一種甲基營養(yǎng)菌及其發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甲基營養(yǎng)菌及其發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明從土壤中篩選分離到一株新菌株Methylopilasp.YHT-1，該菌能夠生產(chǎn)吡咯喹啉醌，已于2014年1月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M2014016。該菌株在以甲醇為碳源的培養(yǎng)基中好氧培養(yǎng)3-4天，產(chǎn)吡咯喹啉醌50-113mg/L。本發(fā)明首次報(bào)道了Methylopilasp.能過量產(chǎn)生PQQ并能分泌到胞外，為發(fā)酵法制備PQQ提供了新菌種。
【專利說明】一種甲基營養(yǎng)菌及其發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種甲基營養(yǎng)菌及其發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]吡咯喹啉醌(Pyrroloquinolinequinone,PQQ)，化學(xué)名稱為 4, 5-二氫-4, 5-二氧化-1-氫吡咯(2, 3f )醌-2, 7,9 —三羧酸,別名Methaxatin,是1979年由Salisbury等人發(fā)現(xiàn)的，最初描述是在細(xì)菌細(xì)胞中作為膜結(jié)合脫氫酶的氧化還原輔因子。目前，在許多不同生物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)存在PQQ，它可以防止活細(xì)胞被體內(nèi)或體外的氧損傷；還可作為營養(yǎng)因子和維生素促進(jìn)細(xì)胞生長和提高細(xì)菌在極端條件下的耐受性；哺乳動物細(xì)胞分化中誘導(dǎo)蛋白激酶的產(chǎn)生；通過增加不溶性磷酸鹽的可利用性和作為生物防治劑來提高作物生產(chǎn)力；利用氧化還原特性應(yīng)用于生物傳感器；眾多發(fā)現(xiàn)已經(jīng)將PQQ具有異常高的氧化還原循環(huán)能力和它在抗神經(jīng)細(xì)胞衰老、抗癌、藥劑、作為信號分子等方面的潛力關(guān)聯(lián)起來，其應(yīng)用一旦成功，PQQ將發(fā)揮不可替代的重要作用?？傊?，吡咯喹啉醌有多種功能，作為營養(yǎng)因子或維生素參與多種生命活動(Journalofbiosciences, 2012, 37(2):313-325.)，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、輕工業(yè)和食品業(yè)等方面具有重要的開發(fā)價(jià)值。
[0003]目前，化學(xué)法生產(chǎn)PQQ步驟繁雜、產(chǎn)率低、副產(chǎn)物多、提取純化步驟多，并用到有毒化學(xué)試劑，污染嚴(yán)重且后續(xù)處理困難(JournaloftheAmericanChemicalSociety, 1981，103:5599-2600.)。微生物發(fā)酵法具有降低生產(chǎn)成本，清潔低碳、溫和可控等優(yōu)勢；同時(shí)發(fā)酵法一般以甲醇為唯一碳源，培養(yǎng)基以無機(jī)鹽為主，這有利于產(chǎn)品的提取。
[0004]迄今發(fā)現(xiàn)的能過量產(chǎn)生PQQ的野生菌包括:無色桿菌屬(Achromobacter)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、彎桿菌屬(Ancylobacter)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、甲燒單胞菌屬(Methanomonas)、甲基菌屬(Methylobacillus)、甲基單胞菌屬(Methylomonas)Ji^甲基菌屬(MethylophiIus)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、微環(huán)菌屬(MicrocycIus)、枝動菌屬(Mycoplana)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、精朊桿菌屬(Protaminobacter)、原單胞菌屬(Protomonas)、硫桿菌(Thiobacillus)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)(生物技術(shù)通訊，2009，20(6):874-879.)，以及粘球菌屬(Myxococcus)(生物技術(shù)通報(bào)，2013，1:029.)和副球菌屬(Paracoccus)(海洋漁業(yè)，2012，34 (I):89-95.)等。其中以甲基營養(yǎng)型細(xì)菌的PQQ生物合成水平最高。專利US4，994，382公布了副球菌IF013301、精朊桿菌IF03708和假單胞菌FERMP-7596發(fā)酵制備PQQ，產(chǎn)物濃度分別為4.5mg/L、5.8mg/L、30mg/L ；US5, 344，768公布了甲基桿菌、彎桿菌、生絲微菌等屬的29株菌種，其PQQ生產(chǎn)水平也只為0.07mg/L-7mg/L ；W02012/118225A1 公開了通過基因工程手段將 M.extorquensstrainAMl和H.denitrificansstrain ATCC51888兩株菌進(jìn)行修飾，改造后最高產(chǎn)量分別才為114mg/L 和 10.9mg/L。中國專利 CN102061278A 公開了食甲基菌 Methylovorussp.MP688 (CGMCCN0.4096)，在常規(guī)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，PQQ產(chǎn)量達(dá)到125mg/L ；雖然CN103224965A公布了經(jīng)優(yōu)化后在7.5L罐上的PQQ產(chǎn)量可達(dá)2g/L，但是，多數(shù)野生菌的PQQ產(chǎn)量在2-3mg/L，篩選高產(chǎn)菌株仍是發(fā)酵制備PQQ工業(yè)化的關(guān)鍵。
[0005]本發(fā)明從江蘇無錫錫南農(nóng)藥廠周圍土壤分離篩選得到一株甲基營養(yǎng)菌YHT-1，屬于PQQ產(chǎn)生菌新菌屬，其產(chǎn)量明顯高于一般野生菌株，通過優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)一步提高產(chǎn)物濃度，并且通過一步純化發(fā)酵上清液就可得到純度較高的PQQ產(chǎn)物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種Methylopilasp.YHT-1菌株,是一株
甲基營養(yǎng)菌。
[0007]所述Methylopilasp.YHT-1已于2014年I月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保減中心，保減地址為中國武漢武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保減中心，保減編號為CCTCCNO:M2014016。
[0008]所述Methylopilasp.YHT-Ι與和其同源性99%的兩株菌Methylopilajiangsuensisstrain JZL-4、Methylopilasp.MUSA 相比，具有不同分類學(xué)特性=YHT-1無鞭毛，氧化酶、吲哚反應(yīng)、淀粉水解呈陰性，不利用果糖，對鏈霉素?zé)o抗性。 [0009]所述Methylopilasp.YHT-1在K培養(yǎng)基平板上，菌落呈乳白色，半透明，粘稠的，中間凸起，邊緣整齊，直徑l_2mm。電鏡照片表明，菌體為桿狀或(橢)球狀，不產(chǎn)生芽孢，有莢膜，無鞭毛；大小約為0.5-0.7X0.9-1.4 μ m。兼性厭氧，革蘭氏陰性，適宜生長溫度范圍25-370C ;適宜生長pH范圍6.5-8.0 ;能較好利用甲醇、甲基胺，微利用D-葡萄糖、醋酸鹽、丙酮酸鹽；能夠利用銨鹽、硝酸鹽以及牛肉膏、蛋白胨等復(fù)雜氮源。
[0010]所述K培養(yǎng)基:硫酸銨2.0g/L,磷酸二氫鉀2.0g/L,氯化鈉0.5g/L，七水硫酸鎂
0.125g/L，七水硫酸亞鐵 0.002g/L,甲醇 8g/L，ρΗ7.2。
[0011]本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用所述甲基營養(yǎng)菌Methylopilasp.YHT-1發(fā)酵產(chǎn)PQQ的方法:將原始菌株接種于斜面培養(yǎng)基，25~37°C培養(yǎng)2~3天，進(jìn)行活化；將活化好的菌株接種于種子培養(yǎng)基，在25~37°C、120~220rpm條件下震蕩培養(yǎng)10~30小時(shí)；然后將種子液按1%~10% (v/v)接種到含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶或發(fā)酵罐發(fā)酵3~5天。
[0012]所述三角瓶發(fā)酵是用250mL三角瓶裝50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量1%~10%(v/v)，發(fā)酵溫度為25~37°C、轉(zhuǎn)速120~220rpm。
[0013]所述發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵罐裝液1/3~2/3 (v/v),轉(zhuǎn)速300~500rpm,接種量、溫度同三角瓶發(fā)酵。
[0014]所述種子培養(yǎng)基組成為:無機(jī)氮源I~3g/L，硫酸鎂0.3~3g/L，磷酸二氫鉀
1.4~4.2g/L，磷酸氫二鈉3~9g/L，酵母膏3~5g/L，甲醇7~17g/L ;初始ρΗ7.2~7.5。所述無機(jī)氮源包括氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀或其組合。
[0015]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:氮源I~5g/L，硫酸鎂0.3~2.4g/L，磷酸二氫鉀1.4~
2.8g/L,磷酸氫二鈉3~6g/L,氯化猛5~10mg/L,葉酸0.05~0.5mg/L,甲醇7~50g/L ；初始pH6.5~7.2。所述氮源可以是氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、酵母膏或牛肉膏，也可以是其組合。
[0016]本發(fā)明從江蘇無錫錫南農(nóng)藥廠周圍土壤分離篩選得到一株甲基營養(yǎng)菌YHT-1，屬于PQQ產(chǎn)生菌新菌屬，與一般的PQQ產(chǎn)生菌相比，具有更廣泛的發(fā)酵溫度(25°C~37°C )，可以利用酵母膏等復(fù)雜氮源，短時(shí)間內(nèi)生長達(dá)到較高的生物量和PQQ產(chǎn)量。通過對發(fā)酵條件的初步優(yōu)化，該菌在3L發(fā)酵罐中PQQ產(chǎn)量可達(dá)113mg/L，且發(fā)酵液經(jīng)一步純化及能得到純度較高的PQQ。此外,Methylopilasp.是1998年發(fā)現(xiàn)的分類位置未定的新菌屬(《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(第二版，2004))，該菌屬還沒有關(guān)于合成PQQ的報(bào)道。
[0017]生物材料保藏
[0018]Methylopilasp.YHT-Ι已于2014年I月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCCNO:M2014016。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為純化產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果，其中左圖是PQQ標(biāo)準(zhǔn)品，右圖是純化產(chǎn)物。
[0020]圖2為純化產(chǎn)物的紫外吸收光譜。
[0021]圖3為菌株YHT-1的掃描電鏡照片。
[0022]圖4為發(fā)酵罐中菌體生長曲線及PQQ濃度變化。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下是有關(guān)Methylopilasp.YHT-1菌株的實(shí)施例，并結(jié)合附圖詳細(xì)介紹本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于所列出的幾個(gè)實(shí)例。
[0024]產(chǎn)物的純化與提取:
[0025]純化儀器如AKTAavant蛋白純化儀,將發(fā)酵上清液膜慮后以lmL/min流速經(jīng)過DEAE陰離子交換柱，接著用2~5倍柱體積的檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)洗滌平衡，再以含有IMNaCl的檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積為10~20CV，得到初步純化后的呈紅色的PQQ產(chǎn)物。
[0026]產(chǎn)物分析方法:
[0027](I)NBT — Gly化學(xué)法:見《3種檢測吡咯喹啉醌的方法比較》(生物技術(shù)通訊，2011，22(4):544-547.)。
[0028](2) HPLC分析:流動相為12.5mM磷酸二氫鉀溶液:甲醇=85:15 (v/v);進(jìn)樣量10~20 μ L ;流速0.8~1.2mL/min ;檢測波長254nm ;柱溫30°C ;檢測器為DAD ;色譜柱為Waters SunFire?C18 反向柱(5 μ m,4.6mmX250mm)。
[0029](3)紫外吸收光譜分析:利用紫外-可見光分光光度計(jì)，對PQQ標(biāo)準(zhǔn)品和純化后的PQQ溶液直接進(jìn)行220-400nm的波長掃描，測定二者的紫外吸收光譜是否一致。
[0030]實(shí)施例1PQQ產(chǎn)生菌的篩選
[0031]斜面培養(yǎng)基和平板篩選培養(yǎng)基:為K培養(yǎng)基，見《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(第二版，2004,第二卷，PartC, P421.)。K培養(yǎng)基:硫酸銨2.0g/L,磷酸二氫鉀2.0g/L,氯化鈉
0.5g/L，七水硫酸鎂0.125g/L，七水硫酸亞鐵0.002g/L,甲醇8g/L，pH7。
[0032]篩選時(shí)所用發(fā)酵培養(yǎng)基:硫酸銨3.0g/L，磷酸二氫鉀1.4g/L，磷酸氫二鈉3.0g/L,硫酸鎂0.2g/L，檸檬酸鐵30mg/L，氯化鈣30mg/L，氯化錳5.0mg/L,硫酸鋅5.0mg/L,硫酸銅
0.5mg/L,甲醇 6g/L ；pH7.0。
[0033]從無錫及周邊地區(qū)共采集80多個(gè)土樣或水樣，并制成適當(dāng)濃度的稀釋液，直接涂布于K培養(yǎng)基篩選平板，30°C培養(yǎng)3-5天，分別挑取不同形態(tài)的單菌落接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的試管，30°C、200rpm震蕩培養(yǎng)3_5天，離心取發(fā)酵上清液。在96孔板中利用NBT — Gly化學(xué)法快速初篩，測定上清中PQQ含量。從250多個(gè)菌落中檢測到30株可以產(chǎn)生PQQ。
[0034]取初篩得到的菌株分別接種于裝有5mL發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中，30°C震蕩培養(yǎng)2天。然后轉(zhuǎn)接到裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶，30°C、200rpm發(fā)酵3_5天。如表1所示，用HPLC法精確測定發(fā)酵上清中PQQ的含量，其中編號為YHT-1的菌株產(chǎn)量最高，達(dá)30mg/L。
[0035]表1部分篩菌株的產(chǎn)PQQ情況
【權(quán)利要求】
1.一株Methylopilasp.YHT-1菌株，于2014年I月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCCNO:M2014016。
2.應(yīng)用權(quán)利要求1所述甲基營養(yǎng)菌發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將菌株活化后接種于種子培養(yǎng)基，在25~37°C、120~220rpm條件下震蕩培養(yǎng)10~30小時(shí)；然后將種子液按體積比1%~10%接種到含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶，250mL三角瓶裝50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度為25~37°C、轉(zhuǎn)速120~220rpm,發(fā)酵3-5天。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將菌株活化后接種于種子培養(yǎng)基，在25~370C>120~220rpm條件下震蕩培養(yǎng)10~30小時(shí)；然后將種子液按體積比1%~10%接種到含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝液量1/3~2/3 (v/v)，轉(zhuǎn)速300~500rpm，發(fā)酵溫度為25~37°C，發(fā)酵3-5天。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基組成為:無機(jī)氮源I~3g/L,硫酸鎂0.3~3g/L,磷酸二氫鉀1.4~4.2g/L,磷酸氫二鈉3~9g/L,酵母膏3~5g/L,甲醇 7 ~17g/L ;初始 ρΗ7.2 ~7.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述無機(jī)氮源是氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀或其組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:氮源I~5g/L,硫酸鎂0.3~2.4g/L,磷酸二氫鉀1.4~2.8g/L,磷酸氫二鈉3~6g/L,氯化猛5~10mg/L,葉酸 0.05 ~0.5mg/L,甲醇 7 ~50g/L ;初始 ρΗ6.5 ~7.2。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述氮源是氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、酵母膏、牛肉膏或其組合。
【文檔編號】C12P17/18GK103898011SQ201410087026
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】鄭璞, 姚紅濤 申請人:江南大學(xué)