一種使用自殺性載體去除大腸桿菌Nissle菌內(nèi)隱秘質(zhì)粒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用自殺性載體去除大腸桿菌Nissle菌內(nèi)隱秘質(zhì)粒的方法，該方法是將自殺性載體與待去除的隱秘質(zhì)粒構(gòu)建成重組自殺質(zhì)粒，所述自殺性載體具有抗性篩選標(biāo)記和自殺載體特性；用構(gòu)建的重組自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Nissle，通過抗性篩選得到僅攜帶重組自殺質(zhì)粒的大腸桿菌Nissle；再利用自殺性載體的自殺特性篩選出丟失重組自殺質(zhì)粒的大腸桿菌Nissle，從而獲得去除了隱秘質(zhì)粒的大腸桿菌Nissle。本發(fā)明不存在常規(guī)使用的化學(xué)、物理方法對宿主菌造成的不良影響。本方法不會對宿主菌的基因組造成影響，亦不會影響宿主菌已知的生物學(xué)特性。
【專利說明】一種使用自殺性載體去除大腸桿菌N i SS I e菌內(nèi)隱秘質(zhì)粒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及到宿主菌攜帶的隱秘質(zhì)粒的消除。利用重組自殺質(zhì)粒具有競爭性抑制細菌內(nèi)隱秘質(zhì)粒復(fù)制、重組自殺質(zhì)粒自身去除簡便以及不影響宿主菌基因組和自身生物學(xué)特性性狀的特點，實現(xiàn)宿主菌原有隱秘質(zhì)粒完全去除的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002]質(zhì)粒的主要類型有致育因子(fertility factor, F因子)、抗性因子(resistancefactor, R 因子)、產(chǎn)細菌素的質(zhì)粒(bacteriocin producing plasmid)、毒力質(zhì)粒(virulence plasmid)、代謝性質(zhì)粒(metabolic plasmid)、隱秘質(zhì)粒(cryptic plasmid)等。隱秘質(zhì)粒不顯示任何表型效應(yīng)，他們的存在只有通過物理學(xué)方法才能發(fā)現(xiàn)，例如凝膠電泳檢測細胞提取液等方法。它們存在的生物學(xué)意義，目前幾乎不了解。在應(yīng)用上，很多隱秘質(zhì)粒被加以改造作為基因工程的載體。
[0003]常見的質(zhì)粒去除技術(shù)包括使用化學(xué)方法、物理方法及分子生物學(xué)方法。化學(xué)方法可以用一定濃度的表面活性劑SDS、嵌合染料、抗生素或中藥等處理。物理方法有逐級高溫法、紫外線照射、電穿孔、原生質(zhì)體形成與再生等?；瘜W(xué)和物理方法或多或少存在質(zhì)粒去除不理想的情況，且對宿主菌生物學(xué)形狀產(chǎn)生較大影響。
[0004]分子生物學(xué)方法包括使用轉(zhuǎn)座子消除質(zhì)粒和利用質(zhì)粒不相容性消除質(zhì)粒等方法。分子生物學(xué)方法在消除質(zhì)粒上具有一定的優(yōu)勢，但也都存在著自身的局限性。本方法屬于利用質(zhì)粒不相容性消除質(zhì)粒的衍生技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本文申請的技術(shù)建立在質(zhì)粒不相容性的基礎(chǔ)上，待去除質(zhì)粒背景相對清晰作為前提條件，引入自殺性載體作為輔助工具，使用分子生物學(xué)方法構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒，再利用重組自殺質(zhì)粒去除菌內(nèi)原有質(zhì)粒并實施自殺質(zhì)粒自身消除的特性，確保原有宿主菌內(nèi)質(zhì)粒完全去除。
[0006]本發(fā)明一種使用自殺性載體去除大腸桿菌Nissle菌內(nèi)隱秘質(zhì)粒的方法，其步驟如下:將自殺性載體與待去除的隱秘質(zhì)粒構(gòu)建成重組自殺質(zhì)粒，所述自殺性載體具有抗性篩選標(biāo)記和自殺載體特性；用構(gòu)建的重組自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌(大腸桿菌Nissle)，通過抗性篩選得到僅攜帶重組自殺質(zhì)粒的宿主菌；再利用自殺性載體的自殺特性篩選出丟失重組自殺質(zhì)粒的宿主菌，從而獲得去除了隱秘質(zhì)粒的大腸桿菌Nissle。
[0007]作為一個實例，所述大腸桿菌Nissle是大腸桿菌Nisslel917,大腸桿菌Nisslel917中含有pMUTl、pMUT2兩個隱秘質(zhì)粒，所述自殺性載體實驗室常規(guī)使用的，沒有任何特殊要求，如本申請中提及使用的是PRE112。
[0008]常規(guī)細菌培養(yǎng)使用LB液體培養(yǎng)基配方如下:胰蛋白胨10g，酵母浸提物5g，NaCllOg，加蒸餾水定容至1L，使用lOmol/L NaOH調(diào)pH至7.2，121°C滅菌20min備用。LB固體培養(yǎng)基:在每IL LB液體培養(yǎng)基中加入17.5g瓊脂粉，1211:滅菌201^11，冷至651:混勻
后傾注干烤滅菌二重皿。
[0009]按照每30mg加入ImL無水乙醇的比例溶解氯霉素(Cm)粉末,配制30mg/mL Cm母液。使用時按照1:1000的比例加入滅菌LB培養(yǎng)基內(nèi)混勻，制備LB (30 μ g/mL)培養(yǎng)基。
[0010]50g蔗糖加蒸餾水定容至IOOmL,溶解后使用Φ =0.22 μ m的滅菌濾器過濾除菌，配制50%蔗糖母液。用滅菌LB或LB (no salt)稀釋至10%使用。
[0011]重組自殺性質(zhì)粒構(gòu)建時使用DH5 α化學(xué)感受態(tài)使用0.05Μ CaCl2溶液用常規(guī)方法制備。宿主菌需使用10%甘油制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。
[0012]本技術(shù)存在以下優(yōu)勢和特點:
[0013]1、去除原有質(zhì)粒，不引入新的外源質(zhì)粒。2、雖然需要待去除質(zhì)粒背景以及構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒，但極大地擴展了應(yīng)用的范圍，不再局限于需要準(zhǔn)備一整套具有不同復(fù)制原點質(zhì)粒的要求，同時可以彌補一些沒有相同復(fù)制原點質(zhì)粒的不足。3、擁有不同的自殺性載體，在較多情況下可靈活選用更簡便的方法(例如相同限制性內(nèi)切酶位點的選用)構(gòu)建出重組自殺質(zhì)粒。4、重組自殺質(zhì)粒攜帶宿主菌質(zhì)粒自身復(fù)制原點,確保質(zhì)粒去除成功。5、重組自殺質(zhì)?？蛇x用不同的抗性篩選標(biāo)記，適應(yīng)范圍更廣。6、不存在常規(guī)使用的化學(xué)、物理方法對宿主菌造成的不良影響。本方法不會對宿主菌的基因組造成影響，亦不會影響宿主菌已知的生物學(xué)特性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為兩個重組自殺質(zhì)粒載體pMUTl-pRE112和pMUT2-pRE112的構(gòu)建示意圖，使用載體pRE112和質(zhì)粒pMU·Tl和pMUT2各自存在的唯一限制性內(nèi)切酶SphI的單酶切位點構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒載體pMUTl-pRE112和pMUT2_pRE112。
[0015]圖2為Nisslel917隱秘質(zhì)粒pMUTl去除的瓊脂糖電泳圖
[0016]Μ: λ -Hind III DNA Marker, 1:Nissle 菌中 pMUTl 和 pMUT2 質(zhì)粒，2:攜帶重組質(zhì)粒 pMUTl-pRE112Nissle 菌(Nisslel917/pMUTl_pRE112)中 pMUTl, pMUT2 質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pMUTl-pRE112，3:重組質(zhì)粒pMUTl_pRE112，4:去除pMUTl質(zhì)粒但攜帶重組質(zhì)粒pMUTl-pRE112Nissle 菌(Nisslel917 ApMUTl/pMUTl_pRE112)中 pMUT2 質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pMUTl-pRE112, 5:已去除重組質(zhì)粒 pMUTl_pRE112Nissle 菌(Nisslel917 Λ pMUTl)中 pMUT2質(zhì)粒
[0017]圖3為Nisslel917隱秘質(zhì)粒pMUT2去除的瓊脂糖電泳圖
[0018]Μ: λ -Hind III DNA Marker, 1:攜帶重組質(zhì)粒 pMUT2_pRE112 的 Nisslel917(Nisslel917ApMUTl/pMUT2-pRE112)菌中 pMUT2 質(zhì)粒 and pMUT2_pRE112 重組質(zhì)粒，在含30 μ g/mL氯霉素的LB液體第一代培養(yǎng)物，2:攜帶重組質(zhì)粒pMUT2_pREl 12的Nisslel917 (Nisslel917 ΔpMUTl/pMUT2-pRE112)菌中 pMUT2 質(zhì)粒 and pMUT2_pRE112 重組質(zhì)粒，在含30 μ g/mL氯霉素的LB液體第二代培養(yǎng)物，3:去除pMUT2質(zhì)粒但攜帶重組質(zhì)粒 pMUT2-pRE112 的 Nisslel917 菌(Nisslel917ApMUTlApMUT2/pMUT2_pRE112)菌中pMUT2-pRE112重組質(zhì)粒，在含30 μ g/mL氯霉素的LB液體第三代培養(yǎng)物，4:攜帶重組質(zhì)粒 pMUT2-pRE112 的 Nisslel917 菌(Nisslel917 Λ pMUTl Λ pMUT2/pMUT2_pRE112)中pMUT2-pRE112重組質(zhì)粒，在含10%蔗糖的LB液體培養(yǎng)基，5 = Nissle菌中pMUTl和pMUT2質(zhì)粒，6:pMUT2-pRE112重組質(zhì)粒
[0019]圖4為驗證Nisslel917兩個隱秘質(zhì)粒pMUTl和pMUT2去除的瓊脂糖電泳圖，M:Trans2K Plus II DNAMarker,泳道 1:完全去除兩個隱秘質(zhì)粒 pMUTl 和 pMUT2 的 Nissle(Nisslel917ApMUTl ApMUT2)，泳道 2:Nissle 菌中 pMUTl 和 pMUT2 兩個隱秘質(zhì)粒。
【具體實施方式】
[0020]著名益生菌大腸桿菌Nisslel917 (德國微生物收藏中心,位于Mascheroder Wegib, D-38124, Braunscheig, Germany。登錄號為 DMS6601,)中含有 pMUTl、pMUT2 兩個隱秘質(zhì)粒(見美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI的DNA序列數(shù)據(jù)庫登錄號，分別為A84793.1和A95448.1 )，且2個質(zhì)粒在Nisslel917傳代中很穩(wěn)定，不易丟失。為減少上述隱秘質(zhì)粒對于外源性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和基因組DNA操作不便，同時考慮Nisslel917作為載體菌時其隱秘質(zhì)粒對人和宿主動物可能產(chǎn)生的不良影響。使用限制性內(nèi)切酶Sph I將攜帶sacB的自殺性質(zhì)粒載體 pRE112(美國賓夕法尼亞大學(xué) Dr.Schifferli 提供,Department of Pathobiology,School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania,3800Spruce Street,Philadelphia, PA19104-6049, USA, Phone: (215)898-1695, EMail:dmschiffivet.upenn.edu)和隱秘質(zhì)粒pMUTl、pMUT2進行重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒載體pMUTl_pRE112 (簡稱plll2)和pMUT2-pRE112 (簡稱p2112)。應(yīng)用競爭性抑制分別去除Nisslel917自身攜帶的隱秘質(zhì)粒，基于自殺性質(zhì)粒攜帶sacB基因，在含10%蔗糖的培養(yǎng)基平板上去除攜帶sacB的重組質(zhì)粒，最后獲得沒有任何隱秘 質(zhì)粒的Nisslel917大腸桿菌即Nisslel917 Λ pMUTl Λ pMUT2。
[0021]1.重組質(zhì)粒載體 pMUTl-pRE112 和 pMUT2_pRE112 的構(gòu)建
[0022]1.lNisslel917中2個隱秘質(zhì)粒的提取
[0023]從LB平板上挑取大腸桿菌Nisslel917單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床震蕩(150r/m)培養(yǎng)16-18小時，使用堿裂解法抽提質(zhì)粒。使用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳，切膠回收PMUTl和pMUT2質(zhì)粒DNA。使用限制性內(nèi)切酶Sph I消化pMUTl、pMUT2質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察和切膠回收質(zhì)粒DNA后，分別將上述pMUTl和pMUT2質(zhì)粒DNA單酶切片段去磷酸化。
[0024]1.2提取pRE112自殺性質(zhì)粒DNA，同樣使用Sph I酶切消化和切膠回收質(zhì)粒DNA。
[0025]1.3使用T4DNA Ligase將去磷酸化pMUTl和pMUT2載體DNA分別與pRE112單酶切回收的線性質(zhì)粒DNA片段連接。
[0026]1.4制備大腸桿菌DH5 α化學(xué)感受態(tài)，將連接體系轉(zhuǎn)化后，加入ImL無抗性SOB培養(yǎng)基，37°C搖床震蕩培養(yǎng)45分鐘，涂布含氯霉素LB平板(30 μ g/mL)培養(yǎng)過夜。
[0027]1.5篩選陽性克隆，挑取單菌落接種液體LB (Cm, 30 μ g/mL), 37°C搖床培養(yǎng)16-18小時，提取質(zhì)粒，使用Sph I酶切消化、電泳鑒定正確的重組質(zhì)粒載體，分別切膠回收獲取pMUTl-pRE112和pMUT2_pRE112重組質(zhì)粒DNA。2個重組自殺質(zhì)粒載體pMUTl_pRE112和pMUT2-pRE112的構(gòu)建參見附圖1。
[0028]2.Nisslel917 隱秘質(zhì)粒 pMUTl 的去除
[0029]2.1制備Nisslel917大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，使用pMUTl_pRE112重組質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化該感受態(tài)細胞，加入ImL無抗性SOB培養(yǎng)基，37°C搖床震蕩培養(yǎng)45分鐘，涂布含氯霉素LB平板(30 μ g/mL)培養(yǎng)過夜。
[0030]2.2篩選陽性克隆，挑取單菌落接種液體LB (CnUOygAiUdTt:搖床震蕩培養(yǎng)16-18小時，提取重組質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察到共含3個質(zhì)粒(pMUTl、PMUT2和pMUTl-pRE112) DNA條帶，大小為3177bp, 5552bp和8937bp,即為攜帶重組質(zhì)粒pMUTl-pRE112 的 Nisslel917 (Nisslel917/pMUTl_pRE112)。
[0031]2.3 將 Nisslel917/pMUTl-pRE112 在液體 LB (Cm, 30 μ g/mL)培養(yǎng) I 代后，在 LB 固體(Cm，30 μ g/mL)上盲傳3代，重新挑單菌落擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA和電泳鑒定，發(fā)現(xiàn)原有的pMUTl質(zhì)粒已經(jīng)丟失，獲得去除pMUTl質(zhì)粒但攜帶重組質(zhì)粒pMUTl-pRE112的Nisslel917菌(Nisslel917 Δ pMUTl/pMUTl_pRE112)。2.4 含 10%蔗糖 LB 液體培養(yǎng)Nisslel917 Δ pMUTl/pMUTl-pRE112，然后在含10%蔗糖LB平板上培養(yǎng)，盲傳3代，溫度均為30°C，挑取單菌落擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA和電泳鑒定pMUT 1-pRE 112丟失情況，獲得已去除重組質(zhì)粒pMUTl-pRE112 的 Nisslel917 菌(Nisslel917 Λ pMUTl )。Nisslel917 隱秘質(zhì)粒 pMUTl 的去除參見附圖2。
[0032]3.Nisslel917 隱秘質(zhì)粒 pMUT2 的去除
[0033]3.1制備缺失pMUTl隱秘質(zhì)粒的Nisslel917 (Nisslel917 Δ pMUTl)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)，將pMUT2-pRE112重組質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化該感受態(tài)，加入ImL無抗性SOB培養(yǎng)基，37°C搖床震蕩培養(yǎng)45分鐘，涂布氯霉素平板(30 μ g/mL)培養(yǎng)過夜。
[0034]3.2篩選陽性克隆，挑取單菌落接種液體LB (Cm，30 μ g/mL)，37°C搖床震蕩培養(yǎng)16-18小時，提取質(zhì)粒DNA和電泳鑒定觀察到共含2個質(zhì)粒(pMUT2和pMUT2_pRE112)DNA條帶，大小為5552bp和11312bp,即為攜帶重組質(zhì)粒pMUT2_pRE112的Nisslel917(Nisslel917ApMUTl/pMUT2-pRE112)。
[0035]3.3 將 Nisslel917 ApMUTl/pMUT2-pRE112 在液體 LB (Cm, 30 μ g/mL)培養(yǎng) I 代后，在LB固體(Cm，30 μ g/mL)上盲傳3代，重新挑單菌落擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA和電泳鑒定，發(fā)現(xiàn)原有的質(zhì)粒PMUT2已經(jīng)丟失，獲得去除pMUT2質(zhì)粒但攜帶重組質(zhì)粒pMUT2-pRE112的Nisslel917 菌(Nisslel917ApMUTlApMUT2/pMUT2_pRE112)。
[0036]3.4 含 10% 蔗糖 LB 液體培養(yǎng) Nisslel917 Δ pMUTl Δ pMUT2/pMUT2-pRE112,然后在含10%蔗糖LB平板上培養(yǎng)，盲傳3代，溫度均為30°C，挑取單菌落擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA和電泳鑒定檢測pMUT2-pREl 12丟失情況，獲得已去除重組質(zhì)粒pMUTl-pREl 12的Nisslel917菌，即為完全去除兩個隱秘質(zhì)粒pMUTl和pMUT2的Nisslel917(Nisslel917 ApMUTl Λ pMUT2)。Nisslel917 隱秘質(zhì)粒 pMUT2 的去除過程參見附圖 3，Nisslel917兩個隱秘質(zhì)粒pMUTl和pMUT2去除前后的對比參見附圖4。
【權(quán)利要求】
1.一種使用自殺性載體去除大腸桿菌NiSSle菌內(nèi)隱秘質(zhì)粒的方法，其特征在于其步驟如下:將自殺性載體與待去除的隱秘質(zhì)粒構(gòu)建成重組自殺質(zhì)粒，所述自殺性載體具有抗性篩選標(biāo)記和自殺載體特性；用構(gòu)建的重組自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Nissle，通過抗性篩選得到僅攜帶重組自殺質(zhì)粒的大腸桿菌Nissle ;再利用自殺性載體的自殺特性篩選出丟失重組自殺質(zhì)粒的大腸桿菌Nissle，從而獲得去除了隱秘質(zhì)粒的大腸桿菌Nissle。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用自殺性載體去除細菌內(nèi)隱秘質(zhì)粒的方法，其特征在于，所述大腸桿菌Nissle是大腸桿菌Nisslel917，大腸桿菌Nisslel917中含有pMUTl、pMUT2兩個隱秘質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用自殺性載體去除細菌內(nèi)隱秘質(zhì)粒的方法，其特征在于，所述自殺性載體是PRE112。`
【文檔編號】C12N15/70GK103740747SQ201410045786
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月8日
【發(fā)明者】朱國強, 朱軍, 楊穎 , 夏芃芃, 羊揚, 周明旭, 朱曉芳 申請人:揚州大學(xué)