與甘薯耐鹽相關(guān)蛋白IbTPS及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了與甘薯耐鹽相關(guān)蛋白IbTPS及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的與植物耐逆性相關(guān)的蛋白，是如下（a）或（b）的蛋白質(zhì)：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由（a）衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的IbTPS基因所編碼的酶，該基因的表達(dá)能夠提高植物的耐逆性。本發(fā)明所提供的IbTPS蛋白及其編碼基因在提高海藻糖含量及甘薯耐逆性的研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明將在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。
【專利說明】與甘薯耐鹽相關(guān)蛋白IbTPS及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種與甘薯耐鹽相關(guān)蛋白IbTPS及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前世界耕地面積中至少有20%受到土壤鹽潰化的影響，并且有近50%可灌溉土壤也受到鹽潰化不同程度的影響。中國鹽堿土地的總面積超過3000萬hm2，其中已開墾的約600萬hm2，還有2000萬hm2以上鹽潰化土地等待開墾利用；此外，中國約有600萬hm2次生鹽潰化土壤,約占總耕地面積的10%。土地鹽潰化作為日益嚴(yán)重的環(huán)境問題之一,嚴(yán)重制約著農(nóng)業(yè)作物的生產(chǎn)。因此,深入研究植物的耐鹽機(jī)理,培育耐鹽作物新品種是利用鹽堿地資源最經(jīng)濟(jì)、有效的措施之一。
[0003]植物的耐鹽機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，它涉及到生長發(fā)育、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特征以及代謝調(diào)節(jié)等諸多方面。植物在鹽脅迫條件下，會(huì)采用一定的策略去阻止或減輕鹽的危害，在長期的進(jìn)化過程中，植物發(fā)展出了一系列的耐鹽機(jī)制。海藻糖(Trehalose)是一種非還原性二糖，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中，它不僅是碳水化合物儲(chǔ)存物質(zhì)，而且還具有保護(hù)生物細(xì)胞和生物活性物質(zhì)在脫水、干旱、高溫、冷凍等不良環(huán)境條件下免遭破壞的功能。海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase, TPS)參與了海藻糖的合成，首先由UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖在TPS催化下，合成海藻糖-6-磷酸(trehalose-6-phosPhate, T6P),然后再在海藻糖_6_磷酸磷酸酯酶(trehalose-6-phoshate phosphatase, TPP)的催化下脫磷酸,最終生成海藻糖。植物中的TPS基因都以基因家族的形式存在。目前，TPS基因相繼在擬南芥、水稻、煙草、馬鈴薯和番茄等植物中被發(fā)現(xiàn)，研究表明，將海藻糖合成相關(guān)基因TPS在以上植物中過量表達(dá)均可以有效提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽、抗`旱性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供與甘薯耐鹽相關(guān)蛋白IbTPS及其編碼基因。
[0005]本發(fā)明所提供的與甘薯耐鹽相關(guān)蛋白，名稱為IbTPS，來源于甘薯(Ipomoeabatatas),如下Ca)或(b)的蛋白質(zhì):
[0006](a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0007](b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性耐逆性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0008]上述序列2由859個(gè)氨基酸殘基組成。
[0009]上述蛋白中，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0010]編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0011]上述DNA分子是如下I) -3)中任一種的DNA分子:[0012]I)編碼區(qū)為序列表中序列I所示的DNA分子；
[0013]2)在嚴(yán)格條件下與I)所示的DNA分子雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子;
[0014]3)與I)的DNA分子至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
[0015]上述序列I由2580個(gè)堿基組成，其開放閱讀框(ORF)為自5'末端第1-2580位堿基，編碼氣基酸序列是序列表中序列2所的蛋白。
[0016]上述嚴(yán)格條件為:50°C，在7% SDS,0.5M NaPOjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65。。，0.1XSSC,0.1%SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0017]含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018]上述重組載體為將上述DNA分子替換掉表達(dá)載體pCB⑶S中的gusA報(bào)告基因得到的載體。
[0019]在本發(fā)明的實(shí)施例中，上述重組載體具體為將序列表中序列I所示的DNA分子取代pCB⑶S的BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)間的小片段(gusA報(bào)告基因)得到的重組載體。
[0020]所述載體pCB⑶S是通過包括如下步驟的方法得到的:
[0021](I)將pCAMBIA1301載體經(jīng)過HindIII和EcoRI雙酶切，回收11786bp載體大片段；
`[0022](2)將pBI121載體經(jīng)過HindIII和EcoRI雙酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；
[0023](3)將步驟(1)中回收的11786bp載體大片段與步驟(2)中回收的包含gusA基因的3032bp的片段連接，得到重組載體pCB⑶S。
[0024]其中，pCAMBIA1301載體購自CAMBIA公司；pBI121載體購自Clontech公司。
[0025]擴(kuò)增上述DNA分子全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026]所述引物對為如下I)或2)所示:
[0027]I)由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子組成的引物對；
[0028]2)由序列表中序列5所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子組成的引物對。
[0029]上述蛋白、上述DNA分子或上述表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0030]上述應(yīng)用中，上述調(diào)控植物耐逆性為提高植物耐逆性。
[0031]上述應(yīng)用中，上述耐逆性為耐鹽性；所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。上述雙子葉植物為煙草(Nicotiana tabacum)或甘薯(Ipomoea batatas)。
[0032]上述耐鹽性由增加植物株高、增加植物海藻糖含量和/或增加植物脯氨酸含量體現(xiàn)。
[0033]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0034]本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將編碼上述蛋白的DNA分子導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
[0035]編碼上述蛋白的DNA分子是通過所述重組載體導(dǎo)入目的植物中。
[0036]在上述方法中，所述耐逆性為耐鹽性；所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；上述雙子葉植物為煙草(Nicotiana tabacum)或甘薯(Ipomoea batatas)。
[0037]上述耐鹽性由增加植物株高、增加植物海藻糖含量和/或增加植物脯氨酸含量體現(xiàn)；
[0038]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了一種IbTPS蛋白及其編碼基因，將該基因?qū)胍吧蜔煵葜?，得到轉(zhuǎn)IbTPS煙草，將轉(zhuǎn)IbTPS煙草進(jìn)行鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)其與野生型煙草相比，耐鹽，具體體現(xiàn)在株高增加、海藻糖含量增加和脯氨酸含量增加。因此，可以看出，IbTPS基因及其所編碼的蛋白在植物對抗非生物脅迫的過程中起著重要的作用。本發(fā)明所提供的IbTPS蛋白及其編碼基因在提高植物耐鹽研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明將在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1為轉(zhuǎn)IbTPS煙草植株的PCR檢測結(jié)果圖
[0040]圖2為轉(zhuǎn)IbTPS煙草耐鹽表型結(jié)果圖
[0041]圖3為脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
[0042]圖4為轉(zhuǎn)IbTPS煙草植株脯氨酸含量
[0043]圖5為海藻糖離子色譜分析
[0044]圖6為轉(zhuǎn)IbTPS煙草植株海藻糖含量
【具體實(shí)施方式】
[0045]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0046]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0047]實(shí)施例1、與甘薯耐鹽相關(guān)蛋白IbTPS及其編碼基因的獲得
[0048]一、與耐鹽相關(guān)蛋白IbTPS及其編碼基因的獲得
[0049]實(shí)驗(yàn)材料:甘薯品種魯薯3號(hào)(公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是:翟紅，商麗麗，劉慶昌.甘薯莖線蟲誘導(dǎo)抑制差減雜交cDNA文庫的構(gòu)建及表達(dá)序列標(biāo)簽分析。農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，18 (1):141-148)無菌苗展開葉葉片取下，液氮速凍，_80°C保存。
[0050]1、葉片總RNA提取和純化
[0051]取魯薯3號(hào)無菌苗展開葉葉片約2g，在液氮中研磨成粉狀，加入IOmL離心管，用Applygen 植物 RNA 提取試劑盒(Applygen Technologies Inc, Bei jing)提取甘薯葉片總RNA，試劑盒中包括:Plant` RNA Reagent，植物組織裂解、分離RNA、去除植物多糖和多酚；Extraction Reagent,有機(jī)抽提去除蛋白質(zhì)、DNA、多糖和多酹；Plant RNA Aid,去除植物多糖多酚和次生代謝產(chǎn)物。利用 QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit (QIAGEN,GmbH,Germany)從總RNA中純化mRNA。最后，取I μ L于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，另取2 μ L稀釋至500μ L，用紫外分光光度計(jì)檢測其質(zhì)量(0D260)和純度(0D260/0D280)，提取的魯薯3號(hào)無菌苗葉片總RNA，經(jīng)非變性膠瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S和18S條帶清晰，且二者亮度比值為1.5~2: 1，表明總RNA沒有降解，純化所得mRNA符合實(shí)驗(yàn)要求，可用于甘薯TPS蛋白cDNA全長的克隆。
[0052]2、IbTPS蛋白cDNA的全長克隆
[0053]以本實(shí)驗(yàn)室獲得的IbTPS EST片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行IbTPS蛋白cDNA的全長克隆。
[0054](1)3' -RACE
[0055]以魯薯3號(hào)的葉片cDNA為模板，用IbTPS EST正向引物I和正向引物2及反向弓丨物3、反向引物4(反向引物3、反向引物4序列參照Invitrogen GeneRacer.RACE ReadycDNA Kit Manual, Version A)進(jìn)行PCR反應(yīng)。其中正向引物2在引物I的下游。引物序列如下:
[0056]引物序列如下:
[0057]引物1:5' -GGCATTTCCTCTCGTGTTGT-3'
[0058]引物2:5' -GGAGACTGAGGCGAAAGTTG-3'
[0059]引物3:5' -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'
[0060]引物4:5' -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3'
[0061]PCR得到的Y RACE片段，回收后連接pMD19-T載體(購自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 D102A)進(jìn)行 TA 克隆，以 BcaBESTTM Sequencing Primers/M13Primers 通用引物進(jìn)行測序。`
[0062](2) 5' -RACE
[0063]以魯薯3號(hào)cDNA為模板，用IbTPS EST正向引物5和正向引物6及反向引物
7、反向引物8(反向引物7、反向引物8序列參照Invitrogen5’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends, Version2.0)進(jìn)行PCR反應(yīng)。其中正向引物6在引物5的下游。引物序列如下:
[0064]引物5:5' -CACTCGATTAAACCGCTT-3'
[0065]引物6:5' -ACCCGAGCTTCACTCGATTA-3'
[0066]引物7:5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3'
[0067]引物8:5' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'
[0068]PCR得到的5’ RACE片段，回收后連接pMD19_T載體(購自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 D102A)進(jìn)行 TA 克隆，以 BcaBEST? Sequencing Primers/M13Primers 通用引物進(jìn)行測序。
[0069](3) PCR擴(kuò)增IbTPS蛋白cDNA的編碼區(qū)
[0070]利用DNAMAN7.0軟件拼接候選的甘薯IbTPS蛋白cDNA序列。進(jìn)一步設(shè)計(jì)正向引物9和反向引物10進(jìn)行PCR擴(kuò)增IbTPS蛋白cDNA的編碼區(qū)。引物序列如下:
[0071]引物9:5’-ATGGTGTCGAGATCATATTCAA-3’(序列 3)
[0072]引物10:5’-TTATAGAAGGGCTGTTTGTTGTT-3’(序列 4)
[0073]以魯薯3號(hào)cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)±曾，PCR條件為95 V Imin,隨后950C 20s, 53°C 20s和72°C 1.5min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得2580bp長度的擴(kuò)增片段。
[0074]經(jīng)過測序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列I所示的核苷酸，該序列所示的基因命名為IbTPS，該基因的編碼區(qū)為序列表中序列I自5'端第1-2580位核苷酸；序列表中序列I由2580個(gè)堿基組成；該基因編碼的蛋白命名為IbTPS，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2 ;序列表中序列2由859個(gè)氨基酸殘基組成。
[0075]實(shí)施例2、IbTPS蛋白在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用
[0076]一、轉(zhuǎn)IbTPS煙草的獲得
[0077]1、重組載體pCBIbTPS的構(gòu)建
[0078]根據(jù)甘薯IbTPS蛋白cDNA的編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼序列的引物序列，正反向引物分別引入BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)，引物序列如下:
[0079]引物11:5，GGGATCC ATGGTGTCGAGATCATATTCAA’(序列 5)(下劃線部分為 BamH I酶切位點(diǎn))，
[0080]引物12:5’TCGAGCTC TTATAGAAGGGCTGTTTGTTGTT3’ (序列 6)(下劃線部分為 SacI酶切位點(diǎn))。
[0081]以人工合成的序列表中序列I所示的DNA分子為模板(或以魯薯3號(hào)cDNA為模板)，用引物11和引物12進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2595bp的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt Simple載體(購自北京全氏金生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為CB111-01)上，命名為pEASY-TPS載體，進(jìn)行SR Primer/M13F測序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列I所示的核苷酸；保證甘薯IbTPS蛋白cDNA的閱讀框及酶切位點(diǎn)的正確。
[0082]用Sac I和BamH I酶切載體pCB⑶S，回收12926bp載體大片段；同時(shí)，用Sac I和BamH I酶切載體pEASY_TPS，回收約2.5kb中間片段；將回收12926bp載體大片段與約2.5kb中間片段連接，得到重組載體pCBIbTPS。
`[0083]將重組載體pCBIbTPS轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為⑶201-01)，37°C培養(yǎng)20h，進(jìn)行重組載體的PCR分析和酶切鑒定，并進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序結(jié)果表明，重組載體pCBIbTPS為將序列表中序列I所示核苷酸取代載體PCBGUS的BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)間的片段(替換掉gusA報(bào)告基因)得到的載體，即為植物表達(dá)載體。
[0084]上述pCB⑶S載體是通過包括如下步驟的方法得到的:
[0085](I)將pCAMBIA1301載體(購自CAMBIA公司)經(jīng)過Hind III和EcoR I雙酶切，回收11786bp的載體大片段；
[0086](2)將pBI121載體(購自Clontech公司；含35S啟動(dòng)子，gusA報(bào)告基因，nos終止子片段)也經(jīng)過Hind III和EcoR I雙酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；
[0087](3)將步驟(1)中回收的11786bp載體大片段與步驟(2)中回收的包含gusA基因的3032bp的片段經(jīng)T4DNA酶連接，得到重組載體pCB⑶S。
[0088]2、重組載體pCBIbTPS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0089](I)從_80°C低溫冰箱中取出200 μ L ΕΗΑ105感受態(tài)細(xì)胞(購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)，置冰上融化，加入I μ g上述步驟I得到的重組載體pCBIbTPS，混勻；
[0090](2)液氮冷凍 lmin,37°C溫育 5min ；
[0091](3)加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)2_6h ；
[0092](4)取100 μ L菌液至LB固體培養(yǎng)基上(含100 μ g/mL利福平(Rif) >25 μ g/mL卡那霉素(Kan))，涂布均勻，將培養(yǎng)皿封口。倒置培養(yǎng)皿28°C培養(yǎng)2d ；
[0093](5)PCR鑒定呈陽性(引物為引物11和引物12，得到2595bp的為陽性)的單菌落命名為 EHA105/pCBIbTPS ;將 EHA105/pCBIbTPS 接種到含有 100 μ g/mL Rif、25 μ g/mL Kan 的LB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)30h至對數(shù)生長期，取適量農(nóng)桿菌用液體MS培養(yǎng)基稀釋30倍備用，即得到EHA105/pCBIbTPS農(nóng)桿菌菌液。
[0094]3、轉(zhuǎn)IbTPS煙草的獲得
[0095]I)轉(zhuǎn)化
[0096]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將IbTPS cDNA的編碼序列導(dǎo)入到煙草品種cv.Wisconsin38(以下也稱為野生型煙草；Wang LJ, He SZ, Zhai H, Liu DG, Wang YN, Liu QC:Molecularcloning and functional characterization of a salt tolerance-associated geneIbNFUlfrom sweetpotat0.Journal of Integrative Agriculture, 2012,12 (1):101-108;公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得)中，具體方法如下:
[0097](I)取經(jīng)過繼代培養(yǎng)6周的野生型煙草無菌苗葉片，在超凈臺(tái)中，切下5 X 5mm的煙草葉盤(去掉主葉脈)，懸浮于上述步驟2制備好的EHA105/pCBIbTPS農(nóng)桿菌菌液中，IOmin后將菌液吸出，將侵染過的煙草葉盤接種培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基(1.0mg/16-BA.0.lmg/1 NAA的MS)上。28°C、黑暗，共培養(yǎng)3d。
[0098](2)將共培養(yǎng) 3d后的煙草葉盤用含有 500mg/l CarbU.0mg/16_BA、0.lmg/lNAA 的MS液體培養(yǎng)基洗滌2次后，將煙草葉盤轉(zhuǎn)至含有1.0mg/16-BA.0.lmg/1 NAA、6mg/l PPT的固體MS培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為27°C、每日13h、30001x的光照。培養(yǎng)4周后，將不定芽轉(zhuǎn)移至含有1.0mg/16-BA,0.lmg/1 NAA、6mg/l PPT的1/2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行不定根誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件為27°C、每日13h、30001x的光照。4周后，形成完整的再生植株，得到Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草。
[0099]采用同樣的方法將空載體pCBGUS轉(zhuǎn)入野生型煙草中，得到Ttl代轉(zhuǎn)空載體煙草。
`[0100]2)分子鑒定
[0101]用CTAB法提取Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草、Ttl代轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草的基因組DNA作為模板，用常規(guī)方法進(jìn)行PCR檢測，所使用的IbTPS基因引物為引物9 (序列表中序列3)和引物10 (序列表中序列4)。在0.2ml Eppendorf離心管中加入10XPCR buffer2 μ 1>4dNTP(10mol/L) I μ 1、引物(10ymol/l)均為 I μ 1、模板 DNA (50ng/ul) 2 μ 1、Taq DNA 聚合酶0.25ul，加H2O至總體積20 μ I。反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30S，55°C復(fù)性30S，72°C延伸2min，共35個(gè)循環(huán)。
[0102]電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果見圖1 (泳道M為Maker:泳道W野生型煙草植株；泳道P為陽性對照(重組質(zhì)粒pCBIbTPS);泳道C為Ttl代轉(zhuǎn)空載體煙草植株；泳道TLl-泳道TL5為Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草)，可以看出，得到2580bp的為陽性Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草，泳道TLl-泳道TL5所示的Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草均為陽性，表明IbTPS基因已經(jīng)整合到煙草的基因組中，并證明這些再生植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株。Ttl代轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草均無目的片段。
[0103]將經(jīng)鑒定為陽性的編號(hào)為TL1、TL2、TL5的Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草擴(kuò)繁，進(jìn)行下述耐鹽性鑒定及相關(guān)生理指標(biāo)的測定。
[0104]二、轉(zhuǎn)IbTPS煙草植株的耐鹽鑒定
[0105]1、表型鑒定
[0106]將編號(hào)為TL1、TL2、TL5的Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草植株、T0代轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草植株(CK)分別培養(yǎng)在含有200mmol/L NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為27°C，每天13h、3000lux光照。培養(yǎng)30天后觀察植株的生長狀況。每個(gè)株系3株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0107]結(jié)果如圖2所示，可以看出，編號(hào)為TL1、TL2、TL5的Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草植株比野生型對照植株生長明顯旺盛，表明其耐鹽性明顯增強(qiáng)。
[0108]同時(shí)統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型煙草植株的株高，結(jié)果如下:
[0109]編號(hào)為TLl的Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草的株高為9.8厘米；
[0110]編號(hào)為TL2的Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草的株高為13.4厘米；
[0111]編號(hào)為TL5的Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草的株高為9.6厘米；
[0112]野生型煙草的株高為7.5厘米。
[0113]T0代轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草結(jié)果無顯著差異。
[0114]2、脯氨酸含量的測定
[0115]植物在正常條件下，游離脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低溫、鹽等脅迫時(shí)，游離的氨基酸便會(huì)大量積累，并且積累指數(shù)和植物的耐逆性有關(guān)。因此，脯氨酸可以作為植物耐逆性的一項(xiàng)生化指標(biāo)。
[0116]對上述用含有200mmol/L NaCl的1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)30天的編號(hào)為TL1、TL2、TL5的Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草植株、T0代轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草植株(CK)進(jìn)行脯氨酸含量的測定，測定方法參照鄒琦(植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2000)，具體如下:
[0117]I)脯氨酸含量的測`定
[0118](I)脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
[0119]①取7支試管按照下表1加入各試劑?；靹蚝笊w上蓋子，在沸水中加熱40min。
[0120]表1為7支試管加入試劑組分
[0121]
管號(hào)0123456
標(biāo)準(zhǔn)脯氧酸 0.00U UU4U0.801,20I 6U2,00
水2.001.801.601.200.800.400.00
J1 水醋酸2,002,002.002.002,002.002.00
? 示 ?夜3.003.003.003.003.003.003.00
脯氨酸含量 0.002 UU4.008.0012.0016.0020.00
[0122]②取出冷卻后向各管中加入5mL甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層以O(shè)號(hào)管為對照在波長520nm測OD值。
[0123]③以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，脯氨酸含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。
[0124](2)轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸含量的測定:
[0125]A、稱取上述用含有200mmol/L NaCl的1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)30天的編號(hào)為TL1、TL2、TL5的Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草植株、Ttl代轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草植株(CK)葉片1.0g，剪碎，加入5ml80%乙醇于研缽中研磨成勻衆(zhòng)；
[0126]B、將勻漿液體全部轉(zhuǎn)移至25ml刻度的試管中，加水補(bǔ)足25ml，混勻，80°C水浴提取 20min ；[0127]C、加入0.5g人造沸石，0.2g活性炭，于振蕩器上振蕩Imin混勻，過濾；
[0128]D、取2.5ml濾液，按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定各個(gè)樣品的OD值；
[0129]E、從制作得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線上檢出Iml被測樣品脯氨酸的含量，最后按照下式換算得到游離脯氨酸的平均含量:
[0130]脯氨酸含量(μg/g FW) = (CXV/a) /Fff
[0131]C:提取液中脯氨酸量值(μ g)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查值；
[0132]V:提取液總體積(ml);
[0133]a:測定液體積(ml);
[0134]FW:樣品鮮重(g)。
[0135]結(jié)果如圖4，CK為野生型煙草，
[0136]編號(hào)為TL1、TL2、TL5的Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草植株的脯氨酸含量為78.195,96.409、58.945 μ g/g Fff ；
[0137]野生型煙草植株的脯氨酸含量為42.282 μ g/g Fff ；
[0138]T0代轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草結(jié)果無顯著差異。
[0139]可以看出，在鹽脅迫下，與野生型煙草相比，編號(hào)為TL1、TL2、TL5的Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草植株的脯氨酸含量高于野生型煙草，說明轉(zhuǎn)IbTPS煙草的耐鹽性高于野生型煙草。
`[0140]3、海藻糖含量測定
[0141]在脅迫環(huán)境下，海藻糖能夠阻止細(xì)胞磷脂雙分子膜由液晶態(tài)向固態(tài)轉(zhuǎn)變，穩(wěn)定蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)，從而增加細(xì)胞對逆境的抵抗力。
[0142]對上述用含有200mmol/L NaCl的1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)30天的編號(hào)為TL1、TL2、TL5的Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草植株、T0代轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草植株(CK)進(jìn)行海藻糖含量的測定，測定方法參照 Jang( Jang IC, Oh SJ, Seo JS, et al.Expression of a bifunctionalfusion of the Escherichia coli genes for trehalose—6-phosphate synthase andtrehalose-6-phosphate phosphatase in transgenic rice plants increases trehaloseaccumulation and abiotic stress tolerance without stunting growth.PlantPhysiology, 2003，131:516 ~524)，具體如下:
[0143]取上述脅迫處理的葉片Ig研磨成勻漿后，用4mL80%的甲醇溶解并在超聲儀中超聲20min,隨后在12，000 Xg離心IOmin,然后用0.45 μ m孔徑的過濾器過濾。利用高性能離子色譜法(DX500HPIC system)進(jìn)行海藻糖含量測定(圖5，A為海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品；B為CK ；C為TLl ；D為TL2 ；E為TL5，海藻糖出峰位置為I)。以Sigma公司的分析純海藻糖作為標(biāo)準(zhǔn)樣。按照下式換算得到海藻糖的相對含量:
[0144]海藻糖含量(μg/g Fff) =(Ax/As X Cs X V) /m
[0145]Αχ—樣品峰面積
[0146]As-標(biāo)樣峰面積
[0147]Cs—標(biāo)樣濃度
[0148]V—提取的體積
[0149]m—樣品質(zhì)量
[0150]結(jié)果如圖6，編號(hào)為TL1、TL2、TL5的Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草植株的海藻糖含量為18.647,37.405,15.273 μ g/g Fff ；[0151]野生型煙草植株的海藻糖含量為5.631 μ g/g Fff ；
[0152]T0代轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草結(jié)果無顯著差異。
[0153]可以看出，在鹽脅迫下，與野生型煙草相比，編號(hào)為TL1、TL2、TL5的Ttl代轉(zhuǎn)IbTPS煙草植株的海藻糖含量高于野生型煙草，說明轉(zhuǎn)IbTPS煙草的耐鹽性高于野生型煙草。
[0154]上述轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸和海藻糖含量的測定結(jié)果表明，同非轉(zhuǎn)化對照植株相比，表達(dá)IbTPS基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐鹽性顯著提高，說明蛋白IbTPS及其編碼基因可用來調(diào)控植物耐逆性，尤其是提`高植物耐鹽性。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子為如下I)_3)中任一所述的DNA分子: 1)編碼區(qū)為序列表中序列I所示的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)所不的DNA分子雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子； 3)與I)的DNA分子至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述DNA分子的全長或其任一片段的引物對。
6.權(quán)利要求2所述的蛋白、權(quán)利要求2或3所述DNA分子或權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 系或重組菌在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述耐逆性為耐鹽性；所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為煙草(Nicotiana tabacum)或甘薯(Ipomoeabatatas)。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子導(dǎo)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子是通過權(quán)利要求4所述的重組載體導(dǎo)入目的植物中； 所述耐逆性為耐鹽性。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于: 所述耐鹽性由增加植物株高、增加植物海藻糖含量和/或增加植物脯氨酸含量體現(xiàn)； 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為煙草。
【文檔編號(hào)】C12N9/10GK103725657SQ201410007006
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】劉慶昌, 翟紅, 何紹貞, 姜濤 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)