一種用于甲狀腺乳頭狀癌早期診斷的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于甲狀腺乳頭狀癌早期診斷的試劑盒，引物序列：TP53INP1?Sense:5’-CTTAACAATGTTCCAGAGGCTGAAT-3’Antisense:5’-AGGGTGCTCAGT?AGGTGACTCTT-3’；TP53INP2Sense:5’-:5’-GGTCCGTGTTGCACCTAA-3’；Antisense:5’-TTGGATCCCACCATGGAGGGCGC-3’AXIN2Sense:5’-5’-CACGGAAACTGTTGACAGTGGATAC-3’；Antisense:5’-GGTGGCTGGTGC?AAAGACATAG-3’；GAPDH?Sense:5’-GCACCGTC?AAGGCTGAGAAC-3’；Antisense:5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；本發(fā)明所述的試劑盒具有高敏感性和高特異性；可以作為甲狀腺乳頭狀癌的篩檢和早期診斷技術(shù)。
【專利說明】一種用于甲狀腺乳頭狀癌早期診斷的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)范疇，特別涉及一種用于甲狀腺乳頭狀癌早期診斷的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，人類甲狀腺癌是較常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率逐年升高。平均發(fā)病年齡為50歲，以女性居多，其中甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroidcarcinoma, PTC)的發(fā)病率最高，約占所有發(fā)病類型的80%。對甲狀腺癌的診斷目前主要依靠甲狀腺超聲以及穿刺活檢病理，雖然穿刺活檢病理診斷甲狀腺癌已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，但仍存在30%可疑或不確定是否為甲狀腺癌的診斷結(jié)果，并且穿刺是一項有創(chuàng)檢查，給患者帶來較大痛苦。甲狀腺癌一般以手術(shù)治療，早期發(fā)現(xiàn)進(jìn)行治療的患者五年生存率能達(dá)95%，晚期發(fā)現(xiàn)的患者五年生存率降至59%，因此為提高甲狀腺癌診斷的準(zhǔn)確性和早期診斷率，有必要尋找一種創(chuàng)傷性小，靈敏度和特異度均較高的新的診斷方法。
[0003]基因組以及高通量基因芯片技術(shù)的應(yīng)用使人們能夠更快速全面地了解腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中基因水平的變化。表達(dá)譜芯片技術(shù)最先應(yīng)用于疾病的鑒別診斷，其廣泛應(yīng)用乳腺癌、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌以及惡性黑色素瘤等的癌組織中差異基因表達(dá)研究，提供了大量的有意義的腫瘤分子標(biāo)志物。而利用非侵入性檢測手段發(fā)現(xiàn)腫瘤新的分子標(biāo)志物已成為人們越來越關(guān)心的熱點。Liew等學(xué)者提出所謂前哨原則(Sentinel Principle)，即外周血細(xì)胞存在獨特的基因表達(dá)譜型，能反映人體組織穩(wěn)定的(遺傳)和動態(tài)的(環(huán)境和疾病的影響)的變化，外周血可以表達(dá)人體基因組80%以上的基因，其中包含組織特異性基因。這就提示我們可以通過檢測外周血中表達(dá)譜芯片，可以篩選出具有診斷價值的基因，并用實時熒光定量RT-PCR診斷甲狀腺癌。
`[0004]近年來，廣泛應(yīng)用于診斷及人群篩選的主要方法是受試者工作特性曲線分析(R0C分析)，美國生物統(tǒng)計百科全書中關(guān)于ROC分析的定義是:對于可能或?qū)嬖诨煜膬煞N條件或自然狀態(tài)，需要試驗者、專業(yè)診斷學(xué)工作者以及預(yù)測工作者作出精細(xì)判別，或者準(zhǔn)確決策的一種定量方法。目前ROC分析已成為廣泛應(yīng)用于臨床診療和人群篩檢研究的一種統(tǒng)計方法。它結(jié)合靈敏度和特異度對診斷試驗進(jìn)行綜合評價，根據(jù)曲線的形狀和面積對診斷試驗作定量分析，可選取最合適的截割點使試驗的靈敏度和特異度達(dá)到最優(yōu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是根據(jù)保守序列TP53INP1、TP53INP2和AXIN2基因設(shè)計了引物，提供一種特異性強(qiáng)，敏感性高，一種用于甲狀腺乳頭狀癌早期診斷的試劑盒及檢測方法和應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的用于甲狀腺乳頭狀癌早期診斷的試劑盒的引物序列:
[0007]TP53INP1
[0008]Sense: 5 ’ -CTTAACAATGTTCCAGAGGCTGAAT-3 ’[0009]Antisense:5’-AGGGTGCTCAGT AGGTGACTCTT-3’
[0010]TP53INP2
[0011 ] Sense:5 ’ -: 5 ’ -GGTCCGTGTTGCACCTAA-3，
[0012]Antisense:5’ -TTGGATCCCACCATGGAGGGCGC-3’
[0013]AXIN2
[0014]Sense:5 ’ -5 ’ -CACGGAAACTGTTGACAGTGGATAC-3，
[0015]Antisense:5’ -GGTGGCTGGTGC AAAGACATAG-3’
[0016]GAPDH[0017]Sense:5，-GCACCGTC AAGGCTGAGAAC-3，
[0018]Antisense:5，-TGGTGA AGACGCCAGTGGA-3’
[0019]用于甲狀腺乳頭狀癌早期診斷的試劑盒的檢測方法包括以下步驟:
[0020]A、常規(guī)方法提取待檢樣品RNA ;
[0021 ] B、將待檢樣品RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；
[0022]C、將上述引物分別與PCR混合液加入PCR反應(yīng)管中混合后加入待檢樣品cDNA ；
[0023]D、放入熒光PCR檢測儀中進(jìn)行反應(yīng)；
[0024]E、有擴(kuò)增曲線且待檢樣品經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品定量后得出的數(shù)值符合判斷閾值為陽性，否則為陰性；
[0025]步驟C所述的引物終濃度均為0.4 μ M，步驟C所述的PCR混合液包括:SYBR?Premix Ex Taq?II (Tli RNaseH Plus) (2XConc.)和 ROX Reference Dye (50XCone.)或 ROX Reference Dye II (50XCone.) ；SYBR? Premix Ex Taq?II (Tli RNaseH Plus)(2XCone.)內(nèi)含 TaKaRa Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+，Tli RNaseH,SYBR? Green I等，ROX Reference Dye (50XCone.)或 ROX Reference Dye II (50XCone.)只使用在Life Technologies等公司的Real Time PCR擴(kuò)增儀上，用以校正孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號誤差。Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System 和 StepOnePlusTM 使用 ROXReference Dye, 7500 Real-Time PCR System 和 7500 Fast Real-Time PCR System 使用ROX Reference Dye II。Thermal Cycler Dice Real Time System I1、LightCvCler?/ Li ghtCyc I er?.480 System (Roche Diagnostics)或 CFX96?Real-Time PCR DetectionSystem(Bio-Rad)等Real Time PCR擴(kuò)增儀不必使用。待檢測樣品cDNA溶液占總反應(yīng)液的8% ；
[0026]步驟0按第一階段951:、308，1個循環(huán)；第二個階段951:、208，601:、208，各45個循環(huán)；
[0027]在第二階段延伸時即60°C、20s，收集熒光信號觀察擴(kuò)增曲線，記錄Ct值，采用比較閾值法，即目的基因的量=2—，進(jìn)行基于表達(dá)量的計算；
[0028]本發(fā)明甲狀腺乳頭狀癌早期診斷的試劑盒進(jìn)行相對定量的標(biāo)準(zhǔn)品為ΗΕΚ293細(xì)胞cDNA ；
[0029]相對定量的標(biāo)準(zhǔn)品為HEK293細(xì)胞cDNA的濃度6.25ng/ μ I。
[0030]用于甲狀腺乳頭狀癌早期診斷的試劑盒它包括:
[0031 ] 溶液1:濃度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.1和濃度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.2的1:1混合液；[0032]溶液2:濃度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.3和濃度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.4的1:1混合液；
[0033]溶液3:濃度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.5和濃度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.6的1:1混合液；
[0034]溶液4:濃度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.7和濃度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.8的1:1混合液；
[0035]溶液5:PCR混合液。 [0036]所述的試劑盒還包括濃度為6.25ng/ μ I的ΗΕΚ293細(xì)胞cDNA作為實時熒光相對定量標(biāo)準(zhǔn)品。
[0037]所述的混合液是由SYBR?Premix Ex Taq?II (Tli RNaseH Plus) (2XCone.)和ROX Reference Dye (50XCone.)或 ROX Reference Dye II (50XCone.)按 25:1 比例配制的。
[0038]甲狀腺乳頭狀癌早期診斷的試劑盒的使用方法:
[0039]A、將所述溶液1:2μ 1、溶液5:13μ UddH2O:8 μ I加入PCR反應(yīng)管內(nèi)混合后，加入待檢樣品cDNA溶液，加入量為2 μ I ;
[0040]B、將所述溶液2:2 μ 1、溶液5:13 μ l、ddH20:8 μ I加入PCR反應(yīng)管內(nèi)混合后，加入待檢樣品cDNA溶液，加入量為2 μ I ;
[0041]C、將所述溶液3:2 μ 1、溶液2:13 μ l、ddH20:8 μ I加入PCR反應(yīng)管內(nèi)混合后，加入待檢樣品cDNA溶液，加入量為2 μ I ;
[0042]D、將所述溶液4:2 μ 1、溶液2:13 μ l、ddH20:8μ I加入PCR反應(yīng)管內(nèi)混合后，加入標(biāo)準(zhǔn)品ΗΕΚ293細(xì)胞cDNA溶液，加入量為2 μ I ;
[0043]Ε、將所述溶液4:2 μ 1、溶液2:13 μ l、ddH20:8μ I加入PCR反應(yīng)管內(nèi)混合后，分別加入待檢樣品cDNA溶液、標(biāo)準(zhǔn)品HEK293細(xì)胞cDNA溶液，加入量為2 μ I ;
[0044]F、將加好樣品的熒光PCR反應(yīng)管按順序放入熒光PCR檢測儀中，按第一階段95°C、30s, I個循環(huán)；第二個階段95°C、20S，6(TC、2()S，各45個循環(huán)；設(shè)定反應(yīng)條件；將E步驟設(shè)定為內(nèi)參；
[0045]G、在第二階段延伸時即60°C、20s，收集熒光信號觀察擴(kuò)增曲線，記錄Ct值，采用比較閾值法，即目的基因的量=2_ΛΛετ，進(jìn)行基于表達(dá)量的計算；
[0046]H、以ΗΕΚ293細(xì)胞內(nèi)GAPDH的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)值對待檢樣品ΤΡ53ΙΝΡ1、ΤΡ53ΙΝΡ2和ΑΧΙΝ2的表達(dá)進(jìn)行相對定量，得出表達(dá)數(shù)值，并根據(jù)試劑盒給出的判斷方法及范圍進(jìn)行判斷。
[0047]判定標(biāo)準(zhǔn):
[0048]1、判定標(biāo)準(zhǔn)的獲取:利用甲狀腺乳頭狀癌患者和正常人的外周血樣本中的總RNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測，并使用ΗΕΚ293細(xì)胞內(nèi)GAPDH的表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)，得到樣本中本文前述3個基因標(biāo)志物的相對表達(dá)量，用一種基因標(biāo)志物的相對表達(dá)量或兩種的比值進(jìn)行ROC分析，得到靈敏度，特異度，曲線下面積和截斷點，即診斷閾值，，選擇靈敏度、特異度和曲線下面積均較高的基因及組合作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，最終得出表1三個檢測指標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn)。該指標(biāo)ROC曲線見附圖1、2、3。由附圖1、2、3可見，該模型ROC曲線的AUC分別為0.959，0.991和0.970，該模型具有較高的分類正確率(陽性符合率)[0049]表1
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種用于甲狀腺乳頭狀癌早期診斷的試劑盒，它包括:引物如序列表SEQ IDN0.1,SEQ IDN0.2, SEQ IDN0.3, SEQ IDN0.4, SEQ IDN0.5, SEQ IDN0.6, SEQ IDN0.7和 SEQ IDN0.8所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于甲狀腺乳頭狀癌早期診斷的試劑盒，其特征在于，它包括: 溶液1:濃度10 μ M引物SEQ IDN0.1和濃度10 μ M引物SEQ IDN0.2的1:1混合液； 溶液2:濃度10 μ M引物SEQ IDN0.3和濃度10 μ M引物SEQ IDN0.4的1:1混合液； 溶液3:濃度10 μ M引物SEQ IDN0.5和濃度10 μ M引物SEQ IDN0.6的1:1混合液； 溶液4:濃度10 μ M引物SEQ IDN0.7和濃度10 μ M引物SEQ IDN0.8的1:1混合液； 溶液5 =PCR混合液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于甲狀腺乳頭狀癌早期診斷的試劑盒，其特征在于:所述的混合液是由SYBR1? Premix Ex Taq?II(Tli RNaseH Plus) (2XCone.)和 ROXReference Dye (50XCone.)或 ROX Reference Dye II (50XCone.)按 25:1 比例配制的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種用于甲狀腺乳頭狀癌早期診斷的試劑盒，其特征在于:它包括濃度為6.25ng/ μ I的ΗΕΚ293細(xì)胞cDNA作為實時熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒在制備檢測甲狀腺乳頭狀癌早期診斷中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103710459SQ201410017058
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】劉曉冬, 李文興, 賀夢子, 楊淑娟, 馬淑梅 申請人:吉林大學(xué)