一種甘蔗愈傷組織顯色控制基因ScSN及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種甘蔗愈傷組織顯色控制基因ScSN及其應(yīng)用，根據(jù)玉米花青素轉(zhuǎn)錄因子基因SN（GenBank:X60706.1）的上游、下游序列設(shè)計(jì)引物，利用同源克隆技術(shù)，從甘蔗上得到花青素轉(zhuǎn)錄因子基因ScSN的全長(zhǎng)序列。甘蔗ScSN基因開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為1722bp，編碼573個(gè)氨基酸。將甘蔗ScSN基因的編碼區(qū)序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，與眾多玉米花青素相關(guān)基因的BLAST同源搜索中，E值等于零，說(shuō)明了所克隆的基因確實(shí)為甘蔗花青素合成相關(guān)基因。在ScSN序列兩端分別添加KpnⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn)，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-35SN-ScSN，再通過(guò)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷組織，轉(zhuǎn)化的愈傷組織顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色，進(jìn)一步證實(shí)所克隆的基因具有使甘蔗愈傷組織顯色的功能。
【專利說(shuō)明】—種甘蔗愈傷組織顯色控制基因ScSN及其應(yīng)用
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種甘蔗愈傷組織顯色控制基因ScSN及其應(yīng)用。
[0002]【背景技術(shù)】
花青素，也被稱為花色素、花色苷，是一類自然界普遍存在的植物源水溶性色素。花青素也是植物呈色的主要因素，植物液泡中的不同PH值是影響植物花色呈現(xiàn)出不同的顏色關(guān)鍵。自然界的花青素不僅能使植物呈現(xiàn)豐富多彩的顏色，利于植物授粉，而且還可以保護(hù)植物果實(shí)免受紫外線的傷害。前人的研究表明，花青素具備很強(qiáng)的抗氧化能力，其抗氧化能力比維生素C高出20倍， 比維生素E高出50倍。它是自由基的有效清除劑，在心血管疾病的預(yù)防、免疫活性的調(diào)節(jié)等方面，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和保健功能。
[0003]目前，已從矮牽牛、金魚草、紫蘇、龍膽等諸多觀賞植物中克隆了為數(shù)不少的花青素相關(guān)基因。這為更好地開(kāi)發(fā)和利用花青素創(chuàng)造了條件，可以使其更直接、更準(zhǔn)確、更有效地應(yīng)用到人類生命健康、醫(yī)學(xué)保健和有關(guān)研究上。
[0004]已經(jīng)有大量研究證明外源花青素調(diào)芐基因?qū)ㄇ嗨睾铣傻恼{(diào)控是有效的。同時(shí)也有研究表明，合理適當(dāng)?shù)剡\(yùn)用花青素調(diào)控基因，可以建立一套新型的植物轉(zhuǎn)基因研究可視化示蹤系統(tǒng)。當(dāng)前應(yīng)用比較廣泛的標(biāo)記基因如和等都存在著一定程度的不足和缺陷，如除了有報(bào)告功能外，沒(méi)有其它實(shí)際應(yīng)用價(jià)值；表達(dá)的蛋白需要消耗植物同化物，但對(duì)植物生長(zhǎng)無(wú)益等，而花青素轉(zhuǎn)錄因子基因除了可以發(fā)揮標(biāo)記基因的功能外，對(duì)植物的生長(zhǎng)也具有重要作用，因此，對(duì)花青素表達(dá)有關(guān)基因的研究顯得尤為重要。
[0005]而在甘蔗方面，早在1975年，Harborne J.B就指出甘蔗莖色主要受到葉綠素和花青素含量的共同控制。1988年，廣西農(nóng)學(xué)院的李楊瑞等對(duì)不同基因型的甘蔗葉片的花青素含量進(jìn)行了探究；2009年四川大學(xué)的涂斌等利用不同的分離方法，在甘蔗葉片上分離得到原花青素；2011年福建農(nóng)林大闕友雄等利用電子克隆獲得一個(gè)新的甘蔗基因，初步確認(rèn)為轉(zhuǎn)錄因子基因。植物花青素合成調(diào)芐基因是一個(gè)家族，研究表明對(duì)花青素代謝起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子主要有三類'bHLH、#7沒(méi)類以及WMQ蛋白，其中#7沒(méi)類是最主要轉(zhuǎn)錄因子。在花青素表達(dá)代謝調(diào)控過(guò)程中，通常是轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合共同調(diào)控，但也有部分轉(zhuǎn)錄因子可以單獨(dú)調(diào)控花青素的合成。近年來(lái)在甘蔗花青素基因方面的研究才剛剛起步，發(fā)現(xiàn)的基因還只是冰山一角。因此，在甘蔗中克隆出與花青素合成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因，添加組成型啟動(dòng)子，形成轉(zhuǎn)錄因子基因持續(xù)表達(dá)的基因表達(dá)框，然后轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷組織，研究其顯色效果，有望培育富含花青素的甘蔗新品種，并建立一套新型甘蔗轉(zhuǎn)基因可視化報(bào)告體系，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供核心技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克隆甘蔗愈傷組織顯色控制基因并驗(yàn)證其功能。根據(jù)玉米花青素轉(zhuǎn)錄因子SN基因序列設(shè)計(jì)引物，利用同源克隆技術(shù)，從甘蔗上得到花青素轉(zhuǎn)錄因子基因
的全長(zhǎng)序列?？寺〉母收峄蜷_(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為1722 bp，編碼573個(gè)氨基酸。將甘蔗基因的編碼區(qū)序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，證明所克隆的基因?yàn)榛ㄇ嗨剞D(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)基因，通過(guò)查新證明5hW是新基因，再通過(guò)轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷組織，轉(zhuǎn)化的愈傷組織顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色，進(jìn)一步證實(shí)了所克隆的基因具有使甘蔗愈傷組織顯色的功能。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種甘蔗愈傷組織顯色控制基因ScSN，所述的控制基因ScSN序列如SEQ ID N0.1所
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[0008]所述的基因開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為1722 bp，編碼573個(gè)氨基酸，轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷組織后可使轉(zhuǎn)化組織呈現(xiàn)暗紅色。
[0009]一種甘蔗愈傷組織顯色控制基因ScSN在控制甘蔗愈傷組織顯色上的應(yīng)用。
[0010]在NCBI上查詢到玉米花青素轉(zhuǎn)錄因子基因SN (GenBank:X60706.1)的序列，根據(jù)序列在起始密碼子和終止密碼子位置設(shè)計(jì)一對(duì)引物，提取甘蔗葉片總RNA，合成cDNA第一鏈，PCR擴(kuò)增目的基因片段，回收基因目的片段并加尾，與pMD18-T vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重組子驗(yàn)證，目的基因PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定。設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)引物，PCR獲得帶酶切位點(diǎn)基因，酶切載體和基因，回收并連接，獲得重組質(zhì)粒?；驑屴Z擊轉(zhuǎn)化，將愈傷組 織置于顯微鏡下觀察、拍照。
[0011]將甘蔗基因的編碼區(qū)序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與玉米的5^(登錄號(hào)360706.1)基因、7?7 0 (登錄號(hào):ΝΜ_001112603.I)基因、Zc (登錄號(hào):ΝΜ_001111869.1)基因的相似度均達(dá)到90%，與高粱W-7 (登錄號(hào):ΑΥ542311.1)基因序列一致性達(dá)89%，與狗尾草R-S類似蛋白基因(登錄號(hào):ΝΜ_004970820.1) —致性達(dá)83%。特別是與眾多玉米花青素相關(guān)基因的BLAST同源搜索中，E值等于零，說(shuō)明了所克隆的基因確實(shí)為甘蔗花青素合成相關(guān)基因。在序列兩端分別添加治μ I, Sal I酶切位點(diǎn)，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-35SN-ScSN，再通過(guò)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷組織，轉(zhuǎn)化的愈傷組織顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色，進(jìn)一步證實(shí)所克隆的基因具有使甘蔗愈傷組織顯色的功能。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
(O顯色效果好:本發(fā)明獲得的甘蔗花青素調(diào)芐基因轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷組織，可以使愈傷組織呈暗紅色，與非轉(zhuǎn)化愈傷組織的淺黃色形成鮮明對(duì)比，有利于區(qū)分轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化愈傷組織；
(2)生態(tài)安全性高:由于該基因顯色效果好，在甘蔗轉(zhuǎn)基因中可以替代現(xiàn)在常用的抗生素篩選標(biāo)記基因，而抗生素篩選標(biāo)記對(duì)于生態(tài)安全有潛在風(fēng)險(xiǎn)。由于基因來(lái)源于甘蔗而非致病微生物，用花青素調(diào)芐基因替代抗生素篩選標(biāo)記基因可以降低、甚至消除轉(zhuǎn)基因生物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。
[0013](3)食品安全性高:長(zhǎng)期食用轉(zhuǎn)基因食品，其中含有的抗生素篩選標(biāo)記有可能使微生物產(chǎn)生抗生素抗性，而用花青素調(diào)芐基因替代抗生素篩選標(biāo)記基因則不存在這方面問(wèn)題。
[0014](4)效益高:花青素調(diào)芐基因可以使花青素大量表達(dá)，富含花青素的農(nóng)產(chǎn)品或食品經(jīng)濟(jì)價(jià)值大大高于同類其它產(chǎn)品。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1甘蔗基因PCR產(chǎn)物，泳道1、2:R0C22擴(kuò)增條帶；泳道3、4:FN39擴(kuò)增條帶；泳道 5、6:空白對(duì)照；M1:IOObp marker ；M2: 15000+2000 bp marker?[0016]圖2重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證.，泳道1:質(zhì)粒pCAMBIA1301-35SN-ScSN ;泳道2:pCAMBIA1301-35SN-ScSN 用 I 和命/? I 酶切消化；泳道 3:pCAMBIA1301-35SN_ScSN 用Sal I酶切消化；泳道4:PCAMBIA1301-35SN-ScSN用命/? I酶切消化；泳道5:空白對(duì)照。M:15000+2000 bp marker?
[0017]圖3 A為轉(zhuǎn)ScSN基因的愈傷組織(轟擊后20天);B為轉(zhuǎn)ScSN基因愈傷組織顯微觀察結(jié)果。
[0018]【具體實(shí)施方式】
為了充分公開(kāi)本發(fā)明一種甘蔗愈傷組織顯色控制基因ScSN及其應(yīng)用，以下結(jié)合實(shí)施例加以說(shuō)明。
[0019]實(shí)施例1:
一種甘蔗愈傷組織顯色控制基因及其應(yīng)用，具體包括甘蔗花青素調(diào)芐基因的克隆和遺傳轉(zhuǎn)化，具體如下:
(I)PCR引物設(shè)計(jì):在NCBI上查詢到玉米.WCGenBank: X60706.1)的序列，根據(jù)序列在起始密碼子和終止密碼子位置設(shè)計(jì)引物，序列為:
SNFl: 5’ -ATGGCGCTTTCAGCTTCCCGAGTTC-3’ ；
SNRl:5’ -TCACCGCTTCCCTATAGCTTTGCGA -3’。
[0020](2)甘蔗葉片 總RNA的提取
①取新鮮的甘蔗葉片，用75 %的酒精將葉片表面擦拭干凈，在液氮作用下迅速研磨成粉。將研磨好的材料轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入I mL TRIZOL試劑的1.5 mL Eppendorf離心管中，用力振蕩、混勻，室溫放置5 min,于4 °C, 12 000 rpm離心5 min。
[0021]②小心吸取800 μ I上清液,移入新的1.5 mL Eppendorf離心管中，并加入200μ I氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩，待充分乳化，溶液呈乳白狀后，室溫靜置5 min, 12 000rpm,4。。，離心 15 min。
[0022]③小心取出離心管，吸取500 μ I上清液轉(zhuǎn)移至另一新的1.5 mL離心管中，忌吸出白色中間層。向上清中加入500 μ I的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15~30°C下靜置 10 min。12 000 rpm,4 °C,離心 10 min。
[0023]④小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75 %的乙醇I mL，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12 000 rpm,4 °C,離心10 min。小心棄去乙醇。
[0024]⑤重復(fù)步驟④。
[0025]⑥室溫干燥沉淀2-5分鐘，加入適量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80 °C保存。
[0026](3) cDNA第一鏈的合成
以甘蔗葉片總RNA為模板，使用天根公司TIANscript RT Kit試劑盒合成cDNA第一鏈。
[0027](4) PCR擴(kuò)增ScSN目的基因片段 如下，配制50 μ I的PCR反應(yīng)體系:
【權(quán)利要求】
1.一種甘蔗愈傷組織顯色控制基因ScSN，其特征在于:所述的控制基因ScSN序列如SEQ ID N0.1 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘蔗愈傷組織顯色控制基因ScSN，其特征在于:所述的基因開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為1722 bp，編碼573個(gè)氨基酸，轉(zhuǎn)化甘蔗愈傷組織后可使轉(zhuǎn)化組織呈現(xiàn)暗紅色。
3.一種如權(quán)利要求1所述的一種甘蔗愈傷組織顯色控制基因ScSN在控制甘蔗愈傷組織顯色上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK103966233SQ201410197758
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】陳平華, 施桂姣, 王恒波, 張卓, 陳忠偉, 高三基, 項(xiàng)慰, 劉迪, 邰連賽, 林冰, 陳利平, 許莉萍, 陳如凱 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)