重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域重組蛋白的制備方法，具體是一種重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的制備方法，其步驟為：①根據(jù)人酸性成纖維細(xì)胞生長因子haFGF全長序列設(shè)計引物克隆得到原始基因片段，并替換掉其中存在的大腸桿菌不利表達(dá)的密碼子從而獲得優(yōu)化的haFGF基因，所述優(yōu)化的haFGF基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；克隆得到分子伴侶PDI的原始基因片段，并替換掉其中存在的大腸桿菌不利表達(dá)的密碼子從而得到優(yōu)化的PDI基因，所述優(yōu)化的PDI基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；②優(yōu)化的haFGF基因、優(yōu)化的PDI基因、標(biāo)簽序列以及蛋白酶切位點序列連接后克隆進(jìn)入載體，構(gòu)建得到高效表達(dá)載體；或是先構(gòu)建上述部分序列的備用載體，然后將其余序列連接于部分序列上。
【專利說明】重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域重組蛋白的制備方法，具體是一種重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]20世紀(jì)30年代，科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)在人的大腦和垂體的組織提取物中存在一種能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長的活性物質(zhì)，到70年代，這種物質(zhì)被分離提純。鑒于這種物質(zhì)的作用，它被命名為成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)。后來,又在多種器官組織中發(fā)現(xiàn)了這類因子，統(tǒng)稱為FGFs家族成員。不同的FGFs作為細(xì)胞間的信號分子在人胚胎發(fā)育和分化過程中起重要作用。迄今為止，共有大約23種人FGFs被發(fā)現(xiàn)。多數(shù)的FGFs在其N端具有信號肽幫助成熟蛋白分泌到胞外，但是某些FGFs成員缺乏信號肽，也能正常分泌到胞外。
[0003]FGFl也被稱為人酸性成纖維細(xì)胞生長因子(human acidic fibroblast growthfactor, haFGF)，有廣泛促分裂的作用，主要分布于腦、垂體、神經(jīng)組織、視網(wǎng)膜、腎上腺、心臟和骨骼等器官或組織內(nèi)，其他組織含量很少，在血清和體液中以極低的濃度存在。人的haFGF基因位于第4號染色體上，為單拷貝基因，由兩個大的內(nèi)含子和3個外顯子組成。haFGF蛋白由154個氨基酸殘基組成，等電點5~7，通過與其受體結(jié)合啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制從而誘導(dǎo)多種細(xì)胞分化、增殖。
[0004]大量的研究表明，haFGF蛋白有刺激血管生長、加速創(chuàng)傷愈合和促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)等多種功能，外源性人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白有望成為臨床上用于促進(jìn)傷口愈合、胃潰瘍、視神經(jīng)萎縮、神經(jīng)性耳聾、內(nèi)臟缺血損傷等多種疾病治療的有效藥物。然而天然的haFGF蛋白含量很低，有必要開發(fā)基因工程重組haFGF，高效制備haFGF蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為了解決天然的haFGF含量很低不利于藥物開發(fā)的問題，提供了一種重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的制備方法。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的制備方法，其步驟為:
①根據(jù)人酸性成纖維細(xì)胞生長因子haFGF全長序列設(shè)計引物克隆得到原始基因片段，并替換掉其中存在的大腸桿菌不利表達(dá)的密碼子從而獲得優(yōu)化的haFGF基因，所述優(yōu)化的haFGF基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；克隆得到分子伴侶TOI的原始基因片段，并替換掉其中存在的大腸桿菌不利表達(dá)的密碼子從而得到優(yōu)化的PDI基因，所述優(yōu)化的roi基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；
②優(yōu)化的haFGF基因、優(yōu)化的PDI基因、標(biāo)簽序列以及蛋白酶切位點序列連接后克隆進(jìn)入載體，構(gòu)建得到高效表達(dá)載體；或是先構(gòu)建上述部分序列的備用載體，然后將其余序列連接于部分序列上，構(gòu)建得到聞效表達(dá)載體；③高效表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)重組基因的表達(dá)；同時將含有相應(yīng)蛋白酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosseta菌株,一起誘導(dǎo)表達(dá)；隨后將兩種菌株以任意比例混合；
④用Tris緩沖液重懸細(xì)菌，超聲破碎，離心收集上清液；調(diào)整pH值，低溫振蕩使與蛋白酶切位點序列對應(yīng)的蛋白酶酶切完全，釋放出rhaFGF蛋白，得到高濃度的含有重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的溶液；
⑤將含有重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的溶液進(jìn)行純化處理，得到高純度的rhaFGF蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE分析和含量測定。
[0007]本發(fā)明中未詳細(xì)敘述“替換掉其中存在的大腸桿菌不利表達(dá)的密碼子”，由于基因優(yōu)化密碼子的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識，通常只需要給出最后優(yōu)化后的全DNA序列即可，根據(jù)此序列本領(lǐng)域技術(shù)人員即可實現(xiàn)該方法的實現(xiàn)流程。
[0008]本發(fā)明中優(yōu)化的PDI基因為分子伴侶，對于重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子的可溶性高效表達(dá)具有關(guān)鍵的輔助作用，與rhaFGF (重組haFGF)的相對位置是可變的。因此，步驟②中只要是載體上的優(yōu)化的haFGF基因、優(yōu)化的PDI基因、標(biāo)簽序列以及蛋白酶切位點序列連接在一起，無論一次克隆進(jìn)入載體或是分次克隆進(jìn)入載體，任意變換它們在載體上的前后順序，均可實現(xiàn)haFGF的高效表達(dá)。且序列的連接以及克隆進(jìn)入載體均是本領(lǐng)域公知常識，本發(fā)明不作過多的闡述。
[0009]本發(fā)明步驟②中的標(biāo)簽序列除了采用本發(fā)明提到的六個連續(xù)的組氨酸標(biāo)簽序列HIS6，還可采用本領(lǐng)域常用的其它標(biāo)簽序列，例如Flag標(biāo)簽，HA標(biāo)簽，GST標(biāo)簽等等。
[0010]本發(fā)明步驟②中的蛋白酶切位點序列除了采用本發(fā)明提到的PP (PrescissionProtease)蛋白酶切位點序列，還可采用本領(lǐng)域常用的其它蛋白酶切位點序列，例如Thrombin 酶，Enterokinase 酶，TEV 酶等等。
[0011]本發(fā)明步驟②中的載體除了采用本發(fā)明提到的pET-26b，還可采用本領(lǐng)域常用的其它表達(dá)載體，例如pET-15，pET-21, pET28等等。
[0012]本發(fā)明步驟③中所述的相應(yīng)蛋白酶指的是步驟②中的蛋白酶切位點序列所對應(yīng)的蛋白酶。
[0013]進(jìn)一步，步驟③中haFGF重組蛋白菌株與蛋白酶菌株的質(zhì)量比為50:1。本發(fā)明步驟③中所述的兩種菌株以任意比例混合，但是50:1的質(zhì)量比為恰好蛋白酶能夠酶切完全，且不造成浪費的質(zhì)量比。若該比例小于50:1，含有蛋白酶的菌株過多，造成蛋白酶的浪費和雜蛋白的增多；若該比例大于50:1，蛋白酶含量過低，不能完全酶切完全，釋放出的rhaFGF蛋白相對較少。
[0014]進(jìn)一步，步驟⑤中的純化處理為:將含有重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的溶液的PH值調(diào)整至8，然后上鎳離子親和柱，用Tris緩沖液上柱，15mM咪唑洗脫雜蛋白，250mM咪唑洗脫目的蛋白，透析過夜。
[0015]本發(fā)明步驟⑤中的純化處理可以采用本領(lǐng)域常規(guī)使用的離子交換、親和層析、液相色譜以及分子篩等手段來處理目的蛋白；但是本發(fā)明提供的純化處理相對于常規(guī)手段，具有快速高效的特點。
[0016]利用本發(fā)明所述的重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的制備方法，使得PDI輔助rhaFGF保持可溶解高活性的正確折疊狀態(tài)，SDS-PAGE分析純化處理后的rhaFGF蛋白純度在95%以上，濃度超過0.5mg/ml。制備方法簡單，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可以作為藥物或保健用品，利于向大眾推廣。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為PET_26b載體的圖譜以及載體上的多克隆位點。
[0018]圖2 為 haFGF 基因在 pET-26b-haFGF_HIS6-pp-PDI 的質(zhì)粒構(gòu)建圖。
【具體實施方式】
[0019]實施例1
重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的制備方法: I~2)構(gòu)建pET-26b-PD1-pp的備用載體
設(shè)計ΗΠ的引物，相應(yīng)的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，需要包含酶切位點，從5'-3'排列如下所示:
【權(quán)利要求】
1.重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的制備方法，其特征在于，其步驟為: ①根據(jù)人酸性成纖維細(xì)胞生長因子haFGF全長序列設(shè)計引物克隆得到原始基因片段，并替換掉其中存在的大腸桿菌不利表達(dá)的密碼子從而獲得優(yōu)化的haFGF基因，所述優(yōu)化的haFGF基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；克隆得到分子伴侶PDI的原始基因片段，并替換掉其中存在的大腸桿菌不利表達(dá)的密碼子從而得到優(yōu)化的PDI基因，所述優(yōu)化的roi基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示； ②優(yōu)化的haFGF基因、優(yōu)化的PDI基因、標(biāo)簽序列以及蛋白酶切位點序列連接后克隆進(jìn)入載體，構(gòu)建得到高效表達(dá)載體；或是先構(gòu)建上述部分序列的備用載體，然后將其余序列連接于部分序列上，構(gòu)建得到聞效表達(dá)載體； ③高效表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)重組基因的表達(dá)；同時將含有相應(yīng)蛋白酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosseta菌株,一起誘導(dǎo)表達(dá)；隨后將兩種菌株以任意比例混合； ④用Tris緩沖液重懸細(xì)菌，超聲破碎，離心收集上清液；調(diào)整pH值，低溫振蕩使與蛋白酶切位點序列對應(yīng)的蛋白酶酶切完全，釋放出rhaFGF蛋白，得到高濃度的含有重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的溶液； ⑤將含有重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的溶液進(jìn)行純化處理，得到高純度的rhaFGF蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE分析和含量測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的制備方法，其特征在于，步驟②中的標(biāo)簽序列為六個連續(xù)的組氨酸標(biāo)簽序列HIS6，蛋白酶切位點序列為pp蛋白酶切位點序列，載體為pET-26b ;步驟③中的相應(yīng)蛋白酶為pp蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的制備方法，其特征在于，所述的步驟②為:優(yōu)化的haFGF基因3'末端增加HIS6，構(gòu)建得到基因片段haFGF- HIS6 ；優(yōu)化的PDI基因5'末端加入pp蛋白酶`切位點序列，構(gòu)建得到基因片段pp-PDI ;然后將基因片段PP-PDI接到基因片段haFGF- HIS6的3'末端一起克隆進(jìn)入pET_26b載體，構(gòu)建得到高效表達(dá)載體 pET-26b-haFGF- HIS6-pp_PDI。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的制備方法，其特征在于，所述的步驟②為:優(yōu)化的PDI基因5'末端加入pp蛋白酶切位點序列，構(gòu)建得到基因片段PP-PDI ;基因片段pp-PDI克隆進(jìn)入pET-26b載體，構(gòu)建得到pET-26b_ pp-PDI備用載體；優(yōu)化的haFGF基因3'末端增加HIS6，構(gòu)建得到基因片段haFGF- HIS6 ;基因片段haFGF- HIS6克隆進(jìn)入pET-26b- pp-PDI備用載體，構(gòu)建得到高效表達(dá)載體pET_26b_haFGF-HIS6-PP-PDI。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一權(quán)利要求所述的重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的制備方法，其特征在于，步驟③中haFGF重組蛋白菌株與蛋白酶菌株的質(zhì)量比為50:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一權(quán)利要求所述的重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的制備方法，其特征在于，步驟⑤中的純化處理為:將含有重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白的溶液的PH值調(diào)整至8，然后上鎳離子親和柱，用Tris緩沖液上柱，15mM咪唑洗脫雜蛋白，250mM咪唑洗脫目的蛋白，透析過夜。
【文檔編號】C12N15/70GK103882047SQ201410098355
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】楊霞 申請人:太原錦波生物醫(yī)藥科技有限公司