纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法，屬于酶工程領域。纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法，包括如下步驟：將硅膠板用水浸泡、清洗后干燥；將纖維素酶溶液與沉淀劑混合均勻，將預處理的硅膠板置于混合液中使纖維素吸附到硅膠板上；再加入交聯(lián)劑交聯(lián)形成纖維素酶交聯(lián)晶體，并固定在硅膠板上。本發(fā)明把纖維素酶交聯(lián)晶體固定在硅膠板上，提高了纖維素酶的活性和穩(wěn)定性，不需要回收就能反復利用，大幅度提高了纖維素酶的利用效率。
【專利說明】纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發(fā)明屬于酶工程領域，具體涉及一種纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法。
【背景技術】
[0003]纖維素是地球上最豐富的可再生資源，地球上每年因光合作用產生的纖維素達到100億噸左右，利用纖維素生產生物能源，是緩解能源危機，實現(xiàn)人類可持續(xù)發(fā)展的關鍵。
[0004]纖維素利用的關鍵是把纖維素降解為可發(fā)酵性的糖類-葡萄糖。纖維素的降解需要外切酶、內切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。用纖維素酶降解纖維素具有綠色、條件溫和、轉化率高的特點，但是纖維素較高的酶解成本成為纖維素酶工業(yè)化降解纖維素的瓶頸。
[0005]降低纖維素酶成本一個有效的方法是提高酶的利用效率。提高纖維素酶利用效率的方法有獲得催化性能高的纖維素酶，提高纖維素酶的穩(wěn)定性，對催化的纖維素采用廉價地處理方法提高催化效果。通過固定技術來固定纖維素酶，讓纖維素酶反復利用，從而降低纖維素酶解的成本。
[0006]纖維素酶通過與固定介質形成共價鍵來固定，雖然固定的纖維素酶被固定的非常牢固，但是其酶活大幅度降低，有效酶活僅僅為固定前酶活的I~10%。吸附或包埋固定能減少酶活的損失。纖維素酶吸附或包埋固定的方法有海藻糖硫酸鈣固定，磁性海藻硫酸鈣固定等，這些固定方法都是把纖維素酶固定在微球上。已有的通過吸附或固定纖維酶的方法雖然能實現(xiàn)纖維素酶的反復利用，但是由于固定的載體是球體，球體內部的纖維素酶不能有效和纖維素接觸，從而大幅度降低了纖維素酶的催化活性。而且由于纖維素酶固定在微球上，還有另外一個不利的地方微球密度雖然與其反應溶液密度有差異，能自己沉淀，但是在實際降解纖維素時，由于大量的微球會吸附在纖維素碎片如稻草桿碎片表面，其一旦吸附，就不會沉淀下去，給纖維素酶的回收帶來很大困難。
[0007]把酶形成晶體，用微晶體進行催化能提高催化效率，增強酶的穩(wěn)定性。同樣微晶體的回收也需要離心等工藝，步驟繁瑣，而且回收的過程中微晶體有損失。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法。
[0009]本發(fā)明的目的 通過下述技術方案實現(xiàn):
一種纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法，包括如下步驟:將硅膠板用水清洗干凈，纖維素酶吸附后加入沉淀劑沉淀，加入交聯(lián)劑交聯(lián)，纖維素酶交聯(lián)晶體被固定在硅膠板上。
[0010]優(yōu)選的，所述的纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法，包括如下步驟:(1)硅膠板預處理:將硅膠板用水浸泡、清洗后干燥；
(2)纖維素的吸附:將纖維素酶溶液與沉淀劑混合均勻，將預處理的硅膠板置于混合液中使纖維素吸附到硅膠板上；
(3)纖維素酶交聯(lián)晶體的固定:再加入交聯(lián)劑交聯(lián)形成纖維素酶交聯(lián)晶體，并固定在硅膠板上。
[0011]步驟(2)中所述的沉淀劑優(yōu)選為乙腈。
[0012]步驟(3)中所述的交聯(lián)劑優(yōu)選為戊二醛。
[0013]更優(yōu)選的，步驟(1)硅膠板預處理為:將硅膠板在去離子水中浸泡4 h，然后用去離子水沖洗3次，在25 °C干燥24 h。
[0014]步驟(2)纖維素的吸附為:將纖維素酶溶解在的檸檬酸緩沖液中，再加入冷卻到4°〇的乙腈混合均勻，預處理的硅膠板置于混合液中搖晃5 min，然后靜止20 min。纖維素酶與檸檬酸緩沖液的質量體積比優(yōu)選為1:50 (g:mL)，檸檬酸緩沖液與乙腈的體積比優(yōu)選為1:2。
[0015]步驟(3)纖維素酶交聯(lián)晶體的固定為:加入戊二醛溶液，于搖床中350 r/m搖動12h0
[0016]一種固定有纖維素酶交聯(lián)晶體的硅膠板，通過上述方法得到。該硅膠板通過用去離子水沖洗后可重復利用；優(yōu)選的，用30 °C去離子水沖洗3次。
[0017]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下優(yōu)點和效果:
本發(fā)明把纖維素酶固定在硅膠板上，纖維素酶都固定在硅膠板的表面，這樣纖維素酶都能夠有效和纖維素接觸，從而有效減少纖維素酶活的損失。本發(fā)明把纖維素酶本身牢地固定在纖維素薄板上，避免了用微球固定纖維素酶及微晶體回收困難的不利因素。
[0018]本發(fā)明把纖維素酶交聯(lián)晶體固定在硅膠板上，提高了纖維素酶的活性和穩(wěn)定性，不需要回收就能反復利用，大幅度提高了纖維素酶的利用效率。
【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0020]實施例1
A硅膠板預處理
薄層層析硅膠板(薄層層析硅膠板G，上海研拓生物科技有限公司)在去離子水中浸泡4h，然后用去離子水沖洗3次，在25 °C干燥24 h。薄層層析硅膠板G被切割成10 cmXIOOcm的板子。把薄層層析硅膠板G放置于10 cmX 40 cmX 10 cm玻璃箱。把硅膠板放入到玻璃箱內，硅膠板緊貼底部的玻璃板。
[0021]B纖維素的吸附
1g纖維素酶(Sigma購買)溶解在50 mL的檸檬酸緩沖液(pH 5.0，0.1M)中，再加入100 mL冷卻到4 1:的乙腈混合均勻，把混合液體倒入到玻璃箱內。端起玻璃箱的底部，輕輕搖晃5 min,然后靜止20 min。
[0022]C纖維素酶交聯(lián)晶體的固定
質量分數(shù)為50%的戊二醛溶液9.2 mL加入到靜止的溶液中，玻璃箱放置在搖床中，350r/m搖動12 h。此時纖維素酶分子之間相互交聯(lián)，形成交聯(lián)晶體，并被固定在硅膠薄板上。[0023]D纖維素酶酶活性測定
以羥甲基纖維素為底物，在50 1:進行酶降解反應。在250 mL燒杯中含有20 g/L的羥甲基纖維素檸檬酸緩沖液(pH 5.0,0.1 M)100 mL，加入游離的纖維素酶或固定的纖維素酶交聯(lián)晶體(切取lcmX4cmXlcm固定維素酶的硅膠條)，在水浴鍋中50 °C保溫30 min。還原糖采用DNS法測定。酶活定義為:每分鐘釋放出I Mfflol還原糖所需要的酶量。
[0024]測定的固定酶的酶活與游離酶的酶活比值為1.1:1，表明固定的纖維素酶具有更高的催化活性。
[0025]E游離的纖維素酶和固定的纖維素酶晶體穩(wěn)定性的測定
游離的纖維素酶或固定的纖維素酶交聯(lián)晶體(切取lCmX4CmXlCm固定纖維素酶的硅膠條)在70 °C保溫3 min，測定剩余的酶活性。以剩余的酶活性與初始酶活性的比值為度量酶穩(wěn)定性的標準。鑒定結果如下表1，說明固定在硅膠板上的纖維素酶具有更好的穩(wěn)定性。
[0026]表1.酶穩(wěn)定性的測定 _
【權利要求】
1.一種纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法，其特征在于包括如下步驟:將硅膠板用水清洗干凈，纖維素酶吸附后加入沉淀劑沉淀，加入交聯(lián)劑交聯(lián)，纖維素酶交聯(lián)晶體被固定在硅膠板上。
2.根據權利要求1所述的纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法，其特征在于包括如下步驟: (1)硅膠板預處理:將硅膠板用水浸泡、清洗后干燥； (2)纖維素的吸附:將纖維素酶溶液與沉淀劑混合均勻，將預處理的硅膠板置于混合液中使纖維素吸附到硅膠板上； (3)纖維素酶交聯(lián)晶體的固定:再加入交聯(lián)劑交聯(lián)形成纖維素酶交聯(lián)晶體，并固定在硅膠板上。
3.根據權利要求2所述的纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法，其特征在于:步驟(2)中所述的沉淀劑為乙腈。
4.根據權利要求2所述的纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法，其特征在于:步驟(3)中所述的交聯(lián)劑為戊二醛。
5.根據權利要求2所述的纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法，其特征在于:步驟(I)硅膠板預處理為:將硅膠板在去離子水中浸泡4 h，然后用去離子水沖洗3次，在25°C干燥24 h。
6.根據權利要求2所述的纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法，其特征在于:步驟(2)纖維素的吸附為:將纖維素酶溶解在的檸檬酸緩沖液中，再加入冷卻到4 °C的乙腈混合均勻，預處理的硅膠板置 于混合液中搖晃5 min,然后靜止20 min。
7.根據權利要求6所述的纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法，其特征在于:纖維素酶與檸檬酸緩沖液的質量體積比為1:50，檸檬酸緩沖液與乙腈的體積比為1:2。
8.根據權利要求2所述的纖維素酶交聯(lián)晶體在硅膠板上的固定方法，其特征在于:步驟(3)纖維素酶交聯(lián)晶體的固定為:加入戊二醛溶液，于搖床中350 r/m搖動12 h。
9.一種固定有纖維素酶交聯(lián)晶體的硅膠板，通過權利要求1-8任一項所述的方法得到。
10.根據權利要求9所述的固定有纖維素酶交聯(lián)晶體的硅膠板，其特征在于:所述的硅膠板通過用去離子水沖洗后可重復利用。
【文檔編號】C12N11/04GK103805589SQ201410071081
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月28日 優(yōu)先權日:2014年2月28日
【發(fā)明者】薛棟升, 汪江波, 彭春龍, 周敏 申請人:湖北工業(yè)大學