乙型肝炎microRNA分子標(biāo)志物組合及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一組乙型肝炎microRNA分子標(biāo)志物組合，包括一種以上選自以下的microRNA核酸分子：序列號(hào)1-18，及其在制備乙型肝炎感染診斷和/或預(yù)后評(píng)估試劑盒中的用途。本發(fā)明還提供了一種指導(dǎo)乙型肝炎感染診斷和/或預(yù)后評(píng)估的診斷試劑盒。使用本發(fā)明的乙型肝炎microRNA分子標(biāo)志物和診斷試劑盒，指導(dǎo)乙型肝炎患者的感染診斷和/或預(yù)后評(píng)估，具有操作簡(jiǎn)單，安全無(wú)創(chuàng)傷，高特異性，高靈敏性以及易于大量篩查的特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】乙型肝炎microRNA分子標(biāo)志物組合及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及乙型肝炎診斷及用藥領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)涉及一組乙型肝炎血漿microRNA 分子標(biāo)志物組合，以及該組合用于對(duì)乙型肝炎患者進(jìn)行感染診斷及預(yù)后評(píng)估的用途，指導(dǎo) 乙肝患者的感染診斷，科學(xué)用藥和停藥，既減少患者用藥痛苦，也減少醫(yī)療資源的浪費(fèi)。

【背景技術(shù)】
[0002] microRNA(miRNA)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，它是一種廣泛存在于真核生物中的單鏈 小分子RNA，不具編碼功能，但它能夠結(jié)合于基因序列的側(cè)翼區(qū)域阻遏或抑制靶mRNA的翻 譯，具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性，目前在腫瘤、血液病、病毒感染等多種疾病的 臨床診斷、治療及預(yù)后評(píng)價(jià)等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。
[0003] 我國(guó)的乙肝攜帶者約占總?cè)丝诘?-10%，以此計(jì)算，全國(guó)約有9500萬(wàn)人攜帶乙肝 病毒，其中乙肝患者大約有3000萬(wàn)，據(jù)估計(jì)在乙肝攜帶者中約有25%發(fā)展為慢性肝炎、肝 硬化，10%左右發(fā)展為肝細(xì)胞肝癌（HCC)。有資料顯示，一個(gè)慢性乙型肝炎病人一年的平均 醫(yī)療費(fèi)大約就是1100多元，然而如果病人病情進(jìn)展發(fā)展成為肝細(xì)胞癌，一年的平均花費(fèi)差 不多就是4萬(wàn)多人民幣。因此我們國(guó)家每年因?yàn)槁砸倚透窝谆蛘咭蛞倚透窝撞《靖腥疽?后而發(fā)生的相關(guān)疾病，如肝硬化、肝癌，每年直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1123億人民幣，由此可見(jiàn)乙 型肝炎病毒的感染給我們的人民帶來(lái)了嚴(yán)重的健康危害，而且直接造成了我們國(guó)家嚴(yán)重的 經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 慢性乙型肝炎診斷領(lǐng)域瓶頸問(wèn)題主要是缺乏疾病狀態(tài)系統(tǒng)評(píng)價(jià)指標(biāo)。目前主要的 臨床診斷手段包括免疫指標(biāo)、病毒指標(biāo)、生化指標(biāo)。免疫指標(biāo)（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、 HBcAb)反映HBV感染后機(jī)體的體液免疫反應(yīng)，提示機(jī)體是否感染HBV及感染后狀態(tài)（病原 清除/慢性化），但無(wú)法鑒別慢乙肝的免疫耐受階段、免疫清除階段、低病毒復(fù)制階段和再 激活階段；病毒指標(biāo)（HBV-DNA)定量/定性檢測(cè)均提示體內(nèi)病毒載量水平，但因免疫耐受和 免疫清除階段時(shí)患者體內(nèi)都表現(xiàn)高病毒載量，故病毒載量亦不能用于鑒別上述臨床狀態(tài)； 生化指標(biāo)中ALT/AST等血清酶學(xué)提示肝臟功能受損情況，多用于鑒別慢乙肝免疫耐受期和 免疫清除期，但肝臟是沉默的器官，當(dāng)肝臟功能受損70%以上時(shí)才會(huì)出現(xiàn)血清酶學(xué)異常。因 此，雖然目前臨床上將三者結(jié)合在一起綜合分析慢性乙型肝炎的疾病狀態(tài)，但因其各自的 局限性，無(wú)法系統(tǒng)、及時(shí)評(píng)價(jià)慢乙肝疾病狀態(tài)。由此帶來(lái)了慢性乙型肝炎診治中的許多熱點(diǎn) 難點(diǎn)問(wèn)題，如慢乙肝何時(shí)開始抗病毒治療、如何評(píng)價(jià)抗病毒治療的有效性以及何時(shí)停藥等 問(wèn)題。
[0005] 近年來(lái)的研究表明，乙型肝炎病毒感染、慢性乙型肝炎和miRNA密切相關(guān)， miRNA可以通過(guò)作用于病毒本身或作用于免疫系統(tǒng)從而影響治療過(guò)程，因此對(duì)乙型肝 炎用藥的診斷也可能有相應(yīng)的作用。該領(lǐng)域已開展了一些相關(guān)研究，例如，如專利申請(qǐng) CN201110462133、CN102002491A、CN102002490A/CN102002492A 以及 CN102776185B 所述，介 紹了肝癌相關(guān)的miRNA標(biāo)志物，但眾所周知，診斷肝癌和乙型肝炎所用的標(biāo)志物雖然可以 有部分重疊，但并非完全相同。迄今為止，乙型肝炎患者用藥前后的miRNA表達(dá)變化以及該 表達(dá)變化與乙型肝炎的治療及預(yù)后是否相關(guān)目前還沒(méi)有研究，在臨床研究中有必要尋找可 有效判斷乙型肝炎用藥后療效、指導(dǎo)臨床停藥的miRNA標(biāo)志物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種乙型肝炎分子標(biāo)志物組合，其包括一種以上選自以 下的 microRNA 核酸分子：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO : 12、SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO : 15、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO :17和SEQ ID NO :18。優(yōu)選地，所述的乙型肝炎分子標(biāo)志物組合含有SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :12 和 SEQ ID NO: 16。
[0007] 所述的乙型肝炎分子標(biāo)志物組合優(yōu)選地包括2-18種、更優(yōu)選3-10種、最優(yōu)選4種 選自 miR-l、miR-106b-5p、miR-122-3p、miR-122-5p、miR-146a-5p、miR-20b-3p、miR-21-5p、 miR-223、miR-22_3p、miR-25_3p、miR-26a_5p、miR-27a_3p、miR-29c_3p、miR-381_3P、 miR-433、miR-451a、miR-455-3p、miR-663 的 microRNA 核酸分子。
[0008] 本發(fā)明提供的新的乙型肝炎相關(guān)的miRNA及其組合作為乙型肝炎的分子標(biāo)志 物，含有以下特異性 miRNA，miR-1，miR-106b-5p，miR-122-3p，miR-122-5p，miR-146a-5p， miR-20b_3p， miR-21_5p， miR-223， miR-22_3p， miR-25_3p， miR-26a_5p， miR-27a_3p, miR-29c-3p，miR-381-3P，miR-433, miR-451a，miR-455-3p 和 miR-663,其序列分別如下所 示（見(jiàn) SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO :18)。
[0009]

【權(quán)利要求】
1. 一種乙型肝炎分子標(biāo)志物組合，其包括一種以上選自以下的microRNA核酸分子： SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO ：7, SEQ ID NO ：8, SEQ ID NO ：9, SEQ ID NO ：10, SEQ ID NO ：1U SEQ ID NO ：12, SEQ IDN0:13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0 :16、SEQIDN0:17和SEQIDN0:18， 優(yōu)選地，所述的一種以上為2-18種、更優(yōu)選3-10種、進(jìn)一步優(yōu)選3-8種，最優(yōu)選4種。。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎分子標(biāo)志物組合，其含有SEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO :12 和 SEQ ID NO :16。
3. 權(quán)利要求1所述的乙型肝炎分子標(biāo)志物組合用于制備乙型肝炎感染診斷和/或預(yù)后 評(píng)估試劑盒中的用途。
4. 一種用于區(qū)分至少一個(gè)乙型肝炎患者的血漿/血清和至少一個(gè)正常受試者血漿/血 清的試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的乙型肝炎分子標(biāo)志物組合的特異性引物。
5. -種指導(dǎo)乙型肝炎感染診斷和/或預(yù)后評(píng)估的診斷試劑盒，其包括： (1)血漿/血清總RNA提取試劑， ⑵RNA加 polyA試劑， (3) RT-PCR 試劑， (4) 定量PCR試劑； 其中，定量PCR試劑中包括權(quán)利要求1所述乙型肝炎分子標(biāo)志物組合的特異性正向引 物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述血漿總RNA提取試劑中包括序列為SEQ ID NO :37 的外部控制序列-1 (External Control-1)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述RNA加 polyA試劑中包括序列為SEQ ID NO :38 的外部控制序列一 2 (External Control-2)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述RT-PCR試劑中包括序列為SEQ ID NO: 39的反轉(zhuǎn)錄引物（RT-Primer)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述定量PCR試劑中包括序列分別為SEQ IDNO :40和41的通用反向引物UPM-short和UPM-long。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述診斷試劑盒，其中，所述乙型肝炎microRNA分子標(biāo)志物的特異 性正向引物的序列含有選自SEQ ID N0:18至SEQ ID N0:36所示序列中的一種或多種，優(yōu) 選含有 SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :30 和 SEQ ID NO :34。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104232636SQ201410155040
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】李寧, 李啟靖, 張永宏, 張衛(wèi)紅, 李鵬, 魏穎穎, 石佳 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院, 北京曠博生物技術(shù)有限公司