一種與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關的分子標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于豬分子標記制備與應用【技術領域】，具體涉及一種豬HOXA10基因內(nèi)含子基因片段作為豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的分子標記。本發(fā)明通過制備得到一種與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關的分子標記，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO:1所示，在序列表SEQ?ID?NO:1的第309bp處有一個T/C堿基突變，該突變導致PCR-EciⅠ-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明還公開了該分子標記的制備方法及其在豬產(chǎn)仔數(shù)性狀關聯(lián)分析中的應用。本發(fā)明為豬產(chǎn)仔數(shù)性狀標記檢測提供了新的標記資源。
【專利說明】一種與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關的分子標記及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及豬分子標記制備【技術領域】，具體涉及一種豬H0XA10基因編碼區(qū)SNP作為豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關的分子記及應用，它包括豬H0XA10基因編碼區(qū)序列突變位點的檢測方法與應用。
【背景技術】
[0002] 國民經(jīng)濟的基礎在于農(nóng)業(yè)，作為農(nóng)業(yè)基礎性產(chǎn)業(yè)之一的畜牧業(yè)，其發(fā)展水平是判斷國家和地區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)達程度的關鍵指標(李順，2010)。養(yǎng)豬業(yè)是畜牧業(yè)的重要組成部分，豬肉需求量在中國肉類制品中位居首位。以往遺傳改良的重點為生產(chǎn)性狀(指胴體形狀和生長性狀)，隨著人們對繁殖性狀的日益重視，產(chǎn)仔數(shù)作為最重要的繁殖性狀正受到越來越多的關注和研究。決定產(chǎn)仔數(shù)的關鍵因素是胚胎成活率，而影響胚胎成活率最關鍵時期為胚胎附植(著床)時期(Bazer et al.，2009)。同源異形框基因H0XA10是受雌激素(E2)、孕激素(P4)調控并在著床窗口期高表達的轉錄因子(Achache and Revel, 2006),通過對HOXAl 1、EMX2、IGFBPI等靶基因的調控影響胚胎附植過程。對于建立子宮內(nèi)膜容受性，胚胎定位與黏附的完成等都有著很關鍵的作用(Modi and Godbole, 2009)。
[0003]H0XA10是同源框(Homeobox)基因a基因簇中位于胚胎體軸5’端腹部B類基因，在染色體上的位置為7pl5~pl4.2。H0XA10總長為2691bp的mRNA能夠編碼785個氨基酸。Satokata小鼠實驗表明，H0XA10對建立子宮內(nèi)膜容受性非常重要。通過總結大量臨床案例，Gui等發(fā)現(xiàn)，人H0XA10基因表達出現(xiàn)問題會導致子宮內(nèi)膜異位癥進而引起容受性建立失敗(Daftary et al., 2007 ；Gui et al., 1999 ；Kim et al., 2007 ；Rackow andTaylor, 2010 ；Taylor et al.，1999)。因此H0XA10基因正常表達對于胚胎附植定位階段的完成有很重要的作用(Wu et al., 2005) 0胚泡釋放妊娠信號標志著黏附階段的開始。H0XA10基因在妊娠小鼠子宮內(nèi)膜基質中表達與胚泡釋放妊娠信號同步發(fā)生，均開始于妊娠后第2.5天(Satokata et al.，1995)。兩者均能夠影響基質細胞的增殖和分化從而影響?zhàn)じ诫A段的進行(Lim et al., 1999) 0證據(jù)顯示，抑制H0XA10基因的表達會阻礙小鼠胚泡的黏附(Bagot et al.，2000)。H0XA10基因的正常表達是保證黏附階段順利完成的重要影響因子之一。在胚胎附植侵入(蛻膜化)階段，H0XA10基因在小鼠子宮內(nèi)膜植入點附近蛻膜間質細胞中高表達，并將這種高表達蔓延至整個蛻膜。這將有助于維持間質細胞對母體分泌的孕激素(P4)的應答反應,防止附植點出血導致的蛻膜化失敗(Benson et al.，1996 ；Lim et al., 1999) 0鑒于H0XA10基因在物種間的高度保守性，因此推測H0XA10基因的表達可能與豬的產(chǎn)仔數(shù)性狀相關。
[0004]大部分繁殖性狀的遺傳結構是非常復雜的，通過對候選基因多態(tài)性的鑒定發(fā)現(xiàn)，不同的基因型與生理、免疫、內(nèi)分泌方面不同的性狀相互關聯(lián)(:Sp?ta.et al., 2009) 0目前，標記輔助選擇(MAS)已作為常規(guī)選擇法的輔助手段而被廣泛應用，大大提高了產(chǎn)仔數(shù)性狀的改良速度。標記輔助選擇(MAS)包括隨機引物擴增多態(tài)性(RAPD)標記、微衛(wèi)星標記、PCR-RFLP標記、分子標記與QTL位點的連鎖分析方法等(趙西彪，2008)。其中PCR-RFLP因檢測不受發(fā)育階段、性別等外部條件的影響，所標記的變異數(shù)目不受限制，實用可靠而得到廣泛的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于獲得一種與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關的分子標記，克隆H0XA10基因編碼區(qū)序列，尋找突變位點以及基因多態(tài)性的檢測方法，為豬產(chǎn)仔數(shù)性狀檢測提供一種分子標記和方法。
[0006]本發(fā)明的技術方案如下:
[0007]本發(fā)明獲得了一種與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關的分子標記，它包含豬(國外血緣豬大白豬和中國地方豬血緣豬陸川豬、隆林豬等)H0XA10基因404bp的序列(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1或圖4所示)；通過上述序列進行Cluster W比對提供了位于該擴增片段中的309bp處的T/C堿基變異(等位基因突變)，導致PCR-Eci 1-RFLP多態(tài)性，其多態(tài)性檢測結果如圖1所示。
[0008]一種擴增豬(大白豬、陸川豬、隆林豬)H0XA10基因目的片段的引物，其DNA序列如序列表SEQ IDN0:2和SEQ ID N0:3所示。
[0009] 申請人:提供了一種篩選與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關的分子標記的方法，按照以下步驟:
[0010]選擇三個豬品種(國外血緣豬代表品種大白豬、中國地方血緣豬代表品種陸川豬和隆林豬)為實驗材料，從豬耳緣組織中提取DNA ;根據(jù)豬H0XA10基因組序列設計引物(序列見SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示)并分段擴增；對PCR產(chǎn)物進行序列測定，進而進行序列比對，篩查SNP，然后再利用SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示的序列進行片段擴增，將PCR擴增片段進行Eci I酶切分型及檢測。
[0011]本發(fā)明提供了鑒定上述序列309bp處T/C變異的Eci 1-RFLP (限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性)基因型分型方法。
[0012]進一步本發(fā)明提供了利用Eci 1-RFLP方法確定的不同基因型個體與產(chǎn)仔數(shù)性狀間的關聯(lián)分析。
[0013]更詳細的發(fā)明方案見《【具體實施方式】》所述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]序列表SEQ ID N0:1是本發(fā)明擴增的國外血緣豬種大白豬和中國地方豬種陸川豬、隆林豬的核苷酸序列，序列長度為404bp。
[0015]序列表SEQ ID NO:2是本發(fā)明制備SEQ ID NO:1特異基因片段所用的正向引物，也是實施豬T/C變異Eci 1-RFLP(限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性)基因型分型方法的正向引物；
[0016]序列表SEQ ID NO: 3是制備SEQ ID NO:1特異基因片段所用的反向引物，也是實施豬T/C變異Eci 1-RFLP(限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性)基因型分型方法的反向引物。
[0017]圖1:為本發(fā)明三個豬種H0XA10基因序列測序結果和SNP位點；
[0018]圖2:為本發(fā)明豬H0XA10基因擴增所得目的片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。瓊脂糖凝膠濃度為2%，圖中標記M泳道為DNA Marker DL2000，泳道I為序列表SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示引物在不同豬種中的擴增片段，片段大小為404bp;
[0019]圖3:為豬H0XA10基因Eci 1-RFLP檢測結果。瓊脂糖凝膠濃度為3%，圖中標記M泳道為DNA MarkerDL2000, CC基因型片段大小分別為294bp、94bp和16bp，TT基因型片段大小分別為388bp、16bp，而雜合基因型TC片段大小分別388bp、294bp、94bp和16bp。
[0020]圖4:為本發(fā)明擴增的豬的核苷酸序列，在該序列的309bp處存在一個等位基因突變(該序列中第309bp處的R是T或C)。
【具體實施方式】
[0021]實施例1:基因片段的獲得及多態(tài)性檢測方法的建立
[0022]豬H0XA10基因序列擴增
[0023](I)采集耳組織樣
[0024]選擇一個國外血緣豬種(大白豬)和兩個地方血緣豬種(陸川豬、隆林豬，來自翔豬基因公司西江泰和豬場)為試驗材料，采取豬的耳緣組織；
[0025](2)基因組DNA提取
[0026]從豬的耳緣組織中提取豬的基因組DNA，DNA樣品全部采用北京天根生化技術有限公司生產(chǎn)的基因組DNA試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)(按該試劑盒說明書進行操作)提取。
[0027]⑶引物設計
[0028]根據(jù)豬H0XA10基因(GenBank基因登錄號為JN_836600)突變位點附近序列，設計一對特異引物。其中
[0029]正向引物為H0XA10-F1 (5，-GCTCTGGGAGGCAAGCGCAATG-3’)，
[0030]反向引物為H0XA10-R (5，-AGGCGGAAGTAGCCGGGCACA-3’)；
[0031](4)聚合酶鏈式反應
[0032]用此引物利用PCR法，以抽提的大白豬、陸川豬和隆林豬基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系:2XGCBuffer II 7.5ul，dnTP (2.5mM) 2.5ul，上述制備的正向引物(IOuM)0.5ul，上述制備的反向引物(IOuM)0.5ul，DNA模板(50ng/ul) Iul，IaTaqDNA聚合酶
0.15ul, ddH202.85ul ;PCR 擴增程序:94°C預變性 lmin，94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸30s (步驟2-4循環(huán)30次)，72°C延伸10min，4°C保存。對長度為404bp的PCR產(chǎn)物進行序列測定，得到如SEQ ID N0:1所述的核苷酸序列。將不同豬種的PCR產(chǎn)物序列測序峰圖結果見圖1。位于該片段的309bp處的T/C變異引起了 Eci I酶切位點(GGCGGA(N) 11’)多態(tài)性。
[0033](5)限制性內(nèi)切酶酶切反應，多態(tài)位點限制性片段酶切多態(tài)性(RLFP)檢測
[0034]采用Eci 1-RFLP方法對豬H0XA10基因SNP進行基因分型，酶切反應條件:PCR產(chǎn)物 6ul，10XCut Smart BufferIul, Eci I (2U/ul) 0.5ul，ddH203.5ul，37°C酶切 lh。取5ul酶切產(chǎn)物在3%的 瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，之后進行基因型分析和鑒定。此擴增片段大小為404bp，Eci I酶切多態(tài)性位點位于該片段的309bp處，當該處變異位點為C堿基時，會產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶Eci I的酶切位點(GGCGGA(N)11')，由于在擴增片段16p存在另外一個Eci I酶切位點，所以Eci I消化PCR產(chǎn)物后會產(chǎn)生3個片段(294bp、94bp和16bp)，基因型為CC ;當該處變異位點為T堿基時，則不存在Eci I酶切位點，Eci I消化PCR產(chǎn)物后會產(chǎn)生2個片段(388bp和16bp)，基因型為TT ;當該處變異位點為T/C雜合基因型時，Eci I消化PCR產(chǎn)物后會產(chǎn)生4個片段(388bp、294bp、94bp和16bp)，基因型為TC。
[0035]實施例2:本發(fā)明制備的分子標記在不同豬群中的多態(tài)性分布檢測
[0036]采用PCR-RFLP的方法對PCR-Eci 1-RFLP多態(tài)性位點在國內(nèi)外7個品種共442頭豬中的基因型與等位基因頻率分布情況進行了檢測，其結果見表1。其包括中國地方豬種陸川豬、隆林豬、恩施黑豬、梅山豬和通城豬，國外豬種包括大白豬與杜洛克豬。檢測結果表明，在大白群體中TC型分布較多，TT型分布較少，C基因頻率略高于T基因頻率；在陸川豬群體中CC型分布較廣，TC型很少(只有I個)，優(yōu)勢等位基因為C ;在隆林豬群體中，CC型分布較廣，沒有TC、TT基因型，優(yōu)勢等位基因為C ;在恩施黑豬群體中，CC型分布較廣，TT型分布很少(只有I個)，優(yōu)勢等位基因為C;在梅山豬群體中，CC、TC型分布較多，沒有TT基因型，C基因頻率高于T基因頻率；在通城豬群體中，CC型分布較多，TT型分布較少，C基因頻率高于T基因頻率；在杜洛克群體中，CC型分布較廣，TC型很少(只有I個)，沒有TT基因型，優(yōu)勢等位等位基因為C。
[0037]表1H0XA10基因的基因型頻率和基因頻率
[0038]
【權利要求】
1.一種與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關的分子標記，其核苷酸序列如下所示: GCTCTGGGAGGCAAGCGCAATGAGGCGGCGTCGCCCGGTGGCGGTGGTGGCAGCGGGGGCCTGGGGCCTGGGGCGCACAGCTATGCGCCCGCGCCTATAGACTTGTGGCTGGACGCGCCCCGGTCATGCCGGATGGAGCCGCCCGAAGGGGCGCCGCAGCAGCAGCCCCAGCAGCAGCCGCCGCCCCCGCCGCAACCACCCCAGCCCCCGCCGCAGGCCACCTCGTGCTCTTTCGCGCAGAACATCAAAGAGGAGAGCTCCTACTGCCTCTACGACTCGACTGACAAATGCCCCAAAGGCTCCTCCGCRGCTGCCGAGCTGGCCCCCTTCCCGCGGGGCCCGCCGCCCGACGGCTGCGCCCTGGGCACCTCCAGCGGGGTGCCTGTGCCCGGCTACTTCCGCCT上述序列中的第309bp處的R是T或C，該突變導致PCR-Eci 1-RFLP多態(tài)性。
2.一種擴增如權利要求所述分子標記的引物對，其DNA序列如下所示: 正向引物:GCTC TGGGAGGCAAGCGCAATG， 反向引物:AGGCGGAAGTAGCCGGGCACA。
3.一種豬與產(chǎn)仔數(shù)性狀相關的遺傳標記的制備方法，其特征在于以下步驟: 從大白豬、陸川豬、隆林豬耳緣組織中提取基因組DNA，在位于豬HOXAlO基因突變位點附近設計一對引物，該引物的DNA序列如序列表SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示，對豬基因組DNA進行PCR擴增和序列測定，得到如序列表SEQ ID NO:1所示的基因片段，通過序列比對，篩查SNP，再利用SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:3所示的引物對進行PCR擴增，將PCR擴增獲得的片段進行Eci I酶切分型及檢測。
4.權利要求1所述的分子標記在豬產(chǎn)仔數(shù)性狀選擇中的應用。
5.權利要求2所述的引物對在豬產(chǎn)仔數(shù)性狀選擇中的應用。
【文檔編號】C12N15/10GK103923913SQ201410163615
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月20日 優(yōu)先權日:2014年4月20日
【發(fā)明者】趙書紅, 陳尚上, 林瑞意, 李新云, 朱猛進, 曹建華, 李長春, 余梅 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學