一種用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明的一種菌株復(fù)合載體材料，是由阿特拉津降解菌株以及載體材料通過造粒制得，其中所述的載體材料由膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸組成。研究表明，本發(fā)明的菌株復(fù)合載體材料能夠有效提升菌種對高溫和紫外線的耐受力，且對土壤中的阿特拉津能夠達(dá)到完全降解，同時對土壤微生物多樣性擾動較小。因此，本發(fā)明所制備得到的用于土壤有機物污染修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料為阿特拉津污染土壤的修復(fù)提供了技術(shù)支持，有效解決了阿特拉津污染土壤修復(fù)的問題，同時也為其它種類土壤有機污染的生物修復(fù)提供了參考。
【專利說明】一種用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于土壤有機物污染修復(fù)的載體材料及其制備方法和應(yīng)用，特別涉及一種用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明屬于土壤修復(fù)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]土壤污染及其對整個生態(tài)系統(tǒng)的負(fù)面效應(yīng)是當(dāng)代人類面臨的主要問題之一(Umaret al., 2012; Yergeau et al.，2013)。阿特拉津(atrazine)是目前世界銷售額最大的18個除草劑品種之一 (Siripattanakul et al., 2009; Khan et al.，2013),在土壤中的半衰期長，容易對一些后巷敏感作物產(chǎn)生藥害(Anderson and Georgeson, 1989;Mandelbaum etal.，1995)，導(dǎo)致土壤微生物氧化損傷(Zhang et al.，2012a; 2012b)，引起土壤微生物群落多樣性降低(Moreno et al., 2007; Briceno et al.，2010),已被列為環(huán)境荷爾蒙的可疑物質(zhì)(Cooper et al., 2000;Laws et al.，2000;Walid et al., 2010;Swain et al，2013),且對動物細(xì)胞具有遺傳學(xué)毒性(瞿建宏和吳偉，2002; Gammon et al.，2005)。我國從20世紀(jì)80年代初，開始在華北和東北地區(qū)的玉米田廣泛使用阿特拉津(Shen and Liu, 1992; Ye etal.，1999)，吉林吉化、河北宣化和浙江長興有全國三大阿特拉津生產(chǎn)廠家，每年阿特拉津原粉年產(chǎn)量可達(dá)數(shù)萬噸，阿特拉津在東北地區(qū)使用更加廣泛，僅遼寧一省就有5.3 X105hm2土地在使用阿特拉津除草，使用量超過1600t (司友斌和孟雪梅，2007)，我國已經(jīng)將阿特拉津列為52種優(yōu)先控制污染物之一 (Huang et al.，2013)。
[0003]阿特拉津的非生物降解研究主要集中在光氧化(Chan et al.，2004)、Fe (II)-H2O2原位化學(xué)氧化(Mecozzi et al.，2006)、UV_H202高級氧化(高燕飛等，2010)和微波(MW)/UV/H202共同處理(Chen et al., 2010)等方面，但是該類方法操作復(fù)雜且耗能較高，在實際應(yīng)用中受到了限制。由于生物修復(fù)有機污染的溫和性和多樣性，兼具有成本低、操作簡便、無二次污染及處理效果好等優(yōu)點，能達(dá)`到對污染土壤永久清潔修復(fù)的目的，是目前最有效、最可靠和最有前景的有機污染物修復(fù)手段(Gao et al.，2011)。因此，阿特拉津的生物修復(fù)已經(jīng)成為了農(nóng)藥污染控制領(lǐng)域的研究熱點。
[0004]目前，約有20多個種屬的微生物能降解阿特拉津，主要包括細(xì)菌、真菌、放線菌等(董春香和蔣桂蘭，2001; Seybold et al.，2001;郭火生等，2012; Zhanget al.，2012;王志剛等，2013)，并且在降解菌廉價發(fā)酵培養(yǎng)基的研究開發(fā)方面也取得了重要成果(Zhang etal.，2012c;王洋等，2013)，但是對于修復(fù)菌劑研發(fā)與應(yīng)用研究在國內(nèi)外報道還比較少，本研究旨在研發(fā)阿特拉津修復(fù)菌株復(fù)合載體材料及其制備方法，并對修復(fù)效果和土壤微生物多樣性的響應(yīng)開展了研究工作，為阿特拉津污染土壤的修復(fù)提供技術(shù)支持，為其它種類土壤有機污染的生物修復(fù)提供參考。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一種用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料；
[0006]本發(fā)明的目的之二是提供一種制備上述菌株復(fù)合載體材料的方法；
[0007]本發(fā)明的目的之三是提供所制備得到的菌株復(fù)合載體材料在土壤有機物污染修復(fù)中的應(yīng)用。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段為:
[0009]本發(fā)明的一種用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料，其特征在于由阿特拉津降解菌株以及載體材料通過造粒制得，其中所述的載體材料由膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸組成。
[0010]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，按重量計，所述的載體材料中膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸的比例為 0.5-1:0.5-1:0.5-1.5，更優(yōu)選為 1:0.5:0.5。
[0011]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的膨潤土的粒徑為325目，所述的珍珠巖粉的粒徑為90目，所述的腐植酸的粒徑為60目。
[0012]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的阿特拉津降解菌株為阿特拉津降解菌DNS32，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC N0.5365，保藏日期為2011年10月21日。該菌株已記載在申請?zhí)枮?01110371730.9，發(fā)明名稱為“一株阿特拉津降解菌”的專利申請中，并于2012年06月13日公開。
[0013]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的阿特拉津降解菌株按照1.0X IO7-L OX IO9CFU -g^1載體材料的比例，更優(yōu)選的，是按照2.0X IO8CFU.g—1載體材料的比例滴加到載體材料中進(jìn)行造粒，造粒完成后，自然風(fēng)干至含水量為30%，即得。
[0014]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述`的造粒采用圓盤機造粒，圓盤造粒機的直徑為2.5m,造粒盤轉(zhuǎn)速為22r.mirT1,造粒盤傾角為45°~55°。
[0015]進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種制備以上任一項所述的用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0016](I)活化阿特拉津降解菌株DNS32的斜面菌種，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)24h，OD為0.8時，以發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1%為接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25°C，120r.mirT1搖瓶發(fā)酵48h，至生物量為6 X IO8CFU.md X IO8CFU.mL—1，得到阿特拉津降解菌菌劑；
[0017](2)將膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸均勻混合制備得到載體材料；
[0018](3)按照 1.0X IO7-L OX IO9CFU.g-1 載體材料的比例，優(yōu)選按照 2.0XlO8CFU.g-1載體材料的比例，將步驟(1)制備得到的菌劑滴加到載體材料中在圓盤上進(jìn)行造粒；所述的造粒采用圓盤機造粒，圓盤造粒機的直徑為2.5m,造粒盤轉(zhuǎn)速為22r.mirT1,造粒盤傾角為45°~55°，造粒完成后，自然風(fēng)干至含水量為30%，即得用于土壤有機物污染修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料。
[0019]在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有K2HPO4L 6g.?ΛKH2PO40.4g.L-1, MgSO40.2g.L-1, NaCl0.1g.I71，葡萄糖 3.0g.I71,阿特拉津 0.1g.L-1,調(diào)PH為7.0,蒸餾水定容至1000ml ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有:玉米粉39.494g.L_\大豆粉25.638g.ΙΛ CaC033g.?Λ Κ2ΗΡ043.265g.?Λ MgSO4.7Η200.2g.?Λ NaCl0.2g.L'i周 pH為7.0，蒸餾水溶解定容至1000ml。
[0020]在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，按重量計，所述的載體材料中膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸的比例為0.5-1:0.5-1:0.5-1.5，更優(yōu)選為1:0.5:0.5。
[0021]再進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的菌株復(fù)合載體材料在土壤有機物污染修復(fù)中的應(yīng)用，所述的有機污染物主要包括阿特拉津。
[0022]本發(fā)明采用正交試驗方法，以阿特拉津降解菌株的存活率為目標(biāo)形狀，參考材料成球率，同時結(jié)合原料成本、價格和收益等統(tǒng)籌考慮選取合適的用量，從而對選用的膨潤土、珍珠巖粉、腐植酸混合用量進(jìn)行優(yōu)化，此外，結(jié)合本發(fā)明的制備工藝制備得到了適用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料。接著本發(fā)明發(fā)明人進(jìn)行了不同溫度和紫外線照射時間對載體內(nèi)菌株存活率影響的研究，結(jié)果表明本發(fā)明的菌株復(fù)合載體材料能夠有效提升菌種對高溫和紫外線的耐受力，且當(dāng)膨潤土、珍珠巖粉和腐植酸質(zhì)量比為1:0.5:0.5時效果最佳。
[0023]將采用最佳配比得到的載體材料添加到發(fā)酵菌體中制備得到菌株復(fù)合載體材料，進(jìn)行土壤修復(fù)試驗。結(jié)果表明，按照菌株復(fù)合載體材料與修復(fù)土體的質(zhì)量百分比計算，在菌株復(fù)合載體材料(載體菌劑)的添加量為0.1%和0.5%的處理中，35d時，阿特拉津基本完全降解，而采用自由菌處理的對照組阿特拉津殘留量均>16%，說明吸附載體增強了菌株的修復(fù)活力；通過檢測修復(fù)過程中土壤微生物Shannon多樣性指數(shù)和均勻度發(fā)現(xiàn)添加0.1%載體菌劑處理對土壤微生物多樣性擾動較小。因此，綜合比較阿特拉津降解效果、微生物群落多樣性變化及成本等因素，確定0.1%的載體菌劑添加量為最佳修復(fù)處理添加量。
[0024]綜上，本發(fā)明所制備得到的用于土壤有機物污染修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料為阿特拉津污染土壤的修復(fù)提供了技術(shù)支持，有效解決了阿特拉津污染土壤修復(fù)的問題，同時也為其它種類土壤有機污染的生物修復(fù)提供了參考。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為在15°C (a)、25°C (b)、40°C (c)和60°C (d)條件下不同載體中菌體存活率；
[0026]圖2為不同載體抗紫外線能力檢測；
[0027]圖3為阿特拉津在不同處理中的殘留曲線；
[0028]圖4為生物修復(fù)對土壤微生物Shannon多樣性指數(shù)和均勻度的影響。
【具體實施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0030]實施例1用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料的制備
[0031]1、菌種與培養(yǎng)基
[0032]Acinetobacter sp.DNS32為本實驗室分離獲得的一株阿特拉津降解菌株(郭火生等，2012;王志剛等，2013) ，該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC N0.5365，保藏日期為2011年10月21日。該菌株已記載在申請?zhí)枮?01110371730.9，發(fā)明名稱為“一株阿特拉津降解菌”的專利申請中，并于2012年06月13日公開。
[0033]基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g? L—1) ：K2HP041. 6，KH2P040. 4，MgS040. 2，NaClO. 1，葡萄糖 3. 0，阿特 拉津0. 1，pH7. 0，蒸餾水定容至1000ml ；
[0034]發(fā)酵培養(yǎng)基（Zhanget al. , 2012) (g ? I71):玉米粉 39. 494，大豆粉 25. 638， CaC0s3, K2HP043. 265，MgS04 ? 7H200. 2，NaClO. 2，pH7. 0，蒸餾水溶解定容至 1000ml。
[0035]2、方法
[0036](1)活化阿特拉津降解菌株DNS32的斜面菌種，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)24h，0D 為0. 8時，以發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1%為接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，25°C，120r ? min—1搖瓶發(fā) 酵48h，至生物量為7. 2X108CFU ? mL—1左右，得到阿特拉津降解菌菌劑；
[0037](2)將膨潤土（325目)、珍珠巖粉（90目)、腐植酸(生物腐植酸> 40%,生化黃腐 酸≤20%，60目）按照重量比為1:0. 5:0. 5混合均勻制備得到載體材料；
[0038](3)按照2. OX 108CFU .g—1載體材料的比例，將步驟（1)制備得到菌劑滴加到載體 材料中在圓盤上進(jìn)行造粒；所述的造粒采用圓盤機造粒，圓盤造粒機的直徑為2. 5m，造粒 盤轉(zhuǎn)速為22r ^化―1，造粒盤傾角為45°?55°，造粒完成后，自然風(fēng)干至含水量為30%，即 得用于土壤有機物污染修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料。
[0039]實施例2用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料的制備
[0040]1、菌種與培養(yǎng)基
[0041]同實施例1。
[0042]2、方法
[0043](1)活化阿特拉津降解菌株DNS32的斜面菌種，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)24h，0D 為0. 8時，以發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1%為接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，25°C，120r ? min—1搖瓶發(fā) 酵48h，至生物量為8X 108CFU ? mL—1左右，得到阿特拉津降解菌菌劑；
[0044](2)將膨潤土（325目)、珍珠巖粉（90目）、腐植酸(生物腐植酸> 40%,生化黃腐 酸≤20%，60目）按照重量比為0. 5:1:0. 5混合均勻制備得到載體材料；
[0045](3)按照IX 108CFU 載體材料的比例，將步驟（1)制備得到菌劑滴加到載體材 料中在圓盤上進(jìn)行造粒；所述的造粒采用圓盤機造粒，圓盤造粒機的直徑為2. 5m，造粒盤 轉(zhuǎn)速為22r ^化―1，造粒盤傾角為45°?55°，造粒完成后，自然風(fēng)干至含水量為30%，即得 用于土壤有機物污染修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料。
[0046]實施例3用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料體系的建立及其在降 解阿特拉津中的應(yīng)用
[0047]1 材料與方法（Materials and methods)
[0048]1. 1菌種與培養(yǎng)基
[0049]同實施例1，
[0050]1. 2菌劑制備與生物量測定
[0051]活化斜面菌種Acinetobacter sp. DNS32，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)24h，0D為0. 8 時，按照體積百分比為1%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，25°C，120r ? mirT1搖瓶發(fā)酵48h，生物量約為 7. 2X108CFU ? mL'按照2. OX 108CFU ? g—1載體材料的比例在圓盤上滴加進(jìn)行造粒。圓盤 造粒機的直徑為2. 5m,造粒盤轉(zhuǎn)速為22r ? mirT1,造粒盤傾角為45°?55° ,造粒結(jié)束后， 自然風(fēng)干至含水量為30%，根據(jù)進(jìn)料量和成球質(zhì)量計算材料成球率。[0052]采用正交試驗方法，對選用的3種載體材料一膨潤土(325目)、珍珠巖粉(90目)、腐植酸(生物腐植酸> 40%，生化黃腐酸> 20%, 60目)的混合用量進(jìn)行試驗，因素水平見表1。采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個梯度設(shè)定5個平行，進(jìn)行平板計數(shù)計算Acinetobacter sp.DNS32的存活率。在廣口瓶內(nèi)避光室溫放置45d后，測定存活率，選取存活率較好的3個載體配比處理，設(shè)定3個平行，在廣口瓶中分別在15°C、25°C、40°C、60°C條件下儲存，放置0d、5d、10d、15d、20d后測定菌株存活率。同時，把3個載體配比處理均勻平鋪在培養(yǎng)皿上，每個處理3個平行，置于波長312nm紫外燈下IOcm處，分別照射Omin、20min、40min、60min和80min,測定菌株存活率。
[0053]表1因素質(zhì)量比例水平
【權(quán)利要求】
1.一種用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料，其特征在于由阿特拉津降解菌株以及載體材料通過造粒制得，其中所述的載體材料由膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸組成。
2.如權(quán)利要求1所述的用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料，其特征在于按重量計，所述的載體材料中膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸的比例為0.5-1:0.5-1:0.5-1.5，優(yōu)選 1:0.5:0.5。
3.如權(quán)利要求2所述的用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料，其特征在于所述的膨潤土的粒徑為325目，所述的珍珠巖粉的粒徑為90目，所述的腐植酸的粒徑為60目。
4.如權(quán)利要求1所述的用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料，其特征在于所述的阿特拉津降解菌株為阿特拉津降解菌DNS32，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC N0.5365，保藏日期為2011年10月21日。
5.如權(quán)利要求1或4所述的用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料，其特征在于所述的阿特拉津降解菌株按照1.0X IO7-L OX IO9CFU.g—1載體材料的比例，優(yōu)選按照2.0X IO8CFU.g—1載體材料的比例滴加到載體材料中進(jìn)行造粒，造粒完成后，自然風(fēng)干至含水量為30%，即得。
6.如權(quán)利要求1或5所述的用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料，其特征在于所述的造粒采用圓盤機造粒，圓盤造粒機的直徑為2.5m,造粒盤轉(zhuǎn)速為22r.mirT1,造粒盤傾角為45°~55°。
7.制備權(quán)利要求1-6任一項所述的用于阿特拉津污染土壤修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料的方法，其特征在于包括以下步驟: Cl)活化阿特拉津降解菌株DNS32`的斜面菌種，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)24h，OD為0.8時，以發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1%為接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25°C，120r -min^1搖瓶發(fā)酵48h，至生物量為6 X IO8CFU.md X IO8CFU.πι?Λ得到阿特拉津降解菌菌劑； (2)將膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸均勻混合制備得到載體材料； (3)按照1.0X IO7-L OX IO9CFU.g—1載體材料的比例，優(yōu)選按照2.0X IO8CFU.g—1載體材料的比例，將步驟(1)制備得到的菌劑滴加到載體材料中在圓盤上進(jìn)行造粒；所述的造粒采用圓盤機造粒，圓盤造粒機的直徑為2.5m,造粒盤轉(zhuǎn)速為22r.mirT1,造粒盤傾角為45°~55°，造粒完成后，自然風(fēng)干至含水量為30%，即得用于土壤有機物污染修復(fù)的菌株復(fù)合載體材料。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有K2HPO4L6g.L—1，KH2PO40.4g.L-1, MgSO40.2g.L-1, NaCl0.1g.I71，葡萄糖 3.0g.I71,阿特拉津 0.1g.L-1,調(diào)PH為7.0,蒸餾水定容至1000ml ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有:玉米粉39.494g.L_\大豆粉25.638g.ΙΛ CaC033g.?Λ Κ2ΗΡ043.265g.?Λ MgSO4.7Η200.2g.?Λ NaCl0.2g.L'i周 pH為7.0，蒸餾水溶解定容至1000ml。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于按重量計，所述的載體材料中膨潤土、珍珠巖粉以及腐植酸的比例為0.5-1:0.5-1:0.5-1.5，優(yōu)選為1:0.5:0.5。
10.權(quán)利要求1-6任一項所述的菌株復(fù)合載體材料在阿特拉津污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/01GK103882003SQ201410087829
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】張穎, 王志剛, 姜昭, 孟慶娟, 王蕾, 馮程程 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)