一種十字花科黑腐病菌的iii型效應(yīng)物基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種十字花科黑腐病菌的III型效應(yīng)物基因及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的十字花科黑腐病菌的III型效應(yīng)物基因具有下述核苷酸序列之一：(1)SEQIDNO:1所示的DNA序列；(2)與序列表中SEQIDNO:1所限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。本發(fā)明提供的十字花科黑腐病菌III型效應(yīng)物基因的應(yīng)用于植物病害的防治。本發(fā)明提供了一種新的十字花科黑腐病菌致病相關(guān)基因，提供了可能的防治植物病害的藥物靶標；其致病試驗表明，XC2210基因的Tn5gusA5插入突變體的致病性顯著降低。
【專利說明】—種十字花科黑腐病菌的111型效應(yīng)物基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物病原細菌的致病相關(guān)基因，尤其涉及的是一種十字花科黑腐病菌的III型效應(yīng)物基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]III型分泌系統(tǒng)(T3SS)是存在于多種動、植物病原菌中可向寄主細胞內(nèi)分泌致病效應(yīng)物的蛋白分泌系統(tǒng)，在病原菌致病過程中起決定性作用。T3SS通常由成簇存在的hrp基因簇編碼，在染色體上形成所謂的“毒島”或“致病性島”。在十字花科黑腐病菌中，位于hrp基因簇旁側(cè)的hrpG和hrpX是最關(guān)鍵的調(diào)控基因，HrpG調(diào)控hrpX，HrpX調(diào)控包括hrp基因簇調(diào)控單元在內(nèi)的大多數(shù)HrpG調(diào)控元基因的表達，大部分HrpX調(diào)控元基因的啟動子區(qū)都存在PIP-box (植物誘導啟動子盒)。根據(jù)“基因?qū)颉崩碚?，寄主關(guān)系的建立取決于病原體與植物的親和識別，而效應(yīng)物蛋白對寄主的識別屬于寄主胞內(nèi)識別，不同類型的效應(yīng)物有不同的寄主胞內(nèi)靶點，效應(yīng)物與寄主胞內(nèi)靶點相互識別及作用的結(jié)果決定了細菌的致病性和寄主專一性。
[0003]植物病害一直是農(nóng)作物減產(chǎn)、品質(zhì)降低的主要因子之一。十字花科黑腐病菌是一種革蘭氏陰性細菌，能在全球范圍內(nèi)引起十字花科植物黑腐病，導致農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)嚴重下降。目前，還沒有很有效的生物農(nóng)藥對該病有有效的防治作用，而隨著病原菌對藥物抗性的增強，農(nóng)藥用量在不斷增加，這不僅加劇了環(huán)境污染、藥物殘留，也大大提高了農(nóng)業(yè)成本，因此，亟待研發(fā)新的防病治病策略和新型的無公害藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)在防治十字花科植物黑腐病中存在的不足，提供了一種十字花科黑腐病菌的III型效應(yīng)物基因及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]一種十字花科黑腐病菌的III型效應(yīng)物基因，具有下述核苷酸序列之一:
[0007](I) SEQIDNO:1 所示的 DNA 序列；
[0008](2)與SEQIDN0:1所限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
[0009]所述的III型效應(yīng)物基因，其自5’端的第501-4667位核苷酸為開放閱讀框。
[0010]所述的十字花科黑腐病菌的III型效應(yīng)物基因在植物病害防治中的應(yīng)用。
[0011]所述的十字花科黑腐病菌的III型效應(yīng)物基因的序列已在國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)公布，基因組序列號NC_007086，該基因編碼蛋白序列號YP_243285。攜帶該基因的質(zhì)粒ΡΕΤ2210已在廣西大學生命科學與技術(shù)學院保存。 [0012]SEQIDN0:1所示的DNA是十字花科黑腐病菌8004菌株的DNA，由4667個堿基組成。含完整的III型分泌效應(yīng)物基因，自5’端的第501-4667位核苷酸為該基因的開放閱讀框(OpenReadingFrame, 0RF),自5’端的第501-503位核苷酸為該基因的起始密碼子ATG，自5’端的第4665-4667位核苷酸為終止密碼子TAG。[0013]序列表中SEQIDN0:2所示的蛋白質(zhì)是十字花科黑腐病菌的III型效應(yīng)物基因XC2210的編碼產(chǎn)物，由1388個氨基酸組成。
[0014]本發(fā)明提供了一種新的十字花科黑腐病菌致病相關(guān)基因，提供了可能的防治植物病害的藥物靶標。其致病試驗表明，XC2210基因的Tn5gusA5插入突變體的致病性顯著降低。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為XC2210基因啟動子區(qū)和分泌轉(zhuǎn)運區(qū)及XC2210基因克隆酶切電泳凝膠圖；圖中，M:100bp標準DNA ;1:XC2210基因啟動子區(qū)和分泌轉(zhuǎn)運區(qū)PCR擴增片段；2:XC2210啟動子區(qū)和分泌轉(zhuǎn)運區(qū)片段克隆PXC2210酶切電泳圖譜。
[0016]圖2為XC2210基因轉(zhuǎn)運鑒定菌株的酶切電泳凝膠圖；圖中，M:A/HindIII標準 DNA(片段大小從大到小依次為 23.lkb, 9.4kb, 6.6kb, 4.36kb, 2.4kb, 2.0kb) ；1~2:Xcc8004*/pJJA2210 和 8004*ΛhrcV/pJJA2210。
[0017]圖3為XC2210基因插入突變體044A05的PCR驗證凝膠圖；圖中，Ml:1OObp標準DNA ；1-4:XC2210基因插入突變體044A05的4個單克?。沪?: λ/HindIII標準DNA (片段大小從大到小依次為 23.lkb, 9.4kb，6.6kb，4.36kb，2.4kb，2.0kb)。
[0018]圖4為XC2210基因Tn5gusA5插入突變體的致病性試驗；圖中，8004為野生型Xcc菌株，044A05為XC2210基因的Tn5gusA5插入突變體。
【具體實施方式】 [0019]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
[0020]在本發(fā)明的實施例中所用到的材料包括:大腸桿菌(Escherichiacoli)株系JM109 ;克隆載體pUC19及柯斯質(zhì)粒pLAFR3、pLAFRJ為本研究室保存；限制性內(nèi)切酶、修飾酶等試劑購自 Promega、Stratagene、QIAGEN 公司。
[0021]實施例1XC2210基因啟動子區(qū)以及分泌轉(zhuǎn)運區(qū)的克隆及序列測定
[0022]根據(jù)XC2210 的基因序列，設(shè)計引物 P2210_F/P2210-R(ggggaattcccagcaacaaggccagcgtg/gggggtaccttggcgacgccgggagatcc),以野油菜黃單胞菌總DNA為模板，用PCR法擴增該基因啟動子區(qū)以及分泌轉(zhuǎn)運區(qū)序列(20yL擴增體系:10XBuffer2yL，ExTaqDNA聚合酶 0.5 μ L,2.5mmol/LdNTPmixture2μ L,10 μ mol/LP2210_Flμ L,10 μ mol/LP2210_Rlμ L,模板 DNA2y L，ddH2011.5μ L ;擴增條件:95 °C 3min ；95 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C lmin,30cycles ；72°C 5min)，并將其克隆至克隆載體pUC19中，獲得了含該基因啟動子區(qū)以及分泌轉(zhuǎn)運區(qū)序列的重組質(zhì)粒PXC2210。該質(zhì)粒用EcoRI和KpnI酶切，除了一個2.7kb的載體條帶外，還有一個1.022kb的插入片段(見圖1)。送華大公司測序，結(jié)果正確。
[0023]實施例2候選效應(yīng)物轉(zhuǎn)運鑒定菌株的構(gòu)建
[0024]將XC2210基因的啟動子區(qū)以及分泌轉(zhuǎn)運區(qū)分別克隆到大腸桿菌和Xcc之間的穿梭質(zhì)粒PJJA (該質(zhì)粒是將cyaA基因中具有腺苷酸環(huán)化酶活性的區(qū)域克隆至pLAFR3衍生質(zhì)粒pLAFRJ上)，酶切并測序驗證后將pJJA重組質(zhì)粒分別引入Xcc8004*和8004* Δ hrcV中，得到候選效應(yīng)物轉(zhuǎn)運鑒定菌株，酶切驗證后(見圖2)，通過檢測菌株在甘藍京豐I號的腺苷酸環(huán)化酶活性判斷所克隆的基因是否為依賴III型分泌系統(tǒng)分泌的效應(yīng)物基因，本發(fā)明涉及一個新的III型分泌效應(yīng)物基因--XC2210基因。
[0025]實施例3腺苷酸環(huán)化酶活性檢測
[0026]實驗所用寄主植物為甘藍京豐I號，所用的接種方法為壓滲法。XC2210基因的效應(yīng)物轉(zhuǎn)運鑒定菌株和對照菌株在28°C下進行液體培養(yǎng)15-18h。用鈍端塑料注射器吸取約10 μ L用10mmol/L磷酸鈉緩沖液(5.8mmol/L的磷酸氫二鈉和4.2mmol/L的磷酸二氫鈉，PH7.0)懸浮生物細菌懸浮液(lX107CFU/mL)接種到甘藍京豐I號葉的背面。將接種的植物置于溫室中，保持12h光照周期和28°C的恒定溫度，24h后收集Icm2的葉片，置液氮中研磨，等液氮揮發(fā)完后，加入323 μ L的1.1moVLHClO4繼續(xù)磨，等葉片徹底磨碎后，15000g離心 IOmin,取上清 280 μ L 加入 37.3 μ L6mol/LK2C03,150 00g 離心 IOmin0 取上清 200 μ L,用真空冷凍抽干機干燥，干燥后置_80°C保存。按照Amersham的cAMPBiotrakEnzymeimmunoassay (EIA) System試劑盒的使用說明書,檢測待測菌株的腺苷酸環(huán)化酶活性。試驗表明，XC2210基因的效應(yīng)物轉(zhuǎn)運鑒定菌株的腺苷酸環(huán)化酶活性明顯高于對照(見表1)，表明XC2210是依賴III型分泌的效應(yīng)物基因。
[0027]表1壓滲24h后檢測甘藍cAMP水平的檢測結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種十字花科黑腐病菌的III型效應(yīng)物基因，其特征在于，具有下述核苷酸序列之
(1)SEQIDNO:1 所示的 DNA 序列； (2)與SEQIDN0:1所限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的III型效應(yīng)物基因，其特征是，自5’端的第501-4667位核苷酸為開放閱讀框。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的十字花科黑腐病菌III型效應(yīng)物基因的應(yīng)用，其特征是，在植物病害防治中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/64GK103993021SQ201410227459
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】姜偉, 姜伯樂, 唐紀良, 何勇強, 唐菲菲, 韋紅玉, 蔣國鳳, 岑衛(wèi)健, 杭小紅 申請人:廣西大學