, (1998)Chem.Mater.10:1214-19 ；Enustun&Turkevich, (1963) J.Am.Chem.Soc.85:3317。具有分散聚集顆粒的氧化錫納米顆粒，其粒徑大小大約 140nm,可從 Vacuum Metallurgical C0., Ltd.0f Chiba, Japan 商業(yè)獲得。其他可商業(yè)獲得的各種成分和顆粒大小不等的納米顆?？梢詮?，例如，VectorLaboratories, Inc.0f Burlingame, Calif 獲得
[0082]具有結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換功能的納米顆粒
[0083]識(shí)別序列[0084]在其他的實(shí)施方案，其可檢測的變化是寡核苷酸與分子(例如，沒有限制，熒光分子和染料)標(biāo)記，其中納米顆粒上產(chǎn)生寡核苷酸雜交可檢測的變化。在一個(gè)方面，例如，在納米顆粒上功能化的寡核苷酸或多肽，在納米顆粒連接末端的遠(yuǎn)末端連有標(biāo)記物，并在與標(biāo)靶不連接的情況下，該帶有標(biāo)記物的遠(yuǎn)端定位于足以淬滅該標(biāo)記物的熒光的位置靠近納米顆粒。在一個(gè)方面，金屬和半導(dǎo)體納米顆粒被稱為熒光猝滅劑，隨著淬火影響的程度取決于納米顆粒間的熒光分子的距離。因此，在單鏈狀態(tài)，寡核苷酸連接到納米顆粒的相互作用，通過納米顆粒，例如，一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，通過二級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊，這使熒光分子在鄰近的納米寡核苷酸，使重要的淬火觀察。同樣，在未綁定狀態(tài)，多肽連接到納米顆粒將承擔(dān)構(gòu)，將使其與納米顆粒標(biāo)記和標(biāo)記的臨近，將熄滅。經(jīng)核苷酸多肽復(fù)合物形成，或因目標(biāo)分子通過識(shí)別序列具有約束力，熒光分子將成為間隔距離納米顆粒，減少了熒光猝滅(圖1)。有用的寡核苷酸長度可以確定經(jīng)驗(yàn)。因此，各方面的介紹，金屬和半導(dǎo)體納米顆粒具有熒光標(biāo)記的寡核苷酸多肽所附或在對(duì)任何格式的檢測用于此處。
[0085]將寡核苷酸連接到納米顆粒
[0086]所提供的方法中使用的納米顆粒，與寡核苷酸，或其修飾形式功能化，其為大約5到大約100個(gè)核苷酸長度。方法也考慮其寡核苷酸是從大約5至大約90個(gè)核苷酸長度，大約5至大約80個(gè)核苷酸長度,大約5至大約70個(gè)核苷酸長度,大約5到大約60個(gè)核苷酸長度，大約5到大約50個(gè)核苷酸長度，長約5至約45個(gè)核苷酸長度，大約5至大約40個(gè)核苷酸長度，大約5至大約35個(gè)核苷酸長度，大約5至大約30個(gè)核苷酸長度，大約5到大約25個(gè)核苷酸長度，大約5至大約20個(gè)核苷酸長度，大約5至15個(gè)核苷酸長度，大約5到大約10個(gè)核苷酸長度，和所有的寡核苷酸介于其間的大小長度，具體公開到寡核苷酸能達(dá)到預(yù)期的效果的程度。因 此，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，和 100個(gè)核苷酸的寡核苷酸是考慮的。
[0087]在另一些方面，寡核苷酸包括來自大約8至大約80個(gè)核苷酸(即從大約8至大約80個(gè)連接的核苷)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解到的方法利用8，9，10，11，12，13，14，15，16，17化合物，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，或 80 個(gè)核苷酸長度。
[0088]納米顆粒，寡核苷酸或兩者都功能化以將寡核苷酸連接到納米顆粒。這種方法是本領(lǐng)域已知的。例如，寡核苷酸以硫醇在其3’末端或5’末端功能化，易于連接到金納米顆粒。見 Whitesides, 1995，Proceedings of the Robert A.Welch Foundation39thConference On Chemical Research Nanophase Chemistry, Houston, Tex.，pageslO9-121。另見，Mucic et al，1996，Chem.Commun.555-557 (描述了連接 3’ 巰基 DNA 至平坦金表面的方法，這方法可用于寡核苷酸連接到納米顆粒)。該硫醇方法也可用于將寡核苷酸連接到其他金屬，半導(dǎo)體和磁性膠體與上面所列的其他顆粒。寡核苷酸連接到固體表面的其他功能基團(tuán)，包括磷酸基團(tuán)(見，例如，US Pat.N0.5，472，881的寡核苷酸憐酸酯結(jié)合到金表面)，取代alkylsiloxanes (參見Burwell, 1974, ChemicalTechnology, 4:370_377Matteucci 和 Caruthers, 1981, J.Am.Chem.Soc, 103:3185-3191的寡核苷酸結(jié)合到二氧化硅和玻璃表面，和Grabar等人，Anal.Chem.，67:735-743的aminoalkylsi1xanes 的結(jié)合和類似 mercaptoaklylsiloxanes 的結(jié)合)。寡核苷酸以5’ thionucleoside或3’ thionucleoside終止也可用于連接寡核苷酸到固體表面。以下參考描述的其他方法，其可用于連接寡核苷酸到納米顆粒上:NuZZ0等人，1987，J.Am.Chem.Soc, 109:2358 (金載二硫化物)；Allara and Nuzz。，1985，Langmuir, 1:45 (招載羧酸)；Allara and Tompkins, 1974, J.Colloid Interface Sc1.，49:410-421 (銅載羧酸)；Her, The Chemistry Of Silica, Chapter6, (Wileyl979) ( 二氧化娃載羧酸)；Timmons and Zisman, 1965, J.Phys.Chem., 69:984-990(鉬載羧酸)；Soriaga andHubbard, 1982, J.Am.Chem.Soc., 104:3937 (鉬載芳香環(huán)化合物)；Hubbard, 1980, Ace.Chem.Res., 13:177 (sulfolanes,亞諷和鉬等官能溶劑)；Hickman et al., 1989, J.Am.Chem.Soc, 111:7271(鉬 isonitriles) ；Maoz and Sagiv, 1987, Langmuir, 3:1045 ( 二氧化娃載硅烷)；Maozand Sagiv, 1987, Langmuir, 3:1034( 二氧化娃載硅烷)；Wasserman et al., 1989, Langmuir, 5:1074( 二氧化娃載硅烷)；Eltekova andEltekov, 1987，Langmuir, 3:951 ( 二氧化鈦和二氧化娃載芳香族羧酸,醒，醇及甲氧基基K ) ;Lee et al.，1988，J.Phys.Chem.，92:2597 (金屬載剛性的磷酸鹽)。此外，任何連接寡核苷酸到納米顆粒表面上適當(dāng)?shù)姆椒梢允褂?。連接寡核苷酸到一個(gè)表面上首選的一個(gè)方法是基于1999年6月25日提出的US申請Ser.N0.09/344, 667 ；2000年6月26日提出的 Ser.N0.09/603，830 ；2001 年 I 月 12 日提出的 Ser.N0.09/760，500 ；2001 年 3 月 28 日提出的 Ser.N0.09/8 20，279 ;2001 年 8 月 10 日提出的 Ser.N0.09/927，777 ;和 1997 年 7 月 21日提出的國際申請?zhí)朠CT/US97/12783 ;2000年6月26日提出的PCT/US00/17507 ;2001年I月12日提出的PCT/US01/01190 ;2001年3月28日提出的PCT/US01/10071中所描述，其公開以整體引入本文作為參考。陳化進(jìn)程提供意想不到的增強(qiáng)的穩(wěn)定性和選擇性的納米顆粒與寡核苷酸的綴合物。該方法包括提供寡核苷酸共價(jià)鍵結(jié)合，最好有一部分及其功能基團(tuán)，可以綁定到納米顆粒。該部份和功能團(tuán)是那些允許綁定(即化學(xué)吸附或共價(jià)鍵，對(duì)寡核苷酸)的納米顆粒。例如，有一烷基寡核苷酸，一烷基二硫鍵或循環(huán)二硫鍵共價(jià)鍵結(jié)合到了自己的5’或3’端可以用來綁定到一個(gè)核苷酸不同的納米顆粒，包括金納米顆粒。
[0089]該寡核苷酸與足夠的時(shí)間在水中顆粒接觸，以便至少一些寡核苷酸通過官能團(tuán)結(jié)合到納米顆粒。這種時(shí)候可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，大約12-24小時(shí)的時(shí)間給了良好效果。為寡核苷酸結(jié)合其他適當(dāng)?shù)臈l件下也可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。例如，大約10-20nM濃度的納米顆粒和在室溫下孵化提供了良好的效果。
[0090]接著，將至少一種鹽加入水中形成鹽溶液。所述鹽可為任何適于水溶的鹽。例如，所述鹽可為氯化鈉、氯化鎂、氯化鉀、氯化銨、乙酸鈉、乙酸銨以及兩種或更多種這些鹽的組合，或者這些鹽中的一種溶于鹽酸緩沖液中。優(yōu)選，以濃溶液形式加入所述鹽，但是也可以以固體形式加入。可以同時(shí)將鹽全部加入水中，或者在一定時(shí)間內(nèi)逐步加入?！霸谝欢〞r(shí)間內(nèi)逐步加入”是指在一定時(shí)間段內(nèi)將所述鹽分為至少兩部分間隔加入。適宜的時(shí)間間隔可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。
[0091]鹽溶液的離子強(qiáng)度必須足以克服至少部分寡核苷酸之間的靜電排斥，以及帶負(fù)電的寡核苷酸與帶正電的納米顆粒之間的靜電吸引或帶負(fù)電的寡核苷酸與帶負(fù)電的納米顆粒之間的靜電吸引。已發(fā)現(xiàn)，在一定時(shí)間內(nèi)逐步加入鹽以逐漸降低靜電吸引或排斥可得到納米顆粒上最大的寡核苷酸的表面密度。每種鹽或不同鹽的組合的適宜離子強(qiáng)度可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。在磷酸緩沖溶液中氯化鈉的最終濃度為約0.1M到約1.0M，發(fā)現(xiàn)優(yōu)選在一定時(shí)間內(nèi)逐步增加氯化鈉的濃度以獲得好的結(jié)果。
[0092]加入鹽后，在鹽溶液中使寡核苷酸和納米顆粒孵育額外的一段時(shí)間以使足夠的附加的寡核苷酸(sufficient additional oligonucleotides)與納米顆粒結(jié)合形成穩(wěn)定的納米顆粒-寡核苷酸綴合物。如下面詳細(xì)描述的，已發(fā)現(xiàn)，納米顆粒上增加的寡核苷酸表面密度使所述綴合物穩(wěn)定。孵育時(shí)間可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。已發(fā)現(xiàn)，總孵育時(shí)間為約24-48小時(shí)，優(yōu)選40小時(shí)可得到好的結(jié)果(這是總的孵育時(shí)間；如以上所注明，鹽濃度可在這個(gè)總的時(shí)間中逐步增加)。在鹽溶液中孵育的第二時(shí)間段在此稱為“陳化”步驟。這個(gè)“陳化”步驟的其他條件也可由經(jīng)驗(yàn)確定。例如，在室溫和PH7.0的條件下可獲得好的結(jié)果。
[0093]已發(fā)現(xiàn)，采用“陳化”步驟制備的綴合物比不經(jīng)該步驟制備的那些綴合物要穩(wěn)定得多。如以上所注明，這種增加的穩(wěn)定性是由于通過“陳化”步驟獲得的納米顆粒表面增加的寡核苷酸密度導(dǎo)致的。另一種“快速鹽陳化”方法可制備具有相當(dāng)?shù)腄NA密度和穩(wěn)定性的顆粒。在表面活性劑，如大約0.01%的十二烷基硫酸鈉(SDS)、吐溫(Tween)或聚乙烯醇(PEG)存在下加入鹽時(shí)，鹽的陳化步驟可在約I小時(shí)內(nèi)完成。
[0094]由“陳化”步驟獲得的表面密度取決于納米顆粒的大小和類型以及寡核苷酸的長度、序列和濃度?？捎山?jīng)驗(yàn)確定使納米顆粒穩(wěn)定的表面密度以及為納米顆粒和寡核苷酸理想的結(jié)合而獲得所述表面密度的必要條件。通常，至少10皮摩爾/Cm2的表面密度足以提供穩(wěn)定的納米顆粒-寡核苷酸綴合物。優(yōu)選，所述表面密度為至少15皮摩爾/cm2。如果表面密度過高，綴合物的寡核苷酸與核酸和寡核苷酸標(biāo)靶雜交稻能力會(huì)下降，因而表面密度游戲不大于約35-40皮摩爾/cm2。還提供寡核苷酸以至少10皮摩爾/cm2、至少15皮摩爾/cm2、至少20皮摩爾/cm2、至少25皮摩爾/cm2、至少30皮摩爾/cm2、至少35皮摩爾/cm2、至少40皮摩爾/cm2、至少45皮摩爾/cm2、至少50皮摩爾/cm2、或至少50皮摩爾/cm2或更高的表面密度與納米顆粒結(jié)合的方法。
[0095]在此，“雜交”(也間或由術(shù)語“復(fù)合構(gòu)成”代替)表示根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中已知的Watson-Crick DNA互補(bǔ)規(guī)則、Hoogstein結(jié)合規(guī)則或其它序列特異性結(jié)合的規(guī)則通過氫鍵的兩個(gè)或三個(gè)核酸鏈間的相互作用。或者表示根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中已知的序列特異性結(jié)合性能在本文所定義的多肽間的相互作用?？稍诂F(xiàn)有技術(shù)中已知的不同的嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交。在適當(dāng)?shù)膰?yán)謹(jǐn)條件下，在反應(yīng)中兩條互補(bǔ)鏈或兩個(gè)多肽間的雜交可達(dá)到約60%、約70%或更高、約80%或更高、約90%或更高、約95%或更高、約96%或更高、約97%或更高、約98%或更高、或約99%或更高。
[0096]在各個(gè)方面，本發(fā)明的方法包括采用兩個(gè)或三個(gè)相互100%互補(bǔ)，即完全匹配的寡核苷酸或多肽；而在其他方面，各個(gè)寡核苷酸對(duì)于各寡核苷酸的部分長度或全長至少(意思是大于或等于)約95%、至少約90%、至少約85%、至少約80%、至少約75%、至少約70%、至少約65%、至少約60%、至少約55%、至少約50%、至少約45%、至少約40%、至少約35%、至少約30%、至少約25%、至少約20%相互互補(bǔ)。
[0097] 本領(lǐng)域人員應(yīng)理解，本方法所用的寡核苷酸序列不需100%相互互補(bǔ)以便可特異性雜交。此外寡核苷酸可在一個(gè)或多個(gè)片段相互雜交這樣插入的或相鄰的片段不參與雜交(例如，環(huán)狀結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。在任何給定的寡核苷酸間的互補(bǔ)百分?jǐn)?shù)可用現(xiàn)有技術(shù)中已知的 BLAST 程序(Basic Local Alignment Search Tools)和 PowerBLAST 程序常規(guī)確定(Altschul et al, 1990, J.Mo1.Biol, 215:403-410 ；Zhang and Madden, 1997, GenomeRes.,7:649-656)。
[0098]一方面，提供這樣的方法，其中在納米顆粒表面的寡核苷酸的包裹密度足以導(dǎo)致納米顆粒間和在單個(gè)納米顆粒上的多肽間的協(xié)作行為。另一方面，納米顆粒間的所述協(xié)作行為增加了寡核苷酸的耐降解性能。
[0099]如在此所用，“穩(wěn)定”表示在綴合物被制備后的至少6個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，大部分寡核苷酸仍保持與納米顆粒的連接，并且所述寡核苷酸能夠在檢測核酸的方法和納米制備的方法中遇到的標(biāo)準(zhǔn)條件下與核酸和寡核苷酸標(biāo)靶雜交。 [0100]在本方法中提供的每個(gè)所用的納米顆粒具有多個(gè)與其相連的寡核苷酸。結(jié)果，每個(gè)納米顆粒-寡核苷酸綴合物具有與第二寡核苷酸雜交的能力，所述第二寡核苷酸與熒光團(tuán)綴合，所述熒光團(tuán)可檢測地不同于在第一納米顆粒-寡核苷酸綴合物上存在的熒光團(tuán)和在第二納米顆粒上功能化的熒光團(tuán)，并且當(dāng)存在時(shí)，所述第二寡核苷酸是游離的寡核苷酸，具有足夠互補(bǔ)的序列。一方面，提供這樣的方法，其中每個(gè)納米顆粒被同樣的寡核苷酸功能化，即，連接到納米顆粒的寡核苷酸具有相同的長度和相同的序列。另外的方面，每個(gè)納米顆粒被兩種或更多種不同的寡核苷酸功能化，即，在不同的長度和/或不同的序列方面，至少一個(gè)連接的寡核苷酸不同于至少另一個(gè)連接的寡核苷酸。
[0101]術(shù)語“寡核苷酸”或“多核苷酸”包括單個(gè)序列被連接到納米顆粒上或該單個(gè)序列的多個(gè)拷貝被連接。例如，在各個(gè)方面，寡核苷酸以多拷貝前后連接的方式存在，如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)或更多前后連接的重復(fù)序列。
[0102]或者，納米顆粒被功能化以包括至少兩個(gè)具有不同序列的寡核苷酸，前提是每個(gè)寡核苷酸用可檢測的不同標(biāo)記物標(biāo)記。如上，不同的寡核苷酸序列在各個(gè)方面以前后連接和/或以多拷貝的方式排列?；蛘撸哂胁煌蛄械墓押塑账嶂苯优c納米顆粒連接。在具有不同序列的寡核苷酸連接到納米顆粒的方法中，所述方法的各方面包括其中不同的寡核苷酸序列在同一個(gè)多核苷酸上的不同區(qū)域雜交。
[0103]納米顆粒上的寡核苷酸可全部具有相同的序列，或可具有與另一個(gè)納米顆粒連接的多核苷酸的不同部分雜交的不同序列。當(dāng)采用具有不同序列的寡核苷酸時(shí)，每個(gè)納米顆?？删哂信c其相連的所有不同的寡核苷酸，或者不同的寡核苷酸連接到不同的納米顆粒上?；蛘撸诿绹{米顆粒上的寡核苷酸可具有多個(gè)不同的序列，至少一個(gè)序列必須與第二納米顆粒上的多核苷酸的一部分雜交。
[0104]納米-FLARE技術(shù)
[0105]在本發(fā)明的一方面中，寡核苷酸或多肽在結(jié)合部分包含識(shí)別序列，所述結(jié)合部分如在此所描述的與納米顆粒連接?！白R(shí)別序列”如在此所使用的被理解為部分或全部與感興趣的標(biāo)靶分子互補(bǔ)的意思。
[0106]具有相連的包含識(shí)別序列的寡核苷酸結(jié)合部分的納米顆粒首先與報(bào)告序列相連接。如在此所使用的，“報(bào)告序列”被理解為部分或全部互補(bǔ)并因而可與所述結(jié)合部分和其識(shí)別序列雜交的序列。如以上所討論，報(bào)告序列被標(biāo)記，也稱為納米-Flare。進(jìn)一步地，報(bào)告序列在各方面由比識(shí)別序列更少、相同或更多的堿基構(gòu)成，使得結(jié)合部分中的識(shí)別序列與其標(biāo)靶分子的結(jié)合引起雜交的報(bào)告序列的釋放，從而導(dǎo)致與報(bào)告序列相連的標(biāo)記中可檢測和可測定的改變(圖2)。
[0107]在一個(gè)特定方面中，被用于特定標(biāo)靶mRNA的識(shí)別序列功能化的納米顆粒與具有報(bào)告序列且被短互補(bǔ)Cy5標(biāo)記的報(bào)告多核苷酸雜交，其中當(dāng)與納米顆粒上的識(shí)別序列雜交時(shí)Cy5部分的熒光猝滅。這個(gè)報(bào)告序列也能被標(biāo)靶mRNA置換。隨著置換，Cy5部分不再猝滅并發(fā)出熒光，使熒光信號(hào)可檢測并定量，所述熒光信號(hào)與標(biāo)靶序列的量相關(guān)聯(lián)，所述標(biāo)靶序列和具有報(bào)告序列的置換伴隨物的識(shí)別序列雜交。
[0108]納米-Flare利用金納米顆粒(Au NPs)獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)。與分子粹滅劑相比，Au NPs 以更高效率(Dubertret et al, 2001，Nat.Biotechnol.19:365-370)和更大距離(Dulkeith et al, 2005, Nano Lett.5:585-589)猝滅熒光。同樣地，在此描述的所有類型的納米顆粒均可使用，只要它們能猝滅連接的結(jié)合部分的可檢測的標(biāo)記物。
[0109]本領(lǐng)域技術(shù)人員在體外研究的情況下不需過度實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼_定相關(guān)的熔融溫度和/或雜交條件，所述熔融溫度和/或雜交條件將在標(biāo)靶分子不存在時(shí)促進(jìn)報(bào)告劑與識(shí)別序列結(jié)合而在所述標(biāo)靶分子存在時(shí)導(dǎo)致所述報(bào)告序列的置換。
[0110]本發(fā)明通過以下實(shí)施例進(jìn)行說明，這些實(shí)施例不是要以任何方式進(jìn)行限制。
[0111]實(shí)施例
[0112]實(shí)施例1
[0113]本實(shí)施例的目 的在于說明熒光標(biāo)記寡核苷酸修飾的金納米顆粒制劑可以用于檢測細(xì)胞內(nèi)分子標(biāo)靶。作為概念性實(shí)驗(yàn)表明，使用熒光標(biāo)記寡核苷酸修飾的金納米顆粒對(duì)雙細(xì)胞型中mRNA標(biāo)靶的細(xì)胞內(nèi)檢測是非常有效的。這些制劑容易進(jìn)入細(xì)胞中、產(chǎn)生熒光信號(hào)，使用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法都可以容易地讀取。
[0114]具體地說，13nm金納米顆粒被幾個(gè)不同的序列修飾，在一末端以硫醇部分終止、在另一末端以熒光染料終止，并包括轉(zhuǎn)換識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)。缺乏標(biāo)靶時(shí)，染料分子緊密地靠近金納米顆粒表面，導(dǎo)致淬滅及無熒光信號(hào)。存在標(biāo)靶時(shí)，染料分子遠(yuǎn)離金納米顆粒表面，觀察到熒光信號(hào)(圖1)。
[0115]Au NPs通過金-硫醇鍵形式使用含有對(duì)特異性RNA轉(zhuǎn)錄物的18個(gè)堿基識(shí)別單元(圖1)的硫醇化寡核苷酸發(fā)揮功能(Love et al, 2005, Chem.Rev.105:1103-1169)。然后，寡核苷酸功能化Au NPs,與在被長標(biāo)靶或標(biāo)靶區(qū)替代時(shí)發(fā)揮作為“flares”功能的終止報(bào)告序列的短酞菁(Cy5)染料雜交(圖1)。該結(jié)合狀態(tài)下，由于接近Au NP表面，報(bào)告染色單體的Cy5熒光淬滅。存在標(biāo)靶時(shí)，閃光染色單體通過在標(biāo)靶與寡核苷酸修飾Au NP中形成長的更多穩(wěn)定的雙螺旋，被替代而從Au NP釋放。
[0116]實(shí)施例2
[0117]為了進(jìn)一步舉例說明金納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞和檢測細(xì)胞內(nèi)標(biāo)靶分子能力的應(yīng)用，進(jìn)行了體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)。
[0118]穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)了的綠色熒光蛋白的C166哺乳動(dòng)物細(xì)胞被維持在含有10%血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(37°C下、5% CO2)中并給予熒光標(biāo)記寡核苷酸修飾的金納米顆粒制劑，標(biāo)靶增強(qiáng)了的綠色熒光(EGFP)蛋白mRNA。SKBR3人乳腺癌(參見下文)和C166小鼠內(nèi)皮細(xì)胞從美國組織培養(yǎng)庫(ATCC)得到，分別在含有10%熱滅火活胎牛血清的McCoy’s5A培養(yǎng)基和達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中生長，維持在37°C下(5%C02)。將細(xì)胞接種到6或24孔板中，處理之前培養(yǎng)I~2天。處理時(shí)，細(xì)胞約50%鋪滿。該培養(yǎng)基用含有功能化Au NPs的新鮮培養(yǎng)基替換。
[0119]對(duì)照實(shí)驗(yàn)用含有不存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的炭疽RNA用標(biāo)靶區(qū)的顆粒進(jìn)行。轉(zhuǎn)染16小時(shí)后，這些EGFP表達(dá)細(xì)胞用顯示出明亮的熒光信號(hào)的EGFP標(biāo)靶探針處理，與對(duì)照顆粒中觀察到的信號(hào)相比非常強(qiáng)。作為進(jìn)一步的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，顆粒在不表達(dá)EGFP從而不含有EGFPmRNA標(biāo)靶的C166細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在這些實(shí)驗(yàn)中，任何一個(gè)探針在細(xì)胞中都未發(fā)現(xiàn)信號(hào)，因此表面熒光標(biāo)記寡核苷酸修飾的金納米顆粒制劑可以用于檢測特殊的細(xì)胞間分子標(biāo)靶。
[0120]探針進(jìn)入到細(xì)胞中通過使用感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜法得到確認(rèn)，用于對(duì)攝取進(jìn)行定量并除去依賴于攝取效果的任意序列。由這些數(shù)據(jù)確認(rèn)，在典型的實(shí)驗(yàn)之后，含有約100, 000個(gè)金納米顆粒的細(xì)胞以及吸收相同數(shù)目金納米顆粒的C166細(xì)胞與包含在寡核苷酸類中的識(shí)別序列無關(guān)。
[0121]實(shí)施例3
[0122]對(duì)熒光標(biāo)記寡核苷酸修飾的金納米顆粒制劑進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)，以檢測它們的寡核苷酸負(fù)荷及發(fā)熒光信號(hào)能力。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，各金納米顆粒通過含有識(shí)別序列的約60熒光寡核苷酸類發(fā)揮作用。進(jìn)一步地，當(dāng)各寡核苷酸修飾的金納米顆粒制劑的InM溶液被吸收在KCN溶液中時(shí)，都顯示出近似相同的熒光。與該特征數(shù)據(jù)一起，表明缺乏標(biāo)靶時(shí)，熒光標(biāo)記寡核苷酸修飾金納米顆粒制劑顯示出相同的熒光信號(hào)，此外表明觀察到的細(xì)胞內(nèi)發(fā)信號(hào)由特殊的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合情況引起。 [0123]內(nèi)源基因的檢測對(duì)于藥物開發(fā)和遺傳學(xué)研究是非常重要的。因此，金納米顆粒的制備可以用于檢測癌基因存活素的存在。這些顆粒與對(duì)照序列進(jìn)行比較時(shí)，再次顯示出來自A549肺癌細(xì)胞表達(dá)內(nèi)部存活素的明亮的熒光信號(hào)。這些結(jié)果表明，上述熒光標(biāo)記寡核苷酸修飾的金納米顆粒制劑可以被用于正確地讀取天然mRNA標(biāo)靶的存在。
[0124]觀察到的熒光信號(hào)能夠可選擇地在使用單一的臺(tái)式流式細(xì)胞測定器的大量的處理細(xì)胞中被檢測。這些實(shí)驗(yàn)再次突出了對(duì)于這些熒光標(biāo)記寡核苷酸修飾的金納米顆粒制齊麵察到的高效的攝取效率，而且在幾乎全部提供的樣品中都表現(xiàn)出強(qiáng)的指示細(xì)胞內(nèi)mRNA標(biāo)靶存在的信號(hào)。在此，使用Guava Easy Cyte流式細(xì)胞測定器和儀器軟件標(biāo)繪出作為它們的熒光強(qiáng)度函數(shù)的1000細(xì)胞計(jì)數(shù)。在這些實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)與用對(duì)照炭疽標(biāo)靶制劑處理相比，用存活素標(biāo)靶熒光標(biāo)記寡核苷酸修飾的金納米顆粒制劑處理時(shí)，觀察到引人注意地移入到大量A549細(xì)胞表達(dá)存活素的熒光中。該結(jié)果表明，當(dāng)聯(lián)用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法時(shí)，熒光標(biāo)記寡核苷酸修飾的金納米顆粒制劑適用于對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行排序。
[0125]顆粒與用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑成分轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的常規(guī)的淬滅劑-熒光基團(tuán)寡核苷酸序列的比較也是有效的。在相似的條件下，本發(fā)明的顆粒表現(xiàn)出引人注目的發(fā)信號(hào)的能力，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑成分表現(xiàn)出可以忽略不計(jì)的發(fā)信號(hào)能力。即使將它們濃縮10倍，也表現(xiàn)出小的信號(hào)或無信號(hào)，因此表明，在這些條件下，該納米顆粒優(yōu)于常規(guī)的淬滅劑-熒光基團(tuán)寡核苷酸探針。
[0126]總而言之，上述實(shí)施例表明:
[0127]I)金納米顆粒有助于含有能夠探測標(biāo)靶的寡核苷酸的熒光基團(tuán)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
[0128]2)這些熒光標(biāo)記寡核苷酸修飾的金納米顆粒制劑可以用于檢測內(nèi)源性和外源性細(xì)胞內(nèi)標(biāo)靶兩者。[0129]3)熒光信號(hào)表明，特殊mRNA標(biāo)靶的存在可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法的任意一種讀取。
[0130]4)這些制劑的高攝取性和它們的高發(fā)信號(hào)能力使它們適于對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行排序。
[0131] 5)在該研究條件下，這些制劑的高攝取性和它們的高發(fā)信號(hào)能力優(yōu)于常規(guī)的淬滅劑-熒光基團(tuán)寡核苷酸探針。
[0132]6)該原理可以被擴(kuò)展到其它結(jié)構(gòu)中，轉(zhuǎn)換識(shí)別序列，例如核酸適配子和肽類。
[0133]根據(jù)本發(fā)明，還對(duì)另外的含有標(biāo)靶三磷腺苷(ATP)分子的熒光標(biāo)記適配子進(jìn)行了研究。
[0134]本發(fā)明還對(duì)同時(shí)檢測多種細(xì)胞內(nèi)標(biāo)靶的能力以及實(shí)時(shí)定量它們的細(xì)胞內(nèi)濃聚物進(jìn)行了研究。本原理可以用于高等生物體的細(xì)胞功能實(shí)時(shí)監(jiān)控。
[0135]實(shí)施例4
[0136]納米-閃光(nano-flare)已使用13nmAu NP制備，因?yàn)檫@種尺寸的粒子為有效的淬光劑，能夠用寡核苷酸致密功能化(Mirkin et ai，1996，Nature382:607-609)，而且不會(huì)有效地散射可見光，這對(duì)于以最低干擾設(shè)計(jì)光探測很重要。
[0137]Au NP用包含識(shí)別特定RNA轉(zhuǎn)錄物的元素的硫醇化寡核苷酸(圖2)通過金硫醇鍵形成進(jìn)行功能化(Love et ah, 2005，Chem.Rev.105:1103-1169)。寡核苷酸用標(biāo)準(zhǔn)固相亞憐酸胺方法通過 Expedite8909Nucleotide Synthesis System(ABI)合成。主要成分和試劑從Glen Research公司購得。寡核苷酸用反相高性能液體色譜法(HPLC)提純。為了制備納米閃光探測，檸檬酸鹽穩(wěn)定的金納米粒子(13±lnm)用公開的方法(Frens, G., 1973, Nature-Physical Science241:20-22)制備。以每毫升 IOnM 膠體中含有3nmol寡核苷酸的濃度將硫醇改性的寡核苷酸加入到13± Inm金膠體中并攪拌整夜。12個(gè)小時(shí)后，將十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液(10% )加入到混合物中以得到0.1%的SDS濃度。將磷酸鹽緩沖液(0.1M ；pH7.4)加入到混合物中以得到0.01M磷酸鹽濃度，然后將六等份的氯化鈉溶液(2.0M)加入到混合物中超過8個(gè)小時(shí)以得到0.15M的最終氯化鈉濃度。攪拌混合物整夜以完成功能化工藝。離心分離(13，OOOrpm，20min)并在磷酸鹽緩沖液(PBS ;137mM NaCl，IOmM磷酸鹽，2.7niM KCl, pH7.4, Hyclone)中懸浮包含功能化粒子的溶液三次以生產(chǎn)用于隨后全部實(shí)驗(yàn)的提純的Au NP。粒子的濃度通過在524nm( ε = 2.7xlOLmol*Cm〃)處測定它們的消光來確定。在包含互補(bǔ)的Cy5示蹤報(bào)告序列的PBS(PBS ；137mMNaCl, IOniMPhosphate, 2.7mM KCl, pH7.4, Hyclone)中將提純的寡核苷酸功能化的 AuNP 懸浮至IOnM的濃度。將混合物加熱至70°C，緩慢冷卻至室溫，并在暗處至少保存12個(gè)小時(shí)以雜交。粒子用0.2 μ m醋酸鹽沖洗過濾器(GE Healthcare)進(jìn)行無菌過濾。使用的寡核苷酸序列如下:
[0138]識(shí)別序列:5’-CTTGAG AAA GGG CTG CCA AAA AA-SH-3’ (SEQ ID N0.1)
[0139]報(bào)告序列:3，-CCCGAC GGT T_Cy5_5，(SEQ IDN0.2)
[0140]標(biāo)靶區(qū)域:3，-GAACTC TTT CCC GAC GGT-5，(SEQ ID N0.3)
[0141]在包含0.1% Tween20(西格馬)的PBS中將納米閃光探測或分子信標(biāo)稀釋到InM的濃度，并用互補(bǔ)的標(biāo)靶(標(biāo)靶濃度，I μ M)處理。熒光光譜記錄在633nm處激發(fā)以及從650nm到750nm以Inm的增量發(fā)射測定的Jobin Yvon Fluorolog FL3-22上。然后使寡核苷酸功能化的Au NP與能夠在被更長的標(biāo)靶或標(biāo)靶區(qū)域取代時(shí)沖當(dāng)“閃光”的短花青(Cy5)染料封端的報(bào)告序列雜交。在結(jié)合狀態(tài)中，報(bào)告束的Cy5熒光因接近Au NP表面而淬滅。在標(biāo)靶存在下，閃光束被取代并通過在標(biāo)靶和寡核苷酸改性的Au NP之間形成更長、更穩(wěn)定的雙鏈體而從Au NP中釋放。
[0142]使用合成的互補(bǔ)標(biāo)靶測試納米閃光設(shè)計(jì)表明，探測基于標(biāo)靶識(shí)別和鍵合對(duì)熒光信號(hào)增加的3.8折作出響應(yīng)。相比之下，信號(hào)在非互補(bǔ)標(biāo)靶存在下不發(fā)生變化，并具有相對(duì)背景熒光的可比較量。這些結(jié)果表明，納米閃光在特定標(biāo)靶存在下發(fā)信號(hào)有效。
[0143]實(shí)施例5
[0144]研究具有確定的發(fā)信號(hào)能力的納米閃光探測以及合成標(biāo)靶能夠進(jìn)入、顯示并檢測活細(xì)胞內(nèi)的RNA標(biāo)靶的能力。將納米閃光用于合并生存素轉(zhuǎn)錄物標(biāo)靶的互補(bǔ)區(qū)域，由于其可用于癌治療和診斷(Altieri et al, 2003, 0ncogene22:8581-8589)上而引起廣泛關(guān)注。表示大量生存素轉(zhuǎn)錄物(Peng et al, 2005, Cancer Res.65:1909-1917)的 SKBR3 細(xì)胞株(人類乳腺癌)被用作檢測生存素-標(biāo)靶納米閃光的模型。生存素識(shí)別和報(bào)告序列如上所示(SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2)。作為對(duì)照，制備包含非互補(bǔ)序列的第二探測。設(shè)計(jì)并確定非互補(bǔ)探測具有與生存素探測相似的背景熒光、熔融性能和發(fā)信號(hào)能力。生存素對(duì)照探測寡核苷酸序列為:
[0145]對(duì)照粒子識(shí)別序列:5，-CTATCG CGT ACA ATC TGC AAA AA-SH-3’ (SEQ ID N0.4)
[0146]對(duì)照粒子報(bào)告序列:3，-GCATGT TAG ACG T_Cy5_5’ (SEQ ID N0.5)
[0147]生存素分子信標(biāo): 5’-Cy5-CGACGG AGA AAG GGC TGC CAC GTC G dabcyl-3’ (SEQID N0.6)
[0148]對(duì)照分子信標(biāo):5，-Cy5-CGACGT CGC GTA CAA TCT GCC GTC G-dabcyl-3’ (SEQ IDN0.7)。
[0149]在玻璃顯微鏡蓋片上培養(yǎng)細(xì)胞，用納米閃光孵化，并用掃描型共焦顯微鏡顯像。具體地，細(xì)胞在6孔組織培養(yǎng)板的底部放置的玻璃蓋片上成長。I天后，該媒體用包含納米閃光的媒體代替(粒子濃度，125pM)。處理6小時(shí)后，重新放置媒體，并額外培養(yǎng)細(xì)胞12小時(shí)。除去蓋片，用PBS洗滌，并固定在裝有安放在載玻片上的PBS的腔室內(nèi)。所有的圖像使用633nm的HeNe激光激發(fā)源通過Zeiss510LSM在63X的放大倍率下得到。
[0150]與用非互補(bǔ)對(duì)照處理的細(xì)胞相比，用生存素納米閃光處理的SKBR3細(xì)胞具有高度熒光性。為了進(jìn)一步確定此信令與生存素存在一致，將C166細(xì)胞株(鼠內(nèi)皮)用作對(duì)照，因?yàn)樗缓祟惿嫠剞D(zhuǎn)錄物。用生存素和對(duì)照探測處理C166細(xì)胞。在這種情況下，在處理后沒有觀察到在細(xì)胞熒光上可辨別的差異。這些成像結(jié)果與逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)測定一致(見下文)。
[0151]為了用數(shù)量表示納米閃光的細(xì)胞內(nèi)信令，使用解析的流式細(xì)胞儀檢查用探測處理的細(xì)胞。此外，流式細(xì)胞儀提供一個(gè)以收集大群體細(xì)胞的熒光數(shù)據(jù)。這排除了使用諸如僅僅允許檢驗(yàn)小細(xì)胞樣本的熒光成像的技術(shù)而能夠觀察到的變異和實(shí)驗(yàn)假象。細(xì)胞用上述的納米閃光(粒子濃度，IOnM)處理。用Lipofectamine2000 (Invitrogen)將分子信標(biāo)探測(SEQ ID N0.6and SEQ ID N0.7)傳達(dá)給細(xì)胞。處理后，用胰蛋白酶使細(xì)胞分離培養(yǎng)瓶。用在635nm處激發(fā)的DakoCytomation CyAn執(zhí)行流式細(xì)胞術(shù)。
[0152]用納米閃光轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株顯示出均勻的單一的熒光細(xì)胞種群，與在轉(zhuǎn)染反義顆粒(Rosi et al.，Science312:1027-1030)時(shí)我們觀察到的大于99%的細(xì)胞侵入一致。流式細(xì)胞術(shù)顯示，用生存素納米閃光處理的SKBR3細(xì)胞具有高度熒光性，并為用非互補(bǔ)對(duì)照處理的種群熒光的2.5倍。為了比較，在C166細(xì)胞模型中，兩種探測均產(chǎn)生相似的低熒光信號(hào)。這些流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)與共焦成像具有極好的一致性，表明了均勻的細(xì)胞內(nèi)在化和納米閃光的細(xì)胞內(nèi)信令。
[0153]然后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以在細(xì)胞內(nèi)檢測實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)理解這些探測獨(dú)特的性能。首先，將納米閃光的細(xì)胞內(nèi)性能與使用購得的轉(zhuǎn)染劑(Peng et al.，2005, CancerRes.65:1909-1917 ；Nitin et al., 2004, Nucleic Acids Res.32:e58)Lipofectamine傳遞的分子信標(biāo)報(bào)告相比較。將分子信標(biāo)和納米閃光導(dǎo)入SKBR3細(xì)胞(轉(zhuǎn)染濃度，IOpM)中并用流式細(xì)胞儀研究它們的信號(hào)能力。用生存素納米閃光處理的細(xì)胞產(chǎn)生為用相同濃度下轉(zhuǎn)染的生存素分子信標(biāo)探測處理的細(xì)胞55倍的熒光信號(hào)。在細(xì)胞培養(yǎng)外面的熒光測定表明，各納米閃光探測包含約10個(gè)熒光團(tuán)，由此在相同的探測濃度下應(yīng)該具有為分子信標(biāo)10倍的信號(hào)。大于預(yù)測的細(xì)胞內(nèi)熒光暗示了納米閃光相比分子信標(biāo)探測，其內(nèi)在化更迅速或者為更大的程度。
[0154]接著，在高濃度(0.5nM)轉(zhuǎn)染分子信標(biāo)以得到用納米閃光可觀察到的細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)。比較用非互補(bǔ)探測形成的背景熒光(分子信標(biāo)和納米閃光)。非互補(bǔ)分子信標(biāo)探測的熒光明顯大于非互補(bǔ)納米閃光的熒光。因?yàn)楸尘昂托盘?hào)之間的差異對(duì)精確的標(biāo)靶檢測很關(guān)鍵，所以較低的納米閃光背景在檢測細(xì)胞內(nèi)標(biāo)靶時(shí)提供了重要的有利條件。
[0155]為了檢測生化酶如何降解產(chǎn)生非特定信號(hào)，用內(nèi)切核酸酶DNAse I (0.38mg/L,濃度明顯大于在細(xì)胞環(huán)境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的濃度)孵化納米閃光，并通過監(jiān)測熒光信號(hào)隨時(shí)間變化的增加來測定降解比。在PBS(pH7.0)、0.25mM MgC12和50mg/L Bovine SerumAlbumin (Fischer Scientific)中將納米閃光探測稀釋到2.5nM的濃度。在讀數(shù)(濃度，0.38mg/L)之前立即加入 Bovine Pancreatic DNase I (United States Biochemical)。用在 620nm 處激發(fā)和在 665nm 處發(fā)射的 Photal Otsuka Electronics FluoDia T70 執(zhí)行所有實(shí)驗(yàn)。在25nM濃度下以相似的方式檢測分子信標(biāo)。在降解曲線的線性區(qū)域范圍(Rizzoet al., 2002Molecular and Cellular Probesl6:277-283)確定在這些實(shí)驗(yàn)條件下降解的大致比率。
[0156]檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，納米閃光在這些條件下以0.275nmol mm〃l的標(biāo)準(zhǔn)化速率降解。相比之下，分子信標(biāo)以1.25nmol mm〃l的標(biāo)準(zhǔn)化速率降解，比納米閃光快約4.5倍。因?yàn)楹怂崦富钚栽诔Ｒ?guī)探測中產(chǎn)生增加的背景熒光，所以納米閃光減少的核酸酶活性產(chǎn)生背景信號(hào)較低的系統(tǒng)。
[0157]實(shí)施例6
[0158]為了說明細(xì)胞進(jìn)入的應(yīng)用，轉(zhuǎn)錄為改變RNA的細(xì)胞內(nèi)量的高靈敏度的毫微-flare的提高的發(fā)信號(hào)和低的背景，siRNA組合實(shí)驗(yàn)降低了 SKBR3細(xì)胞模型中的存活素RNA轉(zhuǎn)錄物的水平。當(dāng)細(xì)胞約50%鋪滿時(shí)，siRNA抗人存活素(Santa Curz)使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑被表達(dá)到細(xì)胞中(siRNA濃度，20、40和80nM)。24小時(shí)后，培養(yǎng)基被替換為含有毫微-flare探針(顆粒濃度50pM)。6小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌，加入新鮮的培養(yǎng)基。進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞12小時(shí)，用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行分析。
[0159] 首先，用siRNA抗存活素處理細(xì)胞，使用毫微-flares和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)細(xì)胞內(nèi)RNA水平進(jìn)行定量。移入細(xì)胞數(shù)量的熒光中的siRNA濃度依賴性以加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中的siRNA濃度的作用被觀察到(圖3a)。siRNA濃度以曲線圖中直方圖的左邊被表達(dá)。在未進(jìn)行處理的樣品中，一半量表現(xiàn)出與平均值色度灰相比相等或更高的熒光。進(jìn)行處理的樣品中，細(xì)胞的較少量表現(xiàn)出平均值熒光(漸少的灰、漸增的黑)。為了證明該轉(zhuǎn)移與存活素轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量的減少相當(dāng)，對(duì)用相同濃度的siRNA處理的樣品實(shí)施RT-PCR測量方法。用Guava Easy Cyte Mini (Guava Technologies)進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照下述制造條約使用 RNeasyPlus Kit(Qiagen)從細(xì)胞中分離總RNA。在細(xì)胞溶解步驟中，5 X IO7提高了的綠色熒光蛋白(EGFP) RNA拷貝在分離和純化的過程中被加入到用于說明RNA缺失的各樣品中。為了得到qRT-PCR的RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于定量的RNA碎片從適當(dāng)?shù)腞NA細(xì)胞產(chǎn)生。使用PCR和含有T7啟動(dòng)子位點(diǎn)的引發(fā)劑，將碎片修飾成可以適合轉(zhuǎn)錄的序列(DNA —RNA)。使用以下的生產(chǎn)商協(xié)議的MEGAclear成套工具(Ambion)提純轉(zhuǎn)錄物。用Ribogreen RNA量化成套工具(Invitrogen)測定RNA濃度,并使用原種RNA的稀釋序組制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。引物為: [0160]EGFP Forward5' -TCT TCT TCA AGG ACG ACG GCA ACT-3' (SEQ IDN0.8)
[0161]EGFP Reverses' -TGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CCT-3’ (SEQ IDN0.9)
[0162]T7EGFP Forward5' -TGC ATA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA TCT TCT TCA AGGACG ACG GGC AAC T_3’ (SEQ ID N0.10)
[0163]生存素Forward5，-ATG GGT GCC CCG ACG TTG-3，(SEQ ID N0.11)
[0164]生存素Reverse5’-AGA GGC CTC AAT CCA TGG-3，(SEQ ID N0.12)
[0165]T7 生存素 Forward5，-TGC ATA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA TGG GTG CCC CGACGT TG-3' (SEQ ID N0.13)
[0166]根據(jù)廠商建議用LightCycler RNA master SYBR 綠色試劑盒(Roche AppliedSciences)進(jìn)行定量PCR和分析。反轉(zhuǎn)錄在61°C進(jìn)行20分鐘，然后進(jìn)行45個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(950C，5sec ；54°C，15sec ；72°C，20sec)，標(biāo)靶基因RNA被歸一化以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有反
應(yīng)進(jìn)行三次。
[0167]細(xì)胞種群內(nèi)熒光信號(hào)中的線性下降與通過RT-PCR檢測法檢測的存在的RNA拷貝數(shù)的下降相一致(圖3b)。綜合起來，這些結(jié)果表明納米-Flare對(duì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的數(shù)量改變是靈敏的。RT-PCR進(jìn)行三次，上部顯示的誤差柱是這些檢測的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0168]開發(fā)了一種稱為“納米-flare”的胞內(nèi)探針新系統(tǒng)。納米-flare是新穎的并且潛在地非常有用，因?yàn)樗鼈兪墙Y(jié)合細(xì)胞轉(zhuǎn)染、梅保護(hù)、RNA檢測和定量、以及mRNA可視化的唯一探針。除了上下文中siRNA敲除實(shí)驗(yàn)中顯示的用途外，納米-flare還預(yù)期可用于其他領(lǐng)域，如細(xì)胞分選、基因譜圖和實(shí)時(shí)藥物測試。最后，給出這些材料還可用作基因調(diào)節(jié)劑對(duì)能力(Rosi et al., 2006, Science312:1027-1030 ；Seferos et al., 2007, ChemBioChem8:1230-1232)，這些探針預(yù)期容易地適于同時(shí)轉(zhuǎn)染、實(shí)時(shí)控制和可視化基因表達(dá)。
[0169]總的來說，這些結(jié)果表明:
[0170]I)金納米顆粒幫助含熒光團(tuán)的作為可檢測的標(biāo)靶的寡核苷酸的胞內(nèi)輸送。
[0171]2)這些熒光標(biāo)記的修飾的寡核苷酸納米顆粒試劑可用于檢測、顯現(xiàn)和定量胞內(nèi)標(biāo)靶。
[0172]3)指示特定mRNA標(biāo)靶的存在和量的熒光信函可被轉(zhuǎn)換為可讀測量值。
[0173]4)這些試劑的有效攝取，它們的高的發(fā)信號(hào)的能力以及低毒性使它們非常適于區(qū)分細(xì)胞種群。
[0174]5)在研究過的條件下，這些試劑的有效攝取和它們的高的發(fā)信號(hào)的能力超過常規(guī)的猝滅-熒光寡核苷酸探針。
[0175]6)所述原理課延伸到其他結(jié)構(gòu)-開關(guān)識(shí)別序列例如核酸aptamers和肽。
[0176]本發(fā) 明預(yù)期所述探針將導(dǎo)致同時(shí)檢測多個(gè)胞內(nèi)標(biāo)靶，和實(shí)時(shí)定量它們的胞內(nèi)濃度的能力。所述原理還預(yù)期應(yīng)用于在較高級(jí)有機(jī)體中實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞功能以及在同時(shí)檢測效果時(shí)并行進(jìn)行治療。
【權(quán)利要求】
1.一種測定標(biāo)靶分子的細(xì)胞內(nèi)濃度的方法，包括將標(biāo)靶分子與納米顆粒在允許所述標(biāo)靶分子與所述納米顆粒連接的條件下接觸的步驟，所述納米顆粒包含特異于所述標(biāo)靶分子的結(jié)合部分，所述結(jié)合部分用標(biāo)記物標(biāo)記，其中所述標(biāo)靶分子和所述納米顆粒的連接導(dǎo)致標(biāo)記物的可檢測的改變，而且其中所述可檢測的標(biāo)記物的改變與所述標(biāo)靶分子的分子內(nèi)的濃度成比例。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述結(jié)合部分選自由多核苷酸和多肽組成的組中。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述結(jié)合部分是DNA。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述結(jié)合部分是RNA。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)靶分子選自由多核苷酸和多肽組成的組中。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述結(jié)合部分為共價(jià)連接到所述納米顆粒的多核苷酸，而且所述標(biāo)記物為連接到與所述結(jié)合部分多核苷酸雜交的多核苷酸的標(biāo)記，其中所述結(jié)合部分多核苷酸與所述標(biāo)靶分子的連接釋放所述雜交的多核苷酸，而且在釋放之后，能夠檢測到所述標(biāo)記物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，當(dāng)帶有所述標(biāo)記的所述多核苷酸與所述結(jié)合部分雜交時(shí)，連接到所述多核苷酸的所述標(biāo)記被淬滅。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述結(jié)合部分為含有標(biāo)記物的多核苷酸，所述標(biāo)記物為可檢測標(biāo)記，其中所述標(biāo)記物僅僅在所述多核苷酸與所述標(biāo)記分子連接時(shí)能檢測到。
9.如權(quán)利要求8 所述的方法，其中，當(dāng)所述結(jié)合部分與所述標(biāo)靶分子不連接時(shí)，所述標(biāo)記物被淬滅。
10.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述結(jié)合部分為多肽，而且所述標(biāo)記物是與所述多肽結(jié)合部分連接的標(biāo)記，而且其中所述結(jié)合部分與所述標(biāo)靶分子的連接釋放所述標(biāo)記，而且所述標(biāo)記物在釋放之后可檢測。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中當(dāng)與所述結(jié)合部分連接時(shí)，所述標(biāo)記被淬滅。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述納米顆粒包含多個(gè)結(jié)合部分。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述結(jié)合部分與一個(gè)標(biāo)靶分子特異性連接。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述結(jié)合部分與多于一個(gè)標(biāo)靶分子特異性連接。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103966345SQ201410230949
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2008年2月11日 優(yōu)先權(quán)日:2007年2月9日
【發(fā)明者】查德·A·米爾金, 德懷特·塞費(fèi)羅斯, 大衛(wèi)·A·吉廖翰 申請人:西北大學(xué)