人胸腺肽β4三倍體蛋白、編碼基因及其分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及人胸腺肽β4三倍體蛋白、編碼基因及其分離純化方法。所涉及的人胸腺肽β4三倍體蛋白的氨基酸序列如SED?ID?NO：1所示；所涉及的編碼基因序列如SED?ID?NO：2所示；所涉及的分離純化方法是采用親和層析柱進行分離純化。本發(fā)明的重組人胸腺肽β4串聯(lián)三倍體經(jīng)玫瑰花環(huán)實驗檢測，能夠明顯提高T-淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)性能；小鼠皮毛生長實驗表明重組人胸腺肽β4串聯(lián)三倍體可以明顯促進脫毛劑處理小鼠皮毛處的生長。
【專利說明】人胸腺肽β 4三倍體蛋白、編碼基因及其分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)研究領(lǐng)域，具體涉及一種利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組人胸腺肽β4串聯(lián)三倍體的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胸腺是人體免疫系統(tǒng)中重要的免疫器官，能夠分泌數(shù)十種胸腺素(thymosins)以調(diào)節(jié)機體的免疫功能，因其最早從小牛胸腺中提取而得名。
[0003]人類已經(jīng)認(rèn)知的數(shù)十種胸腺素因等電點不同而被區(qū)別為胸腺素α、β、Y三大類，每一類包含多種亞型。β族胸腺素(thymosin-β )是等電點在pI5.0-7.0之間的一組胸腺素，大小為40-44個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量約5kD，序列結(jié)構(gòu)高度保守。不同物種中發(fā)現(xiàn)的β族胸腺素有十多種，人體中主要是thymosin-β 4、thymosin_ β 10和thymosin-β 15,在維持肌動蛋白的動態(tài)平衡以及腫瘤發(fā)病與轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、血管生成和創(chuàng)傷愈合等很多生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。
[0004]胸腺素類制劑己成為各界十分關(guān)注的免疫增強劑。臨床上應(yīng)用的胸腺素類制劑均是由牛或豬胸腺中提取的多肽類分子混合物，有較穩(wěn)定的免疫話性，臨床上適用于免疫缺陷病或免疫機能失調(diào)所引起的一系列疾病，如胸腺發(fā)育不全、重癥混合性免疫缺乏癥、運動失調(diào)性毛細(xì)血管擴張癥、麻風(fēng)、重癥感染、復(fù)發(fā)性口瘡等伴有細(xì)胞免疫功能低下的患者。亦可用于病毒性肝炎、惡性腫瘤和抗衰老。
[0005]盡管從動物組織中提取制備的胸腺素類制劑具有比較穩(wěn)定的臨床療效，但是也存在潛在病原物污染的風(fēng)險。而且，由于提取產(chǎn)物是多種肽類分子的混合物，其作用效果在不同批次間存在差異，也可能是導(dǎo)致現(xiàn)行胸腺肽制劑常見不良反應(yīng)如發(fā)熱、少數(shù)病人出現(xiàn)蕁麻疹、皮疹、頭昏等的內(nèi)在·原因。
[0006]天然的人胸腺肽β 4，只有44個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量偏小，只有5kD左右。現(xiàn)有技術(shù)雖然有采用基因工程技術(shù)對其進行生產(chǎn)，但是表達量和在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性一直未能很好地解決。因此，在技術(shù)上通常選擇將其與其他蛋白融合表達，初步純化后，再利用蛋白質(zhì)水解酶從融合蛋白上將其切出。增加了分離純化的工藝步驟與成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷或不足，本發(fā)明的目的之一為提供一種人胸腺肽β 4三倍體蛋白。
[0008]為此，本發(fā)明提供的人胸腺肽β 4三倍體蛋白的氨基酸序列如SED ID NO:1所示。
[0009]針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷或不足，本發(fā)明的目的之二為提供一種人胸腺肽β 4三倍體的編碼基因。
[0010]為此，本發(fā)明提供的人胸腺肽β 4三倍體的編碼基因的序列如SED ID NO:2所示。
[0011]針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷或不足，本發(fā)明的目的之三為提供一種人胸腺肽β 4三倍體蛋白的分離純化方法。[0012]為此，本發(fā)明提供的分離純化方法包括:采用親和層析柱進行分離純化。
[0013]優(yōu)選的，所述分離純化方法包括:
[0014]第一步，粗純化:將誘導(dǎo)表達人胸腺肽β 4三倍體蛋白菌體用水或PBS重懸，煮沸后離心收集上清液；
[0015]第二步，利用親和層析柱對上清液進行純化分離，所用柱材料是特異性結(jié)合親和標(biāo)簽的柱材料。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0017](I)本發(fā)明的人胸腺肽β 4三倍體蛋白結(jié)構(gòu)為單一多肽鏈結(jié)構(gòu)，包含3拷貝長44個氨基酸殘基的人源胸腺肽氨基酸序列，對應(yīng)的編碼基因即核酸序列長度是該多肽鏈氨基酸殘基數(shù)目的3倍，即474bp長的核酸序列。其相對分子質(zhì)量從單倍體所具有的5kD增加至15kD左右，比現(xiàn)有的單倍體人胸腺肽β 4更加容易分離純化，提高分離純化的收率。
[0018](2)本發(fā)明的人胸腺肽β4三倍體蛋白的氨基酸序列包括按照5' —3'方向串聯(lián)重組的三拷貝人胸腺肽β4序列和利于每個拷貝重組人胸腺肽β4正確折疊的柔性接頭氨基酸序列，即GGGSGGGS。利用該柔性接頭序列由小側(cè)鏈的甘氨酸和絲氨酸構(gòu)成，在多肽鏈折疊過程中傾向于形成β折疊或不規(guī)則卷曲，有利于其兩翼的目的蛋白進行各自的天然折疊過程，傾向于形成接近天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子。也就是有利于形成有活性的重組蛋白。
[0019](3)本發(fā)明的人胸腺肽β 4三倍體蛋白的氨基酸序列所包含的每個拷貝的人胸腺肽β 4的氨基酸序列與天然的人胸腺肽β 4的氨基酸序列完全一致。
[0020](4)本發(fā)明的重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體具有部分天然人源胸腺肽β 4的活性。動物實驗表明，該串聯(lián)三倍體重組人胸腺肽能夠促進實驗鼠毛發(fā)再生，顯示天然人胸腺肽免疫活性。
[0021](5)本發(fā)明的純化方法經(jīng)親和層析、精制、冷凍干燥獲得目的蛋白純品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為實施例1中重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體表達載體的酶切檢測，其中1-4號泳道分別為:1、2、3、4號重組表達載體DNA的NcoI與XhoI雙酶切產(chǎn)物；5_8號泳道分別為:1、2、3、4號重組表達載體DNA ；9號泳道為:原核表達載體pET22b DNA ；10號泳道為:125bpDNA Ladder ；
[0023]圖2為實施例2重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體在工程菌中的表達效果，其中泳道I為Marker、泳道2為誘導(dǎo)前樣品、泳道3為誘導(dǎo)lh、泳道4為誘導(dǎo)2h、泳道5為誘導(dǎo)3h、泳道6為誘導(dǎo)4h、泳道7為誘導(dǎo)5h、泳道8為誘導(dǎo)6h ；
[0024]圖3為實施例2重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體在工程菌中的表達結(jié)果的westernblotting鑒定，其中泳道1-6泳道分別為:重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體樣品，泳道7為空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞裂解液，泳道8為Marker ；
[0025]圖4為實施例2重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體分離純化結(jié)果，M泳道為Marker、A泳道為未純化樣品、B泳道為粗純化樣品、C、D、E泳道分別為His-tag親和層析后依次濃縮的純化結(jié)果；
[0026]圖5為實施例2純化的重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍紫外吸收圖；[0027]圖6為實施例2的玫瑰花環(huán)實驗檢測重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體免疫學(xué)活性；
[0028]圖7為實施例2的重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體處理2周對實驗鼠毛發(fā)生長的促進作用；
[0029]圖8為實施例2的HE染色檢測重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體處理2周對實驗鼠毛囊細(xì)胞的作用。
【具體實施方式】
[0030]本發(fā)明考慮將人胸腺肽β 4編碼基因串聯(lián)排列在一起，每個重復(fù)單位之間利用寡聚柔性接頭(GGGSGGGS)的編碼基因相隔。依據(jù)蛋白質(zhì)折疊研究的相關(guān)數(shù)據(jù)，柔性接頭富含甘氨酸和絲氨酸，這兩種氨基酸殘基在多肽鏈中交替出現(xiàn)，往往會形成β折疊結(jié)構(gòu)。有利于其兩翼的氨基酸序列在一級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上折疊產(chǎn)生具有活性的高級結(jié)構(gòu)。根據(jù)這一認(rèn)知，發(fā)明人設(shè)計了密碼子經(jīng)過優(yōu)化的人胸腺肽β 4基因序列、構(gòu)建其原核表達載體及其表達工程菌。已有的實驗結(jié)果表明，人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍重組蛋白可以在大腸桿菌中過表達，表達工藝簡單；分離純化方法相對簡單；表達的串聯(lián)三倍體具有相應(yīng)生物學(xué)活性。
[0031]本發(fā)明的人胸腺肽β 4三倍體蛋白的生產(chǎn)方法包括:
[0032](I)用于表達、生產(chǎn)重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體的工程菌的構(gòu)建；構(gòu)建過程中引入相應(yīng)的親和標(biāo)簽，以利于后續(xù)分離純化；現(xiàn)有的親和標(biāo)簽均用于本發(fā)明，例如:鎳柱親和性組氨酸標(biāo)簽、硫氧還蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白等；
[0033](2)工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)；
[0034](3)重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體的誘導(dǎo)與表達；
[0035](4)重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體`的分離純化，經(jīng)粗純后，利用親和層析柱作進一步分離純化:`
[0036]第一步，粗純化:將誘導(dǎo)表達后收取的菌體用1.5倍水或PBS (質(zhì)量比)徹底重懸，煮沸后用以富集重組胸腺肽串聯(lián)三倍體，離心收集上清液；
[0037]第二步，利用親和層析柱對上清液進行純化分離:所用柱材料是特異性結(jié)合上述親和標(biāo)簽的主材料。用磷酸緩沖液作為洗脫液，從親和柱材料上洗脫目的蛋白，經(jīng)過脫鹽、低溫濃縮、冷凍干燥后制備成目的蛋白制劑。
[0038]其中工程菌構(gòu)建方法包括:
[0039](I)人工合成密碼子優(yōu)化的重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體的編碼基因序列，利用基因重組技術(shù)在核酸限制性內(nèi)切酶和核酸連接酶次序作用下將其克隆在指定克隆載體中。
[0040](2)在核酸限制性內(nèi)切酶和核酸連接酶次序作用下將包含3拷貝重組人胸腺肽β4串聯(lián)三倍體的編碼基因序列從克隆載體中切出并與表達載體連接重組；
[0041](3)用于重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體表達生產(chǎn)的表達載體可以是任何一種適合于在原核細(xì)胞中高效表達外源基因的表達載體。
[0042](4)將重組的攜載重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體的載體DNA導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞。
[0043](5)導(dǎo)入重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
[0044]以下通過發(fā)明人給出的實施例對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)說明。
[0045]以下實施例中所用材料和試劑為:
[0046]包含3個拷貝人胸腺肽β 4的基因序列:委托大連寶生物生物工程有限公司合成；
[0047]pUC18:大連寶生物生物工程有限公司提供；
[0048]大腸桿菌:E.coli ToplO用于載體構(gòu)建，BL21 (DE3)用于基因表達；
[0049]重組有目的基因載體的E.coli大腸桿菌:BL21 (DE3)；
[0050]質(zhì)粒提取試劑盒:購自北京舟鼎國生物技術(shù)有限公司；
[0051]凝膠回收試劑盒:購自北京舟鼎國生物技術(shù)有限公司；
[0052]宿主細(xì)胞:BL21(DE3)；
[0053]親和層析柱:Ni柱；
[0054]磷酸緩沖液:氯化鈉Sg、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉1.42g、磷酸二氫鉀0.27溶解于I升去離子水中；
[0055]含質(zhì)量百分比為1.7%咪唑的磷酸緩沖液。
[0056]實施例1
[0057]該實施例為重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體的工程菌的構(gòu)建。
[0058](I)委托大連寶生物生物工程有限公司合成包含3個拷貝人胸腺肽β 4的基因序列，將合成的序列定向克隆在克隆 載體PUC18中并提供重組該載體的Ε.coli菌體細(xì)胞(JM109)；
[0059](2)質(zhì)粒制備:將公司提供的重組有目的基因載體的Ε.coli菌體細(xì)胞于37°C、200rpm/min培養(yǎng)12_16h,于12000rpm/min離心30~60s收集菌體，采用市售質(zhì)粒提取試劑盒制備高純度質(zhì)粒DNA，將DNA濃度調(diào)整至I μ g/ μ L ;
[0060](3)核酸限制性內(nèi)切酶消化:在50 μ L反應(yīng)體系中，加入5μ L核酸限制性內(nèi)切酶(NcoI與XhoI各2.5 μ L)、5 μ LlOX核酸限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液、40 μ L上一步驟制備的高純度質(zhì)粒DNA，于37°C水浴中作用3h，酶切反應(yīng)液在1%瓊脂糖凝膠、80V電壓下電泳lh，在紫外燈下從凝膠中切出基因片段，利用市售凝膠回收試劑盒回收基因片段。
[0061](4)線性化的表達載體片段的制備:將攜載表達載體pET22b質(zhì)粒的E.coli菌體細(xì)胞于37°C、200rpm/min培養(yǎng)12_16h，于12000rpm/min離心30~60s收集菌體，采用市售質(zhì)粒提取試劑盒制備高純度質(zhì)粒DNA，將DNA濃度調(diào)整至I μ g/ μ L ;在50 μ L反應(yīng)體系中，加入5yL核酸限制性內(nèi)切酶(NcoI與XhoI各2.5μυ、5μL IOX核酸限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液、40 μ L高純度pET22b質(zhì)粒DNA，于37°C水浴中作用3h，酶切反應(yīng)液在1%瓊脂糖凝膠、80V電壓下電泳lh，在紫外燈下從凝膠中切出線性化載體片段，利用市售凝膠回收試劑盒回收基因片段。
[0062](5)重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體的編碼基因片段與表達載體的線性化片段連接重組:將上述步驟3回收的串聯(lián)三倍體人胸腺肽β 4的編碼基因片段與表達載體線性化片段按照摩爾數(shù)比6:4的比例添加到含有5 μ L 了40嫩連接酶、5 4 1^ 10XT4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液的50 μ L反應(yīng)體系中，吹吸混勻后分裝成10 μ L/250 μ L PCR管，于16°C連接重組16h。
[0063](6)大腸桿菌細(xì)胞的制備:將冷凍保存的大腸桿菌表達菌BL21 (DE3)接種至不含抗生素的LB平板上培養(yǎng)過夜，挑取單克隆轉(zhuǎn)接至新鮮不含抗生素的LB平板上，挑取單克隆接種于5mL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中于37°C、200rpm/min搖床培養(yǎng)過夜，過夜培養(yǎng)物以10%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、280rpm/min搖床培養(yǎng)至0D_達到0.8左右，于8000rpm/min、4°C離心收集菌體,將菌體重懸于冰冷的0.lmol/LCaCl2溶液中處理15min以上,置冰上待用。所有操作為無菌操作。
[0064](7)大腸桿菌克隆細(xì)胞的轉(zhuǎn)化:將上述步驟5所述的連接重組產(chǎn)物添加至步驟6制備的大腸桿菌表達細(xì)胞懸浮液中，冰置15min以上，于42°C處理90s，冰上冷卻2min。添加700 μ L不含抗生素的預(yù)先加熱到37°C的LB液體培養(yǎng)基，于37°C、200rpm/min搖床培養(yǎng)40min,離心收集菌體并重懸于100 μ L LB液體培養(yǎng)基中，涂布于添加有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)皿中，于37°C培養(yǎng)12~16h。
[0065](8)篩選重組質(zhì)粒:重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體原核表達載體的酶切檢測，從上述步驟7得到的LB固體培養(yǎng)基上挑取單克隆，接種至IOmL添加有的50~100 μ g/mL抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，按照上述步驟2方法制備質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI消化和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切產(chǎn)物中出現(xiàn)載體條帶和474bp目的基因條帶的即攜載有重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體編碼基因的表達載體，其來源克隆即為攜載重組人胸腺肽β4串聯(lián)三倍體基因的工程菌。附圖1所示即為包含重組人胸腺肽β 4串聯(lián)三倍體編碼基因的表達載體的酶切檢測結(jié)果。其中從左至右的前4個泳道是1、2、3、4號隨機挑取的步驟7轉(zhuǎn)化克隆中提取的質(zhì)粒的NcoI和XhoI雙酶切檢測結(jié)果，第5-8個泳道分別是與1、2、3、4號酶切產(chǎn)物相對應(yīng)的質(zhì)粒DNA樣品。第9泳道是未酶切的空載體pET22b質(zhì)粒DNA樣品。酶切圖譜顯示，隨機挑取的4個克隆來源的質(zhì)粒DNA都是由目的基因與載體構(gòu)成的重組質(zhì)粒，經(jīng)過NcoI與XhoI雙酶切后，都有載體條帶和接近500bpMarker條帶的474bp目的基因條帶產(chǎn)生。
[0066](9)DNA序列測定:委托大連寶生物生物工程有限公司用全自動DNA序列測定儀分析。
[0067]對步驟8酶切檢測后的重組質(zhì)粒進行DNA序列測定檢測，序列測定結(jié)果與設(shè)計合成的序列完全一致。如果需要列出測序結(jié)果，就是文檔前面補充的核酸序列。
[0068]測序結(jié)果:
[0069]
【權(quán)利要求】
1.人胸腺肽β4三倍體蛋白，其特征在于，該蛋白的氨基酸序列如SED ID Ν0:1所示。
2.人胸腺肽β4三倍體的編碼基因，其特征在于，該編碼基因的序列如SED ID Ν0:2所
3.人胸腺肽β4三倍體蛋白的分離純化方法，其特征在于，該方法包括:采用親和層析柱進行分離純化。
4.如權(quán)利要求3所述的人胸腺肽β4三倍體蛋白的分離純化方法，其特征在于，所述分離純化方法包括: 第一步，粗純化:將誘導(dǎo)表達人胸腺肽β 4三倍體蛋白菌體用水或PBS重懸，煮沸后離心收集上清液； 第二步，利用親和層析柱對上清液進行純化分離，所用柱材料是特異性結(jié)合親和標(biāo)簽的柱材料。
【文檔編號】C12N15/16GK103864916SQ201410054593
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年2月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月18日
【發(fā)明者】陳凱, 季佳菲, 李紅民, 陳富林, 王陽陽, 崔繼紅 申請人:西北大學(xué)