谷子銹菌巢式pcr高效檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種谷子銹菌巢式PCR高效檢測方法，利用谷子銹菌IGS區(qū)與其它真菌的IGS區(qū)的差異位點(diǎn)，設(shè)計兩對特異性引物Urs1-F/Urs1-R和Urs2-F/Urs2-R，分別作為巢式PCR擴(kuò)增的外側(cè)引物對和內(nèi)側(cè)引物對，以樣品DNA為模板進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。通過目標(biāo)片段判定待測病原菌是否為谷子銹菌，或所測谷子葉片是否被谷子銹菌侵染。本發(fā)明的方法對病原基因組DNA的檢測靈敏度為100pg/μL，特異性強(qiáng)，可用于快速，準(zhǔn)確和靈敏的檢測谷子葉片中的銹菌，對谷子銹病的早期診斷及防治具有重要意義。
【專利說明】谷子銹菌巢式PCR高效檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用巢式PCR (nested PCR)技術(shù)對谷子銹菌進(jìn)行檢測，屬于植物真菌分子生物學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]谷子(feiaria iia7ica)起源于我國，是哺育中華民族的主要糧食作物之一,其種植面積和產(chǎn)量均居世界之首。小米營養(yǎng)豐富，隨著世界雜糧熱的興起，出口量在穩(wěn)步增加，已經(jīng)成為我國的特色創(chuàng)匯雜糧。谷草是牲畜的優(yōu)質(zhì)飼草，在耕地緊缺的情況下是發(fā)展畜牧養(yǎng)殖業(yè)的首選糧草兼用性作物。但是谷子病害的發(fā)生，嚴(yán)重影響著谷子的產(chǎn)量和質(zhì)量。
[0003]谷銹病setariae-1talicae)是世界谷子產(chǎn)區(qū)經(jīng)常發(fā)生的一種氣傳流行性病害，嚴(yán)重影響著谷子的穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)。谷子銹病病原菌Uromyces setariae-1 talicae,屬擔(dān)子菌亞門柄鎊菌科單胞鎊屬UJromyces.'')。谷子銹病在谷子的葉片和葉鞘上都可發(fā)生，但在葉片上發(fā)生更加嚴(yán)重。發(fā)病初期，在葉片表面與葉背面，特別是背面產(chǎn)生隆起的夏孢子堆，夏孢子堆成熟后突破寄主表皮而外露，增強(qiáng)了植株的蒸騰作用，使植株喪失大量水分，減少光合作用面積，一般減產(chǎn)10%-30%，嚴(yán)重時植株倒伏，造成絕產(chǎn)。
[0004]在谷子銹病發(fā)生的初期階段，由于潛伏侵染癥狀并不明顯，用傳統(tǒng)的病害癥狀、病原形態(tài)學(xué)等方法很難進(jìn)行檢測，谷銹病為典型氣傳流行性病害，等癥狀明顯時已很難進(jìn)行防控，因此初期診斷非常 重要。同時谷銹菌存在許多其他寄主，如青狗尾草、莠狗尾草、倒刺狗尾草、谷莠子等。因此急需找到一種谷銹菌檢測方法，以便于對谷銹菌寄主范圍進(jìn)行檢測，更加清楚了解其初侵染源。近年來，基于PCR原理的分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為植物體內(nèi)病原菌的快速、準(zhǔn)確診斷提供了有效的工具。在真核生物的核糖體DNA (rDNA)中，編碼區(qū)保守性較強(qiáng)而非編碼區(qū)具有較大的可變性，是進(jìn)行真菌分類的有效序列。在非編碼區(qū)，相對于核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-1TS)而言,rDNA基因間隔區(qū)IGS( intergenic spacer)變異性更高，是真菌內(nèi)進(jìn)行種間比較的和分類的重要DNA片段。巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。梁宏等根據(jù)小麥光腥黑穗病IGS區(qū)與小麥矮腥黑穗病菌及小麥網(wǎng)腥黑穗病菌的差異設(shè)計特異性引物，對小麥光腥黑穗病菌進(jìn)行了分子檢測；王永強(qiáng)以中國不同地理來源的稻曲病菌菌株為材料，對其IGS序列進(jìn)行了初步的比較分析，為稻曲病菌種下群體的鑒定奠定了基礎(chǔ)。本研究基于真菌rDNA-1GS區(qū)域，設(shè)計了檢測谷子銹菌的巢式PCR特異性引物，為快速、準(zhǔn)確的檢測谷子銹菌提供了技術(shù)支持，能夠更早、更及時的發(fā)現(xiàn)病原菌，對谷子銹病的早期檢測和防治具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種利用巢式PCR技術(shù)檢測谷子中銹菌的方法，通過該方法可快速診斷出谷子植株中是否攜帶銹菌，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，為銹病的早期診斷、科學(xué)預(yù)防和病情的控制提供了技術(shù)保障。
[0006]本發(fā)明的具體步驟是:
1、提取基因組DNA
采用CTAB法提取谷子銹菌、其它供試菌株以及接種銹菌的谷子葉片基因組DNA。以IGS通用引物擴(kuò)增銹菌基因組DNA，其上游引物和下游引物堿基序列如序列表中SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。PCR擴(kuò)增獲得720bp的特異性片段，片段回收純化后與PMD19-T載體連接過夜，利用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，通過菌落PCR法檢測陽性克隆，把陽性克隆送上海生工進(jìn)行測序，測序分析后獲得谷銹菌IGS序列，其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID N0.3 所示。
[0007]2、第一輪PCR擴(kuò)增
以第I步提取的基因組DNA為模板，采用谷子銹菌IGS區(qū)外側(cè)特異性引物對Ursl-F/Ursl-R,經(jīng)PCR擴(kuò)增得到第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
引物序列:SEQ ID N0.4 Ursl-F:5’-GCCTCTAAGTCAGAATCCGTGC-3’ ；
SEQ ID N0.5 Ursl-R:5’-G ACGGGATGCGGTAAGTTCA-3’ ；
PCR反應(yīng)的體系為:25.0yL，其中2XTaq MasterMix 12.5 μ L，上下游引物10 μ M各l.0yL, DNA 模板 l.0yL, dH20 (滅菌蒸懼水)9.5 μ L ；
PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5 min ；94°C 30S，57°C 30s, 72°C I min，35 個循環(huán)；72°C 10
min。
[0008]3、第二輪PCR擴(kuò)增
將第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物用水稀釋20倍后作為第二輪擴(kuò)增模板，以谷子銹菌IGS區(qū)內(nèi)側(cè)特異性引物對Urs2-F/Urs2-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
引物序列:SEQ ID N0.6 Urs2-F:5’-CGTGCATCTTATAAATGTGTCA-3’ ；
SEQ ID N0.7 Urs2-R:5’-AGTGGATCGTAGCAACAAGG-3’ ；
PCR反應(yīng)的體系為:25.0yL，其中2XTaq MasterMix 12.5 μ L，上下游引物10 μ M各1.0 μ L，第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋物1.0 μ L，dH20 (滅菌蒸餾水)9.5 μ L ；
PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5 min ；94°C 30S，53°C 30s, 72°C I min，35 個循環(huán)；72°C 10
min。
[0009]4、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測
取5 μ L PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，經(jīng)EB染色后用BioRad凝膠成像系統(tǒng)成像。若擴(kuò)增出一條203bp的特異性條帶，則確定所測樣本為谷子銹菌或被谷子銹菌侵染的谷子植株。谷銹菌巢式擴(kuò)增的203bp的特異性條帶核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.8所示。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:應(yīng)用分子生物學(xué)手段研究植物體內(nèi)病原菌，建立了快速、簡便的鑒定方法，在谷子感染銹菌24h就能夠檢測到銹菌。利用此方法能夠在病害發(fā)生初期還未顯現(xiàn)出明顯癥狀時就對病害進(jìn)行準(zhǔn)確的監(jiān)控，在病害發(fā)生早期做出相應(yīng)的防治措施，將病害的危害程度降到最低。
[0011]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:
(I)靈敏度高:通過倍比稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行靈敏度檢測，可檢測到最低濃度為IOOpg/ μ L，較常規(guī)PCR提高了 1000倍；
(2)特異性強(qiáng):結(jié)果顯示，谷子上常見的7種病菌均未見擴(kuò)增，只有銹菌產(chǎn)生擴(kuò)增；
(3)實(shí)用性好:本發(fā)明可用于谷子銹病潛伏期或發(fā)病初期病害的檢測，對谷子銹病的早期診斷和及時預(yù)防具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1:谷子銹菌內(nèi)引物Urs2-F/Urs2-R特異性電泳檢測圖，其中M: DL2000 DNAmarker ;1_5:谷子銹菌；6:谷子白發(fā)病菌；7:谷瘟病菌；8:谷子紋枯病菌；9:粟粒黑穗病菌；10:粟胡麻斑病菌；11:粟彎孢霉病菌；12:粟灰斑病菌；13:陰性對照。
[0013]圖2:谷子銹菌內(nèi)引物Urs2-F/Urs2-R靈敏性電泳檢測圖，其中M:DL2000 DNAmarker ；1~7:谷子銹菌基因組 DNA濃度分別為 10 μ g/μ L、I μ g/μ L> IOOng/ μ L、10ng/ μ L、lng/μ L>IOOpg/μ L>IOpg/μ L0
[0014]圖3:谷子銹菌巢式PCR靈敏性電泳檢測圖，其中M:DL2000 DNA marker ；1~7:谷子銹菌基因組 DNA 濃度分別為 10 μ g/ μ L、I μ g/ μ L、IOOng/ μ L、IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/μ L、10pg/μ L。
[0015]圖4:人工接種谷子銹菌的谷子植株葉片電泳檢測圖，其中，Μ: DL2000 DNAmarker ;1~3:接種I天的植株葉片DNA ;4~6:接種2天的植株葉片DNA ;7~9:接種3天的植株葉片DNA ； 10~12:接種4天的植株葉片DNA ; 13~15:接種5天的植株葉片DNA ；16:健康植株葉片DNA ；17:陰性對照。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面通過實(shí)施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但以下描述對本發(fā)明的保護(hù)范圍不構(gòu)成任何意義上的限定，僅僅做示例說明。
[0017]實(shí)施例1:谷子銹菌PCR檢測的引物特異性驗(yàn)證
選擇谷子上常見的其它7種真菌，谷子白發(fā)病菌iSclerospora graminicola、、谷痕病菌iPyricularia se tariae )、谷子紋枯病菌(/PAizoc tonia solani )、粟粒黑穗病菌UJstilago crameri)、粟胡麻斑病菌iBipolaris粟彎抱霉病菌iCurvularia
lunata)和粟灰斑 病菌QCercospora se tariae^)進(jìn)行引物特異性的驗(yàn)證,具體步驟為:
(I)銹菌及其它供試菌株基因組DNA的提取
a)將菌體加入到1.5 mL離心管中，加入500 μ L提取緩沖液(50 mM Tris - HC1，，pH
8.0,150 mM NaCl, 100 mM EDTA)，充分混勻；
b)向混合液中加入5yL蛋白酶K(I mg/mL),再加入提取緩沖液至I mL,65° C水浴 30 min ；
c)將混合液分裝到兩個1.5mL離心管中，加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1, vol/vol/vol, pH=8.0),離心；
d)取上清，移到一個干凈的1.5mL離心管中，加入等體積的氯仿，離心；
e)取上清，移到一個干凈的1.5mL離心管中，加入等體積的冰凍異丙醇，20° C冷凍I小時；
f)12, 000 rpm ,4。C 離心 20 min,使 DNA 沉淀；g)棄上清，用70%的冰凍乙醇漂洗兩次，自然風(fēng)干后加入0.1 mL TE緩沖液(10 mMTris -HC1,1 mM EDTA,，pH 8.0)使其溶解；
h)加入Iμ L 10 mg/ mL RNA酶(終濃度為20 μ g/ mL)，4° C過夜，徹底酶解RNA ；
i))將DNA再次沉淀，用70%冰凍乙醇漂洗，自然風(fēng)干，溶解在50μ L TE中。
[0018](2)以內(nèi)引物對 Urs2-F (5，-CGTGCATCTTATAAATGTGTCA-3’)和 Urs2_R(5’ -AGTGGATCGTAGCAACAAGG-3’ )對來自山東濟(jì)南、河南新鄉(xiāng)、遼寧朝陽、河北石家莊和承德的銹菌DNA及其它7種真菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
PCR反應(yīng)的體系為:25.0yL，其中2XTaq MasterMix 12.5 μ L，上下游引物10 μ M各1.0 μ L，DNA模板1.0 μ L，dH20 (滅菌蒸餾水)9.5 μ L ；PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s, 53°C退火30s, 72°C延伸lmin共進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸IOmin0
[0019](3)瓊脂糖凝膠電泳及成像觀察
分別取5 μ L不同病原菌基因組DNA擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，經(jīng)EB染色后用BioRad凝膠成像系統(tǒng)成像。結(jié)果顯示，只有銹菌DNA有擴(kuò)增產(chǎn)物，其它7種真菌及陰性對照沒有相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果說明引物的特異性很好，可以用于銹菌的特異性分析。
[0020]通過PCR擴(kuò)增對引物特異性進(jìn)行檢測表明，在5個不同地理來源的銹菌樣本中均擴(kuò)增得到一條203bp的條帶，與預(yù)期一致，而在其它7種真菌樣本及陰性對照中均未擴(kuò)增出任何條帶(圖1)，表 明該引物對谷子銹菌具有較強(qiáng)的特異性，可用于谷子銹菌的鑒定和檢測。
[0021 ] 實(shí)施例2:谷子銹菌常規(guī)PCR靈敏性檢測 (I) DNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備
將谷子銹菌基因組DNA濃度調(diào)整為10 μ g/ μ L，并按10倍梯度依次稀釋為10 μ g/ μ L、I μ g/ μ L、IOOng/ μ L、IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L7 個濃度梯度。
[0022](2)分別取I μ L稀釋標(biāo)準(zhǔn)品作為靈敏度檢測的模板，以Urs2-F/Urs2_R為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；
PCR反應(yīng)的體系為:25.0yL，其中2XTaq MasterMix 12.5 μ L，上下游引物10 μ M各1.0 μ L，DNA模板1.0 μ L，dH20 (滅菌蒸餾水)9.5 μ L ；PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s, 53°C退火30s, 72°C延伸lmin共進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸IOmin0
[0023]( 3 )瓊脂糖凝膠電泳及成像觀察
分別取5 μ L不同病原菌基因組DNA擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，經(jīng)EB染色后用BioRad凝膠成像系統(tǒng)成像。結(jié)果顯示，單獨(dú)使用Urs2-F/Urs2-R為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，泳道1-3均擴(kuò)增出203bp的條帶(圖2)，表明能檢測到的銹菌基因組DNA最低濃度為IOOng/μ L。
[0024]實(shí)施例3:谷子銹菌巢式PCR靈敏性檢測 (I) DNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備
與實(shí)施例2相同，將谷子銹菌基因組DNA濃度調(diào)整為10 μ g/ μ L，并按10倍梯度依次稀釋為 10 μ g/ μ L、I μ g/ μ L、IOOng/ μ L、IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L7 個濃度梯度。
[0025](2 )第一輪 PCR 擴(kuò)增分別取IuL稀釋標(biāo)準(zhǔn)品作為靈敏度檢測的模板，以Ursl-F(5，-GCCTCTAAGTCAGAATCCGTGC-3’)和 Urs2_R (5，-GACGGGATGCGGTAAGTTCA-3’)為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；
PCR反應(yīng)的體系為:25.0yL，其中2XTaq MasterMix 12.5 μ L，上下游引物10 μ M各1.0 μ L，DNA 模板 1.0 μ L，dH20 (滅菌蒸餾水)9.5 μ L ；PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5 min ；94°C30S,57°C 30s, 72°C I min，35 個循環(huán)；72°C 10 min。
[0026](3 )第二輪 PCR 擴(kuò)增
第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物用水稀釋20倍后作為第二輪擴(kuò)增模板，以Urs2-F/Urs2-R為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；
PCR反應(yīng)的體系為:25.0yL，其中2XTaq MasterMix 12.5 μ L，上下游引物10 μ M各
1.0 μ L，第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋物1.0 μ L，dH20 (滅菌蒸餾水)9.5 μ L ;PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5 min ；94°C 30S,53°C 30s, 72°C I min，35 個循環(huán)；72°C 10 min。
[0027](4)瓊脂糖凝膠電泳及成像觀察
分別取5 μ L不同病原菌基因組DNA擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，經(jīng)EB染色后用BioRad凝膠成像系統(tǒng)成像。結(jié)果顯示，經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)，泳道1_6均擴(kuò)增出203bp的條帶(圖3)，表明能檢測到的銹菌基因組DNA最低濃度為lOOpg/yL。 [0028]與實(shí)施例2的結(jié)果相比，本發(fā)明的巢式PCR靈敏性是單獨(dú)使用特異性引物Urs2_F/Urs2-R進(jìn)行一次PCR的1000倍。
[0029]實(shí)施例4:人工接種谷子銹菌的谷子植株葉片檢測 (I)葉片樣品的米集
無菌栽培15盆谷子感病品種豫谷I號，每盆5株苗，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至谷子幼苗長到6^7葉期時用于實(shí)驗(yàn)。將谷子銹菌新鮮的夏孢子配成5X IO6個孢子/mL的孢子懸浮液，均勻的噴灑在谷子葉片上，黑暗條件下保濕48h后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在谷子接種銹菌Id, 2d，3d，4d，5d后分別采集谷子葉片樣本，每盆采集I片葉子，共15片，作為I個重復(fù)，總共設(shè)置3個重復(fù)。采集到的葉片迅速放到液氮中，然后保存到_80°C。以相同方法提取的健康植株葉片樣本為陰性對照，ddH20為空白對照。
[0030](2)將各時間點(diǎn)采集的葉片樣本提取總DNA
a)取谷子葉片1-1.5g，加液氮研磨成粉末；
b)將粉末轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，加入650 μ L CTAB提取緩沖液，65°C水浴40min ；
c)冷卻至室溫后，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液(V:v=24:l)，顛倒混勻，4°C，12000rpm 離心 15 min ；
d)取上清于新的1.5mL離心管中,加入等體積的氯仿/異戍醇混合液(V:v=24:l),顛倒混勻，4°C，12000rpm 離心 15 min ；
e)取上清于新的1.5mL離心管中，加入等體積的冰凍異丙醇，顛倒混勻，置于_20°C冷凍 30min ；
f)4°C, 12000rpm 離心 15 min ；
g)棄上清，使用質(zhì)量濃度75%的乙醇漂洗沉淀1-2次；
h)待沉淀自然風(fēng)干后，溶解于200μ L TE中，利用NanoDrop 1000測定接種后各時間點(diǎn)葉片總DNA濃度，4°C保存?zhèn)溆?。[0031](3)按照實(shí)施例3的步驟2和步驟3，依次進(jìn)行第一輪和第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
[0032](4)瓊脂糖凝膠電泳及成像觀察
分別取5 μ L不同病原菌基因組DNA擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，經(jīng)EB染色后用BioRad凝膠成像系統(tǒng)成像。結(jié)果顯示,泳道1_15即接種谷銹菌Uromycessetariae-1 talicae Id, 2d, 3d, 4d, 5d的谷子植株葉片基因組DNA均擴(kuò)增出203bp的特異性條帶，而健康植株葉片及陰性ddH20對照均未擴(kuò)增出任何條帶(圖4)。表明本發(fā)明所設(shè)計的引物可用于檢測谷子葉片 中的銹菌。
【權(quán)利要求】
1.一種谷子銹菌巢式PCR高效檢測方法，其特征在于:利用谷子銹菌兩對特異性引物Ursl-F/Ursl-R和Urs2_F/Urs2-R，分別作為巢式PCR擴(kuò)增的外側(cè)引物對和內(nèi)側(cè)引物對，以提取的谷子葉片總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，若檢測到203bp的目標(biāo)片段，則說明所測谷子已經(jīng)被銹菌侵染；該方法可以排除谷子上其它常見病原菌的干擾，準(zhǔn)確檢測出谷子植株是否感染了銹病。
2.上述“谷子銹菌兩對特異性引物”是指以下4條引物:
Ursl-F:5’-GCCTCTAAGTCAGAATCCGTGC-3’ ；
Ursl-R:5’-GACGGGATGCGGTAAGTTCA-3’ ；
Urs2-F:5’-CGTGCATCTTATAAATGTGTCA-3’ ；
Urs2-R:5，-AGTGGATCGTAGCAACAAGG-3，。
【文檔編號】C12R1/645GK103981265SQ201410204620
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月15日
【發(fā)明者】李志勇, 董志平, 白輝, 馬繼芳, 王楠, 董立, 全建章, 劉磊 申請人:董志平