一種檢測(cè)飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量和gmp工廠表面衛(wèi)生的atp生物發(fā)光試劑、方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種檢測(cè)飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量和GMP工廠表面衛(wèi)生的ATP生物發(fā)光試劑、方法及試劑盒。本發(fā)明所述的ATP生物發(fā)光試劑，包括熒光素酶、D-熒光素、去ATP無(wú)菌處理的發(fā)光穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)，所述的熒光素酶必須經(jīng)過(guò)純化，純化的熒光素酶的活力本底比達(dá)到50～3000，其使得ATP生物發(fā)光試劑的發(fā)光比活力在0.4mL發(fā)光體系中，用1×10-7/L?ATP測(cè)量時(shí)的相對(duì)發(fā)光對(duì)數(shù)值達(dá)到6.5～7.5，將熒光素酶、D-熒光素、去ATP無(wú)菌處理的發(fā)光穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)混合后冷凍得到凍干粉。本發(fā)明采用高靈敏度穩(wěn)定發(fā)光的ATP生物發(fā)光試劑對(duì)飲用水衛(wèi)生質(zhì)量及GMP工廠表面衛(wèi)生進(jìn)行快速檢測(cè)，在半小時(shí)內(nèi)可以完成取樣與快速檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】—種檢測(cè)飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量和GMP工廠表面衛(wèi)生的ATP生物發(fā)光試劑、方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測(cè)飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量和GMP工廠表面衛(wèi)生的ATP生物發(fā)光試劑、方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】：
[0002]水是生命之源，水的安全涉及到千家萬(wàn)戶，關(guān)系到每一個(gè)人的生命健康。飲水安全包括理化和微生物兩個(gè)方面因素，并且這兩個(gè)因素在某些方面相互影響。在現(xiàn)行的飲用水國(guó)標(biāo)中，其中細(xì)菌總數(shù)是必檢項(xiàng)目，即使因?yàn)轱嬘盟邢靖碑a(chǎn)物問(wèn)題實(shí)施的礦泉水國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌總數(shù)不作為強(qiáng)制檢測(cè)項(xiàng)目，但新增了 3個(gè)致病菌的檢測(cè)，而且礦泉水生產(chǎn)廠家在生產(chǎn)過(guò)程中飲用水企業(yè)實(shí)行HACCP質(zhì)量管理體系，快速檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用是非常必要的。國(guó)家飲用水標(biāo)準(zhǔn)GB/T5750112-2006中菌落總數(shù)為必檢項(xiàng)目，定義為在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上有氧條件下37°C培養(yǎng)48h后，所得Iml水樣中的細(xì)菌數(shù)。飲用水所含菌落的總數(shù)(傾注法倒平板)，按該方法規(guī)定所得結(jié)果只包括一群能在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫需氧細(xì)菌菌落總數(shù)。ATP生物發(fā)光技術(shù)是一種以ATP的生物發(fā)光反應(yīng)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)技術(shù)，不需要培養(yǎng)過(guò)程，極大地縮短了微生物數(shù)量檢測(cè)時(shí)間，可以根據(jù)檢測(cè)結(jié)果直接改善工作，為衛(wèi)生監(jiān)督進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)急處理提供快捷可靠的依據(jù)，可廣泛應(yīng)用于HACCP和GMP的關(guān)鍵環(huán)節(jié)監(jiān)測(cè)。實(shí)施GMP衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的工廠，其微生物數(shù)量和表面衛(wèi)生清潔度檢測(cè)是質(zhì)控體系中需要監(jiān)控的重要指標(biāo)。在食品加工企業(yè)建立了衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)操作程序之后，還必須設(shè)定監(jiān)控程序，實(shí)施檢查、記錄和糾正措施。樣品中的細(xì)菌總數(shù)和表面衛(wèi)生清潔度的檢測(cè)是許多監(jiān)控指標(biāo)中的兩個(gè)代表性指標(biāo)，指示衛(wèi)生微生物污染程度和清潔消毒的有效性。食品工廠的表面樣品是指與食品接觸的表面，例如加工設(shè)備、工器具、包裝材料、加工人員的工作服、手套等等。這些與食品接觸的表面的清潔度直接影響食品的安全與衛(wèi)生，也是驗(yàn)證清潔消毒的效果的標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)項(xiàng)目為細(xì)菌總數(shù)、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌。GMP工廠的衛(wèi)生指標(biāo)的干凈標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)過(guò)消毒的設(shè)備和工器具以食品接觸面總數(shù)低于100個(gè)/cm2為宜，對(duì)于衛(wèi)生要求更嚴(yán)格的工序，應(yīng)低于10個(gè)/cm2，沙門氏菌及金黃色葡萄球菌等致病菌不得檢出，GMP工廠工人手的合格指標(biāo)為低于30個(gè) /cm2。
[0003]另外作為最簡(jiǎn)單有效的表面衛(wèi)生傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，接觸皿法被廣泛用于檢測(cè)生產(chǎn)區(qū)域細(xì)菌和酵母霉菌的表面污染情況，需要一個(gè)培養(yǎng)過(guò)程，達(dá)不到在線檢測(cè)的要求。生物發(fā)光方法通過(guò)測(cè)量表面總的ATP含量來(lái)判斷表面是否干凈清潔，是非常靈敏的衛(wèi)生學(xué)檢測(cè)方法。一個(gè)干凈的表面需要無(wú)菌，但是如果被任何生物材料污染(指示有ATP的存在)，它為微生物的快速繁殖提供了基礎(chǔ)，這種污染源可以很容易被ATP檢測(cè)方法檢測(cè)到，但是傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法往往不能做到。自1970年代以來(lái)，Shape與其合作者應(yīng)用ATP生物發(fā)光法在食品中檢測(cè)微生物的數(shù)量，ATP生物發(fā)光法用于評(píng)價(jià)細(xì)菌污染的研究日益增加，一些商業(yè)的ATP生物發(fā)光系統(tǒng)作為一種衛(wèi)生檢測(cè)儀已經(jīng)成功地用于HACCP體系的原位控制，然而最大多數(shù)的商業(yè)試劑盒中去除非細(xì)胞ATP干擾的試劑是昂貴的，操作也比較復(fù)雜，因此限制了它們?cè)谑称饭I(yè)的應(yīng)用。一般的ATP生物發(fā)光技術(shù)的檢測(cè)靈敏度在104_5個(gè)細(xì)菌細(xì)胞/mL，與有效的表面衛(wèi)生及消毒效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)有一定的差距。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種能夠快速、有效地檢測(cè)飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量和GMP工廠表面衛(wèi)生的ATP生物發(fā)光試劑、方法及試劑盒。
[0005]本發(fā)明采用高靈敏度穩(wěn)定發(fā)光的ATP生物發(fā)光試劑對(duì)飲用水衛(wèi)生質(zhì)量及GMP工廠表面衛(wèi)生進(jìn)行快速檢測(cè)，在 半小時(shí)內(nèi)可以完成取樣與快速檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明所述的檢測(cè)飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量和GMP工廠表面衛(wèi)生的ATP生物發(fā)光試劑，其特征在于，包括熒光素酶、D-熒光素、去ATP無(wú)菌處理的發(fā)光穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)，所述的熒光素酶必須經(jīng)過(guò)純化，具體制備方法為：取天然螢火蟲蟲尾，通過(guò)添加酶提取液研磨、離心和硫酸銨沉淀得到粗酶制劑；再通過(guò)復(fù)溶、透析、超濾、離心和陽(yáng)離子交換法進(jìn)行純化，純化過(guò)程中的NTE緩沖液是經(jīng)過(guò)去ATP處理的，進(jìn)一步經(jīng)一次分子排阻層析或親和層析和二次分子排阻層析，即得到純化的熒光素酶，其使得ATP生物發(fā)光試劑的發(fā)光比活力在O. 4mL發(fā)光體系中，用lX10_7mol/L ATP測(cè)量時(shí)的相對(duì)發(fā)光對(duì)數(shù)值達(dá)到6. 5~7. 5 ;所述的D-熒光素的純度為99%以上（Area%，HPLC)，其在ATP生物發(fā)光試劑中的終濃度為20~150 μ g/mL ;所述的去ATP無(wú)菌處理的發(fā)光穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)含10~100mg/L海藻糖、5~100mg/L PEG,O~
2.Omol/L 鹿糖、O. I ~2. 0mol/L 甘氨酸、O ~2. 0mol/L DMSO>O ~Immol /I,焦憐酸（ppi)、25mmol/L 甘氨酰甘氨酸、1.0mmoI/L EDTAU. OmmoI/L DTT, pH7. 2 ~7. 8。
[0007]本發(fā)明中熒光素酶的制備方法參考發(fā)明專利ZL200610034384. 4，唯一不同之處是純化過(guò)程中的NTE緩沖液是經(jīng)過(guò)去ATP處理的，所得到的純化的熒光素酶的活力本底比達(dá)到 50 ~3000。
[0008]所述的去ATP無(wú)菌處理，具體為每25mL被處理試劑添加10 μ L10u/mL三磷酸腺苷雙磷酸酶，25~30°C室溫處理5min，經(jīng)121°C，15min滅菌。
[0009]本發(fā)明的ATP生物發(fā)光試劑是通過(guò)以下方法制備的：將熒光素酶、D-熒光素和去ATP無(wú)菌處理的發(fā)光穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)按上述要求混合后凍干，得到凍干粉即為ATP生物發(fā)光試劑。
[0010]凍干粉形式的ATP生物發(fā)光試劑有利于其活力保存和保證其產(chǎn)品質(zhì)量。
[0011]所述的D-熒光素，其制備方法參考發(fā)明專利201110459845. 3，具體為：通過(guò)去ATP充氮?dú)獾陌l(fā)光檢測(cè)緩沖液含25mmol/L甘氨酰甘氨酸、1.0mmol/L EDTA、1.0mmoI/L DTT、pH7. 8配制成10mg/ml的濃縮樣品后過(guò)0. 22 μ m濾膜,再用同樣的緩沖液稀釋至lmg/ml即得到D-熒光素。D-熒光素的純度為99%以上（Area%，HPLC)。
[0012]一種檢測(cè)飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量的方法，其特征在于，包括以下步驟：首先復(fù)配ATP生物發(fā)光試劑=ATP生物發(fā)光試劑添加去ATP無(wú)菌處理的發(fā)光穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)，使ATP生物發(fā)光試劑的發(fā)光比活力在0.4mL發(fā)光體系中，用1X10_7/L ATP測(cè)量時(shí)的相對(duì)發(fā)光對(duì)數(shù)值達(dá)到
6.5~7. 5 ;然后通過(guò)真空抽濾將待檢水樣過(guò)0. 45 μ m或0. 22 μ m濾膜，棄廢液，再加2. 5ml無(wú)菌超純水洗脫濾膜上的微生物，得到濃縮了 100倍的樣品，測(cè)量時(shí)，每取0. Iml濃縮樣品，加入0. ImlATP提取劑EC，振勻后室溫下作用I. 5~2. 5min，再加入0. Iml⑶B發(fā)光測(cè)試緩沖液，振勻后加入0. Iml復(fù)配后的ATP生物發(fā)光試劑，立即置于ATP生物發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)無(wú)菌水作為對(duì)照的空白樣品發(fā)光值，樣品發(fā)光值減去空白發(fā)光值后取對(duì)數(shù)，通過(guò)發(fā)光曲線計(jì)算待測(cè)水樣中的細(xì)菌總數(shù)，細(xì)菌總數(shù)TBC=NX (505X10 (A+BLogELU))/3X IO^16(個(gè)/升)，N=稀釋倍數(shù)，A，B為ATP生物發(fā)光試劑的標(biāo)準(zhǔn)ATP發(fā)光曲線測(cè)試后，ATP濃度和凈相對(duì)發(fā)光值取雙對(duì)數(shù)后獲得的線性回歸的發(fā)光方程的系數(shù)。每批ATP生物發(fā)光試劑或使用時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)須進(jìn)行發(fā)光曲線的測(cè)量，同時(shí)計(jì)算ATP生物發(fā)光試劑的發(fā)光回歸方程系數(shù)和相關(guān)性，以確認(rèn)ATP發(fā)光試劑的有效性。
[0013]所述的真空抽濾，優(yōu)選使用三頭或多頭不銹鋼真空抽濾系統(tǒng)，該系統(tǒng)配套一個(gè)帶緩沖容器的真空泵及可以取下和用酒精點(diǎn)火滅菌的不銹鋼三頭或多頭真空抽濾支架，該系統(tǒng)購(gòu)自廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司。
[0014]上述檢測(cè)飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量的方法，能檢出大于10cells/mL中溫菌的水樣，此方法得出的活菌總數(shù)相比平板培養(yǎng)法在數(shù)量級(jí)上是準(zhǔn)確的，能夠快速檢測(cè)飲用水中的中溫菌的含量。
[0015]一種檢測(cè)GMP工廠表面衛(wèi)生的方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0016](I)、取樣：通過(guò)無(wú)菌棉簽浸潤(rùn)擦拭緩沖液，IOXlOcm2可重復(fù)使用的不銹鋼絲材質(zhì)取樣框?qū)Υ郎y(cè)表面取樣并在原來(lái)含擦拭緩沖液的離心管或試管中洗下表面物，得到表面樣品液；
[0017](2)、去除非細(xì)胞ATP :每取O. 5ml表面樣品液加入帶O. 22 μ m濾膜過(guò)濾柱的2. Oml純化濾膜柱，10000r/min,離心30S,棄廢液，再加入O. 2ml無(wú)菌超純水，10000r/min,離心30S，棄廢液，即去掉表面樣品中的非細(xì)胞ATP ；
[0018](3)、濾膜上微生物細(xì)胞ATP抽提及發(fā)光測(cè)試：首先復(fù)配ATP生物發(fā)光試劑：ATP生物發(fā)光試劑添加去ATP無(wú)菌處理的發(fā)光穩(wěn)`定緩沖系統(tǒng)，使ATP生物發(fā)光試劑的發(fā)光比活力在O. 4mL發(fā)光體系中，用1X10_7/L ATP測(cè)量時(shí)的相對(duì)發(fā)光對(duì)數(shù)值達(dá)到6. 5~7. 5 ;然后將帶O. 22 μ m濾膜的濾膜柱換至2. Oml無(wú)菌的離心管中，在濾膜柱中直接加O. ImlATP提取試劑EC振勻后室溫下作用I. 5~2. 5min (同一批測(cè)試包括空白樣均需一致)，加入0. Iml⑶B發(fā)光測(cè)試緩沖液，10000r/min,離心30S，再加入0. Iml無(wú)菌超純水后，再次將濾膜柱上的ATP等試劑洗下，去掉濾膜柱，加入0. Iml復(fù)配后的ATP生物發(fā)光試劑置于ATP生物發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)試樣品發(fā)光值，同時(shí)進(jìn)行空白樣品的發(fā)光測(cè)試；
[0019](4)、細(xì)菌總數(shù)的計(jì)算：表面樣品發(fā)光值減去空白樣品發(fā)光值后通過(guò)發(fā)光曲線計(jì)算表面樣品的細(xì)菌總數(shù)，細(xì)菌總數(shù)TBC=NX (505X10 (A+BLogELU))/3X IO^16 (個(gè)/升)，N=稀釋倍數(shù)，A，B為ATP發(fā)光試劑的標(biāo)準(zhǔn)ATP發(fā)光曲線測(cè)試后，ATP濃度和凈相對(duì)發(fā)光值取雙對(duì)數(shù)后獲得的線性回歸的發(fā)光方程的系數(shù)。每批ATP發(fā)光試劑或使用時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)須進(jìn)行發(fā)光曲線的測(cè)量，同時(shí)計(jì)算ATP發(fā)光試劑的發(fā)光回歸方程系數(shù)和相關(guān)性，以確認(rèn)ATP發(fā)光試劑的有效性。
[0020](5)、評(píng)價(jià)：對(duì)低于空白樣品發(fā)光值103cfu/ml的表面樣品，按GMP工廠的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)均可以判斷為合格，高于空白樣品的發(fā)光值的樣品則直接通過(guò)發(fā)光曲線計(jì)算，和GMP標(biāo)準(zhǔn)比較即可判斷是否合格。
[0021]所述的O. 4ml發(fā)光系統(tǒng)，包括O. lmll()-7mol/L標(biāo)準(zhǔn)ATP,0. Iml無(wú)菌超純水、0. Iml⑶B發(fā)光測(cè)試緩沖液和0. Iml熒光素酶。
[0022]所述的ATP生物發(fā)光檢測(cè)儀，優(yōu)選發(fā)光性能好、穩(wěn)定性好、線性檢測(cè)范圍較寬、檢測(cè)靈敏度以ATP計(jì)最高達(dá)到10_18molATP的高性能的ATP生物發(fā)光檢測(cè)儀。本發(fā)明使用的是廣東環(huán)凱微生物科技有限公司研制的第二代高性能便攜式ATP生物發(fā)光檢測(cè)儀HKM (II)ATP發(fā)光儀或美國(guó)Promega GL0MAX?20/20ATP發(fā)光檢測(cè)儀。
[0023]一種檢測(cè)飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量的試劑盒，其特征在于，包括:ATP生物發(fā)光試劑，去ATP無(wú)菌處理的發(fā)光穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)，GDB發(fā)光測(cè)試緩沖液，ATP提取劑EC，10^7mol/L標(biāo)準(zhǔn)ATP，無(wú)菌去ATP的超純水。
[0024]優(yōu)選，檢測(cè)飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量的試劑盒中還包括O. 45 μ m和O. 22 μ m的無(wú)菌一次
性濾膜。
[0025]一種檢測(cè)GMP工廠表面衛(wèi)生的試劑盒，其特征在于，包括：無(wú)菌去ATP的擦拭緩沖液，ATP生物發(fā)光試劑，去ATP無(wú)菌處理的發(fā)光穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)，GDB發(fā)光測(cè)試緩沖液，ATP提取劑EC，10^7mol/L標(biāo)準(zhǔn)ATP，無(wú)菌去ATP的超純水。
[0026]優(yōu)選，檢測(cè)GMP工廠表面衛(wèi)生的試劑盒中還包括2. OmL無(wú)菌透明離心管，10 X IOcm2可重復(fù)使用的不銹鋼絲材質(zhì)取樣框，均勻度一致的長(zhǎng)柄無(wú)菌棉拭，一次性無(wú)菌的帶O. 22 μ m濾膜過(guò)濾柱的2. Oml純化濾膜柱。
[0027]所述的⑶B發(fā)光測(cè)試緩沖液含有25mmol/L甘氨酰甘氨酸，O. 5mmol/L EDTA,O. 5mmol/L DTT, α -環(huán)糊精CD的含量為O. I~2. 0%, ρΗ5. O~7. 8 ;所述的ATP提取劑EC含有I~30g/L TritonX-100,0. I~5. Og/L十六烷三甲基溴化銨，O. I~3. Og/L 二甲亞砜，0.01~O. lg/L乙二胺四乙酸，0.01~O. lg/L硫酸鎂；所述的無(wú)菌去ATP的擦拭緩沖液為用超純水配制的O~2. 0 %TXP-10 (酚醚磷酸酯ΤΧΡ-10)，經(jīng)去ATP滅菌處理；所述的復(fù)配緩沖液為含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，O. 5mmol/L EDTA，0. 5mmol/L DTT, pH7. 2 ;所述的去ATP處理，具體為每25mL被處理試劑添加10 μ L10u/mL三磷酸腺苷雙磷酸酶，25~30°C室溫處理5min。
[0028]使用美國(guó)Promega GL0MAX?20/20ATP發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行本發(fā)明的ATP生物發(fā)光試劑的發(fā)光曲線的檢測(cè)，本發(fā)明的ATP生物發(fā)光試劑（型號(hào)：HBB2000 )的發(fā)光曲線如圖I所示。ATP生物發(fā)光試劑：Log [ATP] =A+BLogELU,對(duì)于本發(fā)明的ATP生物發(fā)光試劑，A=-14. 5771，B=L 0588，R=O. 9963), 10_7 ~10_12mol/L ATP, n=6 ；或：Log[ATP]=A+BLogKLU，對(duì)于本發(fā)明的 ATP 生物發(fā)光試劑，Α=-14· 9482，B=L 1235Log，R=O. 9937，10-7 ~l(T13mol/LATP,n=7。
[0029]由于不同類型的微生物中ATP含量水平不同，同一類型的微生物每個(gè)細(xì)胞中的ATP含量基本上是在一個(gè)數(shù)值上下波動(dòng)，如細(xì)菌數(shù)與ATP含量對(duì)應(yīng)關(guān)系為細(xì)菌細(xì)胞ATP含量：0· 18X10-16 ~8. 75Xl(T16g (ATP)/cell,其平均值約 3· OX l(T16g (ATP)/cell，因此樣品中的細(xì)菌總數(shù)TBC可用下列方程計(jì)算：
[0030]細(xì)菌總數(shù)TBC=NX (505X10A+BLogELU)/3X10-16 (個(gè) / 升），N=稀釋倍數(shù)；或：TBC=NX(505X10A+BLogELU) /3X 10_16 (個(gè)/升)，N=稀釋倍數(shù)，A，B為ATP發(fā)光試劑的標(biāo)準(zhǔn)ATP發(fā)光曲線測(cè)試后，ATP濃度和凈相對(duì)發(fā)光值取雙對(duì)數(shù)后獲得的線性回歸的發(fā)光方程的系數(shù)。本發(fā)明的ATP生物發(fā)光試劑的檢測(cè)靈敏度可以提高到10_13mol/L，發(fā)光方程系數(shù)A=-14. 9482，B=L 1235Log，其相關(guān)性達(dá)到了 R=O. 9937，但在10_7~10_12mol/LATP范圍內(nèi)其發(fā)光曲線的線性最好。
[0031]本發(fā)明的ATP生物發(fā)光試劑在室溫下I小時(shí)內(nèi)其發(fā)光活力相對(duì)穩(wěn)定，其線性檢測(cè)限穩(wěn)定在10_12mol/LATP，高端發(fā)光活力在一小時(shí)的檢測(cè)時(shí)間比較穩(wěn)定。
[0032]本發(fā)明的ATP生物發(fā)光試劑在熒光素酶的制備方法及緩沖穩(wěn)定系統(tǒng)上進(jìn)行了改進(jìn)，在室溫30°C條件下，I小時(shí)內(nèi)通過(guò)連續(xù)三次進(jìn)行ATP發(fā)光曲線測(cè)試檢驗(yàn)ATP生物發(fā)光試劑的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0033]表1.ATP生物發(fā)光試劑的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量和GMP工廠表面衛(wèi)生的ATP生物發(fā)光試劑，其特征在于，包括熒光素酶、D-熒光素、去ATP無(wú)菌處理的發(fā)光穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)，所述的熒光素酶必須經(jīng)過(guò)純化，具體制備方法為：取天然螢火蟲蟲尾，通過(guò)添加酶提取液研磨、離心和硫酸銨沉淀得到粗酶制劑；再通過(guò)復(fù)溶、透析、超濾、離心和陽(yáng)離子交換法進(jìn)行純化，純化過(guò)程中的NTE緩沖液是經(jīng)過(guò)去ATP處理的，進(jìn)一步經(jīng)一次分子排阻層析或親和層析和二次分子排阻層析，即得到純化的熒光素酶，其使得ATP生物發(fā)光試劑的發(fā)光比活力在O. 4mL發(fā)光體系中，用IX 10_7mol/L ATP測(cè)量時(shí)的相對(duì)發(fā)光對(duì)數(shù)值達(dá)到6. 5~7. 5 ;所述的D-熒光素的純度為99%以上，其在ATP生物發(fā)光試劑中的終濃度為20~150 μ g/mL ;所述的去ATP無(wú)菌處理的發(fā)光穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)含10~100mg/L海藻糖、5~100mg/L PEG,O~2. OmoI/L蔗糖、O. I ~2. Omol/L 甘氨酸、O ~2. 0mol/L DMSO>O ~Immol /I,焦憐酸、25mmol/L 甘氛酸甘氛酸、LOmmol/L EDTAU. OmmoI/L DTT, ρΗ7· 2 ~7. 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ATP生物發(fā)光試劑，其特征在于，所述的去ATP無(wú)菌處理，為用三磷酸腺苷雙磷酸酶處理后，經(jīng)121°C，15min滅菌。
3.—種檢測(cè)飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量的方法，其特征在于，包括以下步驟：首先復(fù)配ATP生物發(fā)光試劑=ATP生物發(fā)光試劑添加去ATP無(wú)菌處理的發(fā)光穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)，使ATP生物發(fā)光試劑的發(fā)光比活力在O. 4mL發(fā)光體系中，用1X10_7/L ATP測(cè)量時(shí)的相對(duì)發(fā)光對(duì)數(shù)值達(dá)到 .6.5~7. 5 ;然后通過(guò)真空抽濾將待檢水樣過(guò)O. 45 μ m或O. 22 μ m濾膜，棄廢液，再加2. 5ml無(wú)菌超純水洗脫濾膜上的微生物，得到濃縮了 100倍的樣品，測(cè)量時(shí)，每取O. Iml濃縮樣品，加入O. ImlATP提取劑EC，振勻后室溫下作用I. 5~2. 5min，再加入O. Iml⑶B發(fā)光測(cè)試緩沖液，振勻后加入O. Iml復(fù)配后的ATP生物發(fā)光試劑，立即置于ATP生物發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)無(wú)菌水作為對(duì)照的空白樣品發(fā)光值，樣品發(fā)光值減去空白發(fā)光值后取對(duì)數(shù)，通過(guò)發(fā)光曲線計(jì)算待測(cè)水樣中的細(xì)菌總數(shù)，細(xì)菌總數(shù)TBC=NX (505X10 (A+BLogELU))/3X IO^16(個(gè)/升)，N=稀釋倍數(shù)，A，B為ATP生物發(fā)光試劑的標(biāo)準(zhǔn)ATP發(fā)光曲線測(cè)試后，ATP濃度和凈相對(duì)發(fā)光值取雙對(duì)數(shù)后獲得的線性回歸的發(fā)光方程的系數(shù)。
4.一種檢測(cè)GMP工廠表面衛(wèi)生的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1)、取樣：通過(guò)無(wú)菌棉簽浸潤(rùn)擦拭緩沖液，IOXIOcm2可重復(fù)使用的不銹鋼絲材質(zhì)取樣框?qū)Υ郎y(cè)表面取樣并在原來(lái)含擦拭緩沖液的離心管或試管中洗下表面物，得到表面樣品液； (2)、去除非細(xì)胞ATP:每取0. 5ml表面樣品液加入含帶0. 22 μ m濾膜過(guò)濾柱的2. Oml純化濾膜柱，10000r/min,離心30S,棄廢液，再加入0. 2ml無(wú)菌超純水，10000r/min,離心30S,棄廢液，即去掉表面樣品中的非細(xì)胞ATP ； (3)、首先復(fù)配ATP生物發(fā)光試劑：ATP生物發(fā)光試劑添加去ATP無(wú)菌處理的發(fā)光穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)，使ATP生物發(fā)光試劑的發(fā)光比活力在0. 4mL發(fā)光體系中，用I X 10_7/L ATP測(cè)量時(shí)的相對(duì)發(fā)光對(duì)數(shù)值達(dá)到6. 5~7. 5 ;然后將帶0. 22 μ m濾膜的濾膜柱換至2. Oml無(wú)菌的離心管中，在濾膜柱中直接加0. ImlATP提取試劑EC振勻后室溫下作用I. 5~2. 5min，同一批測(cè)試包括空白樣均需一致，加入0. Iml⑶B發(fā)光測(cè)試緩沖液，10000r/min，離心30S，再加入0. Iml無(wú)菌超純水后，再次將濾膜柱上的ATP等試劑洗下，去掉濾膜柱，加入0. Iml復(fù)配后的ATP生物發(fā)光試劑置于ATP生物發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)試樣品發(fā)光值，同時(shí)進(jìn)行空白樣品的發(fā)光測(cè)試；(4)、細(xì)菌總數(shù)的計(jì)算：表面樣品發(fā)光值減去空白樣品發(fā)光值后通過(guò)發(fā)光曲線計(jì)算表面樣品的細(xì)菌總數(shù)，細(xì)菌總數(shù)TBC=NX (505X10 (A+BLogELU)) /3X 10_16 (個(gè)/升)，N=稀釋倍數(shù)，A，B為ATP發(fā)光試劑的標(biāo)準(zhǔn)ATP發(fā)光曲線測(cè)試后，ATP濃度和凈相對(duì)發(fā)光值取雙對(duì)數(shù)后獲得的線性回歸的發(fā)光方程的系數(shù)； (5)、評(píng)價(jià)：對(duì)低于空白樣品發(fā)光值103cfu/ml的表面樣品，按GMP工廠的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)均可以判斷為合格，高于空白樣品的發(fā)光值的樣品則直接通過(guò)發(fā)光曲線計(jì)算，和GMP標(biāo)準(zhǔn)比較即可判斷是否合格。
5.一種權(quán)利要求3或4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的ATP生物發(fā)光檢測(cè)儀為發(fā)光性能好、穩(wěn)定性好、線性檢測(cè)范圍較寬、檢測(cè)靈敏度以ATP計(jì)最高達(dá)到10_18molATP的高性能的ATP生物發(fā)光檢測(cè)儀。
6.一種檢測(cè)飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量的試劑盒，其特征在于，包括：ATP生物發(fā)光試劑及其復(fù)配緩沖液，GDB發(fā)光測(cè)試緩沖液，ATP提取劑EC，10^7mol/L標(biāo)準(zhǔn)ATP，無(wú)菌去ATP的超純水。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量的試劑盒，其特征在于，試劑盒中包括O. 45 μ m和O. 22 μ m的無(wú)菌一次性濾膜。
8.—種檢測(cè)GMP工廠表面衛(wèi)生的試劑盒，其特征在于，包括：無(wú)菌去ATP的擦拭緩沖液，ATP生物發(fā)光試劑及其復(fù)配緩沖液，⑶B發(fā)光測(cè)試緩沖液，ATP提取劑EC，10_7mol/L標(biāo)準(zhǔn)ATP，無(wú)菌去ATP的超純水。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)GMP工廠表面衛(wèi)生的試劑盒，其特征在于，試劑盒中包括2. OmL無(wú)菌透明離心管，IOXlOcm2可重復(fù)使用的不銹鋼絲材質(zhì)取樣框，均勻度一致的長(zhǎng)柄無(wú)菌棉拭，一次性無(wú)菌的 帶O. 22 μ m濾膜過(guò)濾柱的2. Oml純化濾膜柱。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或8所述的試劑盒，其特征在于，所述的GDB發(fā)光測(cè)試緩沖液含有.25mmol/L 甘氨酰甘氨酸，O. 5mmol/L EDTA，0. 5mmol/L DTT，α -環(huán)糊精 CD 的含量為 O. I ~.2.0%, ρΗ5· O ~7. 8 ;所述的 ATP 提取劑 EC 含有 I ~30g/L TritonX-100,0. I ~5. .Og/L 十六烷三甲基溴化銨，O. I~3. Og/L 二甲亞砜，0.01~O. lg/L乙二胺四乙酸，0.01~O. lg/L硫酸鎂；所述的無(wú)菌去ATP的擦拭緩沖液為用超純水配制的O~2. 0%酚醚磷酸酯TXP-10，經(jīng)去ATP滅菌處理；所述的復(fù)配緩沖液為含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，O. 5mmol/L EDTA,.O. 5mmol/L DTT，pH7. 2 ;所述的去ATP處理，具體為每25mL被處理試劑添加10 μ L10u/mL三磷酸腺苷雙磷酸酶，25~30°C室溫處理5min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/66GK103757089SQ201410013473
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】吳慧清, 吳清平, 李程思, 張菊梅, 郭偉鵬 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司