選擇方法和重組微生物及其用途
【專利摘要】微生物存活所需的維生素或其它必需營養(yǎng)素的生物合成途徑中的一種或多種基因可被用作有效的選擇標(biāo)記，以鑒定用外源核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。所述微生物天然不含有或不表達(dá)所述一種或多種基因。這使得可進(jìn)行遺傳操作。其允許進(jìn)行低成本的發(fā)酵。其允許生產(chǎn)用于隨后的商業(yè)用途的必需營養(yǎng)素。
【專利說明】選擇方法和重組微生物及其用途
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年5月23日提交的美國臨時申請No. 61/650, 757的優(yōu)先權(quán)， 其內(nèi)容以引用的方式全文納入。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及重組微生物，用于通過發(fā)酵產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物的方法，和選擇方法。

【背景技術(shù)】
[0004] 選擇（或選擇性的）標(biāo)記和試劑對遺傳修飾細(xì)胞或微生物是重要的。它們可用于 篩選帶有引入的DNA的細(xì)胞：選擇標(biāo)記保護(hù)生物體不受通常將會殺滅該生物體或防止其生 長的選擇劑的存在與否的影響。通常，將抗生素抗性基因用作選擇標(biāo)記，并將相應(yīng)的抗生素 用作選擇劑。
[0005] 比如抗生素的選擇劑的使用顯著增加比如工業(yè)發(fā)酵過程的成本。一些抗生素還不 溶于水或僅是難溶于水，而需要溶于溶劑。這進(jìn)一步增加了成本，并可能對微生物細(xì)胞有副 作用；例如，氯霉素和甲砜霉素需分別溶于乙醇或二甲基甲酰胺（DMF)。
[0006] -些生物體也對某些抗生素具有天然抗性，因此這些抗生素不能用作選擇劑。例 如，大多數(shù)抗生素類別只對抗革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌有活性，因為它們靶向細(xì)胞壁化 合物，并且若干屬具有天然的抗特定抗生素的抗性（例如，梭菌屬（Clostridia)可以抗氯 霉素，因為它們具有賦予抗性的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，并且還能還原分子的芳基-硝基 殘基從而使其失去活性（〇' Brien&Morris, 1971，J Gen Microbiol, 67:265-271))。
[0007] 此外，在一般過程條件下，一些抗生素物質(zhì)將失活或不能使用。例如，在若干發(fā) 酵方法中使用的4-5. 5之間的低pH使大環(huán)內(nèi)酯紅霉素失活，而另一方面，其類似物克拉 霉素只在小于 2 的極低 pH 下溶解（Mermelstein&Papoutsakis, 1993, FEMS Microbiol Lett, 113:71-76)。
[0008] 可補(bǔ)償不能代謝某些氨基酸、核苷酸或糖的能力的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記也可用于選 擇。但是，這些也需要向培養(yǎng)基中添加原本不需要的化合物，從而增大花費(fèi)。
[0009] 在產(chǎn)生重組微生物的過程中，也已將報告基因用于允許選擇成功的轉(zhuǎn)化體；例如 編碼綠色熒光蛋白或β-半乳糖苷酶（IacZ)的基因。但是，這些可能對細(xì)胞有毒性，并且 所產(chǎn)生的產(chǎn)物在商業(yè)發(fā)酵反應(yīng)中是不合需要的。
[0010] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的一個或多個缺點，或至少為公眾提供有用的選 擇。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明整體提供了，尤其是，用于通過對底物的微生物發(fā)酵而產(chǎn)生一種或多種產(chǎn) 物的方法，用于此類方法的經(jīng)遺傳修飾的微生物，適于制備經(jīng)遺傳修飾的微生物的核酸，以 及用于在混合的微生物群中選擇某些微生物或防止不合需要的微生物生長的方法。
[0012] 在第一方面，本發(fā)明提供了重組微生物，所述重組微生物包含被改造為適于表達(dá) 一種或多種維生素生物合成途徑中的一種或多種酶的至少一種外源核酸，以使得所述重組 微生物可產(chǎn)生所述一種或多種維生素，其中所述重組微生物是厭氧菌。
[0013] 在一個實施方案中，所述至少一種外源核酸編碼一種或多種基因，所述一種或多 種基因編碼所述一種或多種維生素生物合成途徑中的一種或多種酶。
[0014] 在一個實施方案中，所述一種或多種維生素是微生物生長所需要的。在一個實施 方案中，所述一種或多種維生素是微生物生長所必需的。
[0015] 在一個實施方案中，所述至少一種外源核酸包含衍生出所述重組微生物的親代微 生物中所缺乏的一種或多種基因。
[0016] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了重組微生物，所述重組微生物能夠產(chǎn)生一種或 多種維生素生物合成途徑的一種或多種酶，所述微生物包含編碼所述一種或多種酶的一種 或多種外源核酸，其中所述重組微生物衍生自缺乏編碼所述一種或多種酶的一種或多種核 酸的親代微生物。
[0017] 在一個實施方案中，所述一種或多種維生素選自硫胺素、泛酸鹽、核黃素、煙酸、批 哆醇、生物素、葉酸和氰鈷胺素。在一個具體的實施方案中，所述維生素是硫胺素（BI)和/ 或泛酸鹽（B5)。
[0018] 在一個實施方案中，所述一種或多種酶選自下文描述的組。在一個具體的實施方 案中，所述一種或多種酶選自硫胺素生物合成蛋白ThiC(EC 4. 1.99. 17)、3_甲基-2-氧代 丁酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶PanB(EC 2. 1.2. 11)、泛酸-β-丙氨酸連接酶PanC(EC 6. 3. 2. 1)以及天 冬氨酸1-脫羧酶Pan D (EC 4. 1.1. 11)。在一個實施方案中，所述酶是ThiC。在另一個實 施方案中，所述一種或多種酶是PanB、PanC和PanD的組合。
[0019] 在一個實施方案中，所述微生物選自包含在一個具體的實施方案中，所述 微生物選自以下：梭菌屬（Clostridium)、真細(xì)菌屬（Eubacterium)、消化鏈球菌屬 (Peptostreptococcus)、消化球菌屬（Peptococcus)、放線菌屬（Actinomyces)、乳桿菌屬 (Lactobacillus)、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium)、丙酸桿菌屬（Propionibacterium)、擬 桿菌屬（Bacteriodes)、梭桿菌屬（Fusobacterium)、彎曲桿菌屬（Campylobacter)或韋永 氏球菌屬（Veillonella)。
[0020] 在一個實施方案中，微生物是一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌。
[0021] 在一個具體的實施方案中，微生物選自自產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)、楊氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌（Clostridium drakei)、|^味梭菌（Clostridium scatologenes)、醋酸梭菌（Clostridium aceticum)、蟻 酸醋酸梭菌（Clostridium formicoaceticum)、大梭菌（Clostridium magnum)、甲基營養(yǎng)丁 酸桿菌（Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏醋酸桿菌（Acetobacterium woodii)、 巴氏嗜喊菌（Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、游泥真桿菌（Eubacterium Iimosum)、熱醋穆爾氏菌（Moorella thermoacetica)、熱自養(yǎng)穆爾氏菌（Moorella thermautotrophica)、卵形鼠抱菌（Sporomusa ovata) > Sporomusa silvacetica、球形鼠 抱菌（Sporomusa sphaeroides)、普氏產(chǎn)醋桿菌（Oxobacter pfennigii)和凱伍熱厭氧菌 (Thermoanaerobacter kiuvi)〇
[0022] 在一個實施方案中，所述微生物為自產(chǎn)乙醇梭菌或楊氏梭菌。在一個具體的實施 方案中，所述微生物為自產(chǎn)乙醇梭菌DSM23693。在另一個具體的實施方案中，所述微生物為 楊氏梭菌 DSM13528 (或 ATCC55383)。
[0023] 在一個具體的實施方案中，所述微生物選自自產(chǎn)乙醇梭菌或楊氏梭菌，并且所述 酶是ThiC。在另一個具體的實施方案中，所述微生物是自產(chǎn)乙醇梭菌、楊氏梭菌、拉氏梭菌 或伍氏醋酸桿菌，并且所述酶是PanB、PanC和PanD。
[0024] 在一個實施方案中，本發(fā)明包括不需要補(bǔ)充任何維生素的重組細(xì)菌。
[0025] 在第二方面，本發(fā)明提供了核酸，所述核酸編碼產(chǎn)生一種或多種維生素的一種或 多種生物合成途徑中的一種或多種酶。
[0026] 在一個實施方案中，所述核酸編碼兩種或更多種酶。在一個實施方案中，本發(fā)明的 核酸編碼3、4、5或6種此類酶。
[0027] 在一個實施方案中，所述一種或多種維生素選自硫胺素、泛酸鹽、核黃素、煙酸、批 哆醇、生物素、葉酸和氰鈷胺素。在一個具體的實施方案中，所述維生素是硫胺素（BI)或泛 酸鹽（B5)。
[0028] 在一個實施方案中，所述一種或多種酶如后文所述。
[0029] 在第三方面，本發(fā)明提供了包含第二方面的一種或多種核酸的核酸構(gòu)建體或載 體。
[0030] 在一個具體的實施方案中，所述核酸構(gòu)建體或載體是表達(dá)構(gòu)建體或載體。在一個 具體的實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體或載體是質(zhì)粒。
[0031] 在第四方面，本發(fā)明提供了包含任一種或多種第二方面的核酸或第三方面的載體 或構(gòu)建體的宿主生物體。
[0032] 在第五方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含如本發(fā)明的第三方面提及的表達(dá)構(gòu)建 體或載體，和甲基化構(gòu)建體或載體。
[0033] 優(yōu)選地，所述組合物能夠產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的第一方面的重組微生物。
[0034] 在一個具體的實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體/載體和/或甲基化構(gòu)建體/載體是 質(zhì)粒。
[0035] 在第六方面，本發(fā)明提供了通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物的方法，所述微 生物發(fā)酵包括使用本發(fā)明第一方面的重組微生物發(fā)酵底物。
[0036] 在一個實施方案中，所述底物選自包括C0、二氧化碳和氫氣、甘油、脂肪酸、淀粉、 糖蜜、戊糖和己糖、生物質(zhì)的底物。
[0037] 在一個具體的實施方案中，所述底物是包含CO的底物。在所述實施方案中，本發(fā) 明的方法可用于減少工業(yè)過程的總大氣碳排放。
[0038] 優(yōu)選地，所述發(fā)酵包括在生物反應(yīng)器中使用本發(fā)明的重組微生物發(fā)酵底物從而產(chǎn) 生一種或多種產(chǎn)物的步驟。
[0039] 在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟：
[0040] (a)向包含本發(fā)明的一種或多種微生物的培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器提供底物；以及
[0041] (b)通過所述生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)物的厭氧發(fā)酵而產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物。
[0042] 在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟：
[0043] (a)在由工業(yè)過程產(chǎn)生的含CO的氣體被釋放到大氣中之前，將所述氣體捕獲；
[0044] (b)通過培養(yǎng)物厭氧發(fā)酵所述含CO的氣體以產(chǎn)生所述一種或多種產(chǎn)物，所述培養(yǎng) 物包含一種或多種本發(fā)明第一方面的微生物。
[0045] 在所述方法方面的具體的實施方案中，將所述微生物維持在含水培養(yǎng)基中。
[0046] 在所述方法方面的具體的實施方案中，所述底物的發(fā)酵在生物反應(yīng)器中進(jìn)行。
[0047] 在具體的實施方案中，所述含CO的底物是含CO的氣態(tài)底物。在一個實施方案中， 所述底物包含工業(yè)廢氣。在某些實施方案中，所述氣體是鋼廠廢氣或合成氣。
[0048] 在一個實施方案中，所述底物通常會包含大比例的C0,例如至少約20體積％到約 100體積％、20體積％到70體積％、30體積％到60體積％以及40體積％到55體積％的 C0。在具體的實施方案中，所述底物包含約25體積％、或約30體積％、或約35體積％、或 約40體積％、或約45體積％或約50體積％的C0,或約55體積％或約60體積％的C0。
[0049] 在某些實施方案中，所述方法還包括從發(fā)酵液中回收所述一種或多種產(chǎn)物中的一 種或多種的步驟。
[0050] 在某些實施方案中，所述一種或多種產(chǎn)物包括乙醇、乙酸、丁醇、異丙醇、一種或多 種維生素、丙酮和2, 3-丁二醇。
[0051] 在一個具體的實施方案中，所述一種或多種產(chǎn)物是一種或多種維生素。
[0052] 在一個實施方案中，將所述一種或多種產(chǎn)物（在一個實施方案中是維生素）從發(fā) 酵中回收，并傳送到一個或多個其他生物反應(yīng)器以支持一種或多種第二微生物的生長，或 支持一種或多種第二微生物對底物的發(fā)酵。
[0053] 在一個實施方案中，所述一種或多種第二微生物是不能產(chǎn)生或不能以足夠的水平 產(chǎn)生所述一種或多種產(chǎn)物（在一種實施方案中是維生素）的微生物，并需要向其生長或發(fā) 酵培養(yǎng)基補(bǔ)充所述一種或多種產(chǎn)物（在一個實施方案中是維生素）以確?；蚓S持生長或發(fā) 酵，或提高生長或發(fā)酵效率。
[0054] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法還可包含由所述一種或多種第二微生物對底物 的發(fā)酵以產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物。在一個實施方案中，然后可從發(fā)酵液中回收所述一種或多 種產(chǎn)物。
[0055] 在第七方面，本發(fā)明提供了通過第六方面的方法產(chǎn)生的一種或多種產(chǎn)物。在某些 實施方案中，所述一種或多種產(chǎn)物包括乙醇、乙酸、丁醇、異丙醇、一種或多種維生素、丙酮、 2, 3-丁二醇。
[0056] 在第八方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明第一方面的微生物的方法，所述方法 包括用一種或多種外源核酸轉(zhuǎn)化親代微生物，所述外源核酸被改造為適于表達(dá)在產(chǎn)生一種 或多種維生素的一種或多種維生素生物合成途徑中的一種或多種酶。
[0057] 在某些實施方案中，所述一種或多種維生素和酶如后文所述。
[0058] 在第九方面，本發(fā)明提供了用于在混合的微生物群中選擇微生物A的方法，其中 微生物A是包含至少一種外源核酸的重組微生物，所述外源核酸被改造為適于表達(dá)在產(chǎn)生 一種或多種所述微生物生長所需的維生素的一種或多種維生素生物合成途徑中的一種或 多種酶，以使得所述微生物A可產(chǎn)生所述一種或多種維生素，所述方法包括使混合的微生 物群經(jīng)受包括缺乏所述一種或多種維生素的培養(yǎng)基的生長條件。
[0059] 在一個實施方案中，所述一種或多種維生素是微生物生長所必需的。
[0060] 在一個實施方案中，所述至少一種外源核酸編碼一種或多種基因，所述一種或多 種基因編碼在一種或多種維生素生物合成途徑中的一種或多種酶。
[0061] 在一個實施方案中，所述一種或多種維生素如前文所述。
[0062] 在一個實施方案中，所述一種或多種酶如后文所述。
[0063] 在一個實施方案中，所述培養(yǎng)基選自適于培養(yǎng)一種或多種微生物的任何合適的培 養(yǎng)基。
[0064] 在一個實施方案中，在產(chǎn)生重組微生物的過程中，進(jìn)行所述方法以區(qū)分重組與非 重組微生物。
[0065] 在另一個實施方案中，在微生物A的生長和/或?qū)Φ孜锇l(fā)酵的過程中，進(jìn)行所述方 法以負(fù)選擇（select against)污染性微生物。
[0066] 在第十方面，本發(fā)明提供了防止一種或多種不合需要的微生物在微生物培養(yǎng)物或 發(fā)酵液中生長的方法，其中所述微生物培養(yǎng)物或發(fā)酵液包含微生物A和營養(yǎng)培養(yǎng)基，其中 微生物A是包含至少一種外源核酸的重組微生物，所述外源核酸被改造為適于表達(dá)在產(chǎn)生 一種或多種微生物A和不合需要的微生物生長所需的維生素的一種或多種維生素生物合 成途徑中的一種或多種酶，以使得微生物A可產(chǎn)生所述一種或多種維生素，其中所述培養(yǎng) 基缺乏所述微生物生長所需的所述一種或多種維生素。
[0067] 在第十一方面，本發(fā)明提供了用于微生物A的選擇性生長或培養(yǎng)的方法，并且其 中微生物A是包含至少一種外源核酸的重組微生物，所述核酸被改造為適于表達(dá)在產(chǎn)生一 種或多種微生物生長所需的維生素的一種或多種維生素生物合成途徑中的一種或多種酶， 以使得微生物A可產(chǎn)生所述一種或多種維生素，并且其中所述生長或培養(yǎng)培養(yǎng)基缺乏所述 一種或多種維生素。
[0068] 在一個實施方案中，所述條件負(fù)選擇一種或多種不合需要的微生物的生長。
[0069] 在第十二方面，本發(fā)明提供了用于通過微生物A對底物進(jìn)行的微生物發(fā)酵而產(chǎn)生 一種或多種產(chǎn)物的方法，其中微生物A是包含至少一種外源核酸的重組微生物，，所述核酸 被改造為適于表達(dá)在產(chǎn)生一種或多種微生物生長所需的維生素的一種或多種維生素生物 合成途徑中的一種或多種酶，以使得微生物A可產(chǎn)生所述一種或多種維生素，并且其中發(fā) 酵在缺乏所述一種或多種維生素的生長培養(yǎng)基之中或之上進(jìn)行。
[0070] 在一個實施方案中，所述條件正選擇（select for)微生物A的生長并且負(fù)選擇一 種或多種不合需要的微生物的生長。
[0071] 本發(fā)明的第九、十、十一和十二方面的微生物可選自任何目的微生物，并且不限于 厭氧菌。但是，在一個實施方案中，它們選自厭氧微生物。在一個實施方案中，它們選自一 氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌。
[0072] 微牛物及其牛長
[0073] 想到了分離的、經(jīng)遺傳工程改造的、一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌。這些細(xì)菌可借助維 生素生物合成途徑中的外源生物合成基因而成為對硫胺素、泛酸鹽、核黃素、煙酸、吡哆醇、 生物素、葉酸和/或氰鈷胺素原養(yǎng)型的。例如，可用外源thiC基因和/或外源panBCD基因 簇將營養(yǎng)缺陷型轉(zhuǎn)化為原養(yǎng)型。在多個實施方案中，細(xì)菌可以是自產(chǎn)乙醇梭菌、楊氏梭菌、 拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、糞味梭菌、甲基營養(yǎng)丁酸桿菌、伍氏醋酸桿菌、巴氏 嗜喊菌、Blautia producta、游泥真桿菌、熱醋穆爾氏菌、熱自養(yǎng)穆爾氏菌、普氏產(chǎn)醋桿菌或 凱伍熱厭氧菌。在某些實施方案中，它們是梭菌屬細(xì)菌，如楊氏梭菌、自產(chǎn)乙醇梭菌、拉氏 梭菌和食一氧化碳梭菌。任選地，在不存在所述外源thiC基因的情況下，所述細(xì)菌不能將 1_(5' -磷酸核糖）-5-氨基咪唑核糖核苷酸（AIR)轉(zhuǎn)化成4-氨基-5-羥甲基-2-甲基嘧 啶。想到了來自拉氏梭菌的外源thiC基因，并在下文示例性示出。所述外源thiC基因可 以在質(zhì)粒上，以使得所述細(xì)菌在質(zhì)粒消除時為硫胺素營養(yǎng)缺陷型的?；蛘撸氲搅怂黾?xì)菌 在質(zhì)粒消除時為泛酸鹽營養(yǎng)缺陷型的。在某些實施方案中，想到了分離的、經(jīng)遺傳工程改造 的一氧化碳營養(yǎng)型細(xì)菌。在某些實施方案中，所述細(xì)菌可以是拜氏梭菌（C. beijerinckii)、 丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum)、糖丁醇丙酮梭菌（C. saccharoperbutylacetonicum)、 發(fā)酵植物多糖梭菌（C. phytofermentans)、熱纖梭菌（C. thermocellum)、噬纖維梭菌 (C. cellulovorans)、解纖維梭菌（C. cellulolyticum)。
[0074] -種可以使用的特定外源panB⑶基因簇來自拜氏梭菌（C. beijerenckei)。
[0075] 通過在含有氣態(tài)碳源的培養(yǎng)基中生長，可培養(yǎng)所述分離的、經(jīng)遺傳工程改造的一 氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌；碳源可以包含C0。類似地，所述細(xì)菌可在含有包含CO的能源的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)。想到了所述培養(yǎng)可以是嚴(yán)格厭氧的。還想到了如果細(xì)菌包含外源thiC基因， 則所述培養(yǎng)基可以不含硫胺素。在一些實施方案中，細(xì)菌將包含外源PanB⑶基因簇并且所 述培養(yǎng)基將不含泛酸鹽。在其它實施方案中，所述細(xì)菌將包含生物合成途徑中的一種或多 種外源基因，并且所述培養(yǎng)基將不含相應(yīng)生物合成途徑的產(chǎn)物。在一些實施方案中，碳源可 包括工業(yè)廢氣流，如來自鐵金屬產(chǎn)品制備的廢氣（如鋼廠廢氣）、來自有色金屬產(chǎn)品制備的 廢氣、來自石油精煉過程的廢氣、來自煤的氣化的廢氣、來自電力生產(chǎn)的廢氣、來自炭黑生 產(chǎn)的廢氣、來自氨生產(chǎn)的廢氣、來自甲醇生產(chǎn)的廢氣、來自焦炭制備的廢氣以及合成氣。汽 車廢氣也可用作碳源。
[0076] CO轉(zhuǎn)化討稈
[0077] 想到的一個實施方案是將含CO的底物中的CO轉(zhuǎn)化成較高分子量的產(chǎn)物的方法。 所述方法包括：將含CO的底物傳送到包含在培養(yǎng)基中的一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌培養(yǎng)物 的生物反應(yīng)器，以使得所述細(xì)菌將CO轉(zhuǎn)化成較高分子量的產(chǎn)物；以及從所述生物反應(yīng)器中 回收所述較高分子量的產(chǎn)物。將一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌進(jìn)行遺傳工程改造以表達(dá)不存 于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)素的生物合成途徑中的酶?？上蚺囵B(yǎng)基提供任選外加的營養(yǎng)素，以用于 一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌的存活和/或生長。當(dāng)對一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌進(jìn)行遺傳工 程改造以表達(dá)營養(yǎng)素的生物合成途徑中的酶時，所述營養(yǎng)素不存在于外加的營養(yǎng)素中。任 選地，從所述營養(yǎng)素的營養(yǎng)缺陷型親代細(xì)菌進(jìn)行遺傳工程改造得到一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸 菌。在一種替代形式中，所述較高分子量的產(chǎn)物選自醇、酸、二醇、酯、酮及其混合物。在另一 種替代形式中，所述較高分子量的產(chǎn)物選自乙醇、丙酮、1-丙醇、2-丙醇、1- 丁醇、2- 丁醇、 1，4- 丁二醇、2, 3- 丁二醇、甲乙酮（MEK)、3_羥丙酸、脂肪酸、萜、1，3- 丁二烯、3-羥基丁酸 酯、2-羥基異丁酸、醋酸及其混合物。任選地，將選擇劑加入培養(yǎng)基，如所需的細(xì)菌能耐受的 抗生素。所述抗生素可用于抑制非期望的污染性微生物或已經(jīng)喪失了所需的生物合成酶或 酶途徑的細(xì)菌的生長。要注意的是，抗生素可以不是必需的，并且在一些實施方案中，外來 抗生素不存在于所述培養(yǎng)基中。賦予原養(yǎng)型的生物合成酶可發(fā)揮充分的選擇壓力以維持所 需的微生物的培養(yǎng)物。在成本節(jié)約、環(huán)境保護(hù)以及特別是人類健康方面，這可能是有益的。 通常，所述培養(yǎng)基是含有溶解的或未溶解的氣體的含水混合物。通常，將培養(yǎng)條件維持在溫 度為約30°C與約37°C之間，并且pH為約4至小于7。在一個實施方案中，對含CO的底物進(jìn) 行預(yù)處理以除去非CO的氣體組分。在一些實施方案中，可以產(chǎn)生超過培養(yǎng)物中的細(xì)菌所需 量的營養(yǎng)素。在此類實施方案中，可收集過量的營養(yǎng)素作為發(fā)酵產(chǎn)物。
[0078] 在一個實施方案中，將含CO的氣態(tài)底物中的CO轉(zhuǎn)化為較高分子量的產(chǎn)物。將含 CO的氣態(tài)底物傳送到包含在培養(yǎng)基中的一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器中， 以使得所述細(xì)菌將CO轉(zhuǎn)化成較高分子量的產(chǎn)物。從所述生物反應(yīng)器中回收所述較高分子 量的產(chǎn)物。將一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌進(jìn)行遺傳工程改造以表達(dá)不存于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)素 的生物合成途徑中的酶。此外，一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌借助外源thiC基因和/或外源 panBCD基因簇而成為對硫胺素和/或泛酸鹽原養(yǎng)型的。所述營養(yǎng)素選自硫胺素和泛酸鹽。
[0079] 在CO轉(zhuǎn)化討稈中#用的鉬合物
[0080] 另一實施方案是用于將含CO的底物中的CO轉(zhuǎn)化成較高分子量的產(chǎn)物的組合物。 所述組合物可包含在PH為約4至小于7的水性培養(yǎng)基中所含的一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌， 以及一種或多種用于所述一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌的存活或生長的營養(yǎng)素。所述一氧化碳 營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌經(jīng)遺傳工程改造以表達(dá)不存在于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)素（如硫胺素或泛酸鹽） 的生物合成途徑中的酶。所述組合物可處于容器中，如生物反應(yīng)器中，并通常將含有含CO 的氣態(tài)碳源。
[0081] 其它方法
[0082] 想到的另一實施方案是提供用于減少工業(yè)過程的溫室氣體排放物的微生物。分析 了所述微生物的基因組序列，以確定編碼必需營養(yǎng)素的生物合成途徑中所必需的酶的基因 是缺乏還是有缺陷的。如果發(fā)現(xiàn)缺失或缺陷的酶，則通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將外源（或異源） 型基因提供給所述微生物，以使得所述微生物成為對必需營養(yǎng)素原養(yǎng)型的。所述異源基因 可來自不同的種、不同的屬、不同的門、或甚至不同的界。遺傳缺陷或缺失的互補(bǔ)將使得微 生物成為原養(yǎng)型的。
[0083] 想到的又一個實施方案是用于將外源核酸轉(zhuǎn)移到硫胺素和/或泛酸鹽營養(yǎng)缺陷 型的一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌群中的方法。采用含有可操作地連接到啟動子的外源thiC 基因或外源panBCD基因簇的第一核酸轉(zhuǎn)化所述細(xì)菌。
[0084] 從轉(zhuǎn)化的細(xì)菌群中選擇硫胺素原養(yǎng)型和/或泛酸鹽原養(yǎng)型。任選地，可用包含當(dāng) 在細(xì)菌中表達(dá)時賦予所需性質(zhì)的外源或內(nèi)源基因的第二核酸共轉(zhuǎn)化所述細(xì)菌。所述所需的 性質(zhì)不必為選擇性的。所述第一和第二核酸可以在單獨(dú)的分子上或在同一分子中。任選地， 可使用另外的步驟來針對第一核酸的存在情況篩選原養(yǎng)型、轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。在某些情況下，可 能有必要和/或需要在共轉(zhuǎn)化步驟之前處理第一和第二核酸以形成甲基化的第一和第二 核酸。
[0085] 又一個實施方案在不存在任何其它選擇劑（如抗生素）的情況下使用原養(yǎng)型自身 作為轉(zhuǎn)化體的可選擇標(biāo)記。所述原養(yǎng)型可以是針對維生素（如下所示）或任何其它必需營 養(yǎng)素。在不存在抗生素的情況下的干凈選擇（clean slection)出人意料。無論是在需氧 還是厭氧生長條件下，這種類型的選擇均可用于本文所述的任何梭菌，以及其它革蘭氏陰 性和革蘭氏陽性細(xì)菌。
[0086] 廣義上說，本發(fā)明還可單獨(dú)或綜合地包括本申請說明書中提及或指出的部分、要 素和特征，包括兩個或多個所述部分、要素或特征的任意或所有組合，并且當(dāng)本文提及的具 體整數(shù)在本發(fā)明所涉及的領(lǐng)域具有已知的等價物時，所述已知的等價物被認(rèn)為如同單獨(dú)被 提出一樣納入本文。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0087] 本發(fā)明的這些方面和其它方面--應(yīng)以其所有新的方面考慮--將通過以下參 照附圖的描述（僅作為示例）而變得顯而易見，其中：
[0088] 圖1 :第二十天與第二十八天之間的連續(xù)培養(yǎng)中的LZ1561的生長和代謝曲線。
[0089] 圖2 :PCR擴(kuò)增的拉氏梭菌thic/purF區(qū)的核苷酸序列的基因組排列。
[0090] 圖 3 :pMTL85246-thiC-purF 的質(zhì)粒圖譜。
[0091] 圖4 :拜氏梭菌（C. beijerickii)panBCD操縱子的核苷酸序列的基因組排列。
[0092] 圖5 :在不存在硫胺素的情況下，自產(chǎn)乙醇梭菌DSM23693野生型和攜帶質(zhì)粒 pMTL85246-thiC-purF的菌株的生長比較。
[0093] 序列表是本申請的一部分。

【具體實施方式】
[0094] 下面是在廣義上給出的對本發(fā)明（包括其優(yōu)選的實施方案）的說明。下文在標(biāo)題 "實施例"下給出的公開內(nèi)容進(jìn)一步解釋本發(fā)明，其提供了支持本發(fā)明的實驗數(shù)據(jù)、本發(fā)明 多個方面的具體實例以及實施本發(fā)明的方法。
[0095] 本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在微生物存活所必需的維生素的生物合成途徑中的一種或 多種基因可用作有效的選擇標(biāo)記以篩選用外源核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中所述微生物天然不含 有或表達(dá)所述一種或多種基因。
[0096] 這具有多個優(yōu)點，包括無需使用昂貴的、具有局限性并且可能對一些所需的細(xì)胞 有毒性的標(biāo)準(zhǔn)選擇性標(biāo)記和選擇劑（如抗生素）。因為可省去通常需要加到生長和發(fā)酵培 養(yǎng)基中的維生素，其還具有進(jìn)一步降低重組微生物的生長和發(fā)酵成本的有益效果。另外，維 生素自身是有價值的產(chǎn)物，因此除了充當(dāng)選擇性標(biāo)記之外，可將產(chǎn)生的維生素回收并銷售 或用于其它目的。
[0097] 本文中提到的"發(fā)酵液"是包含至少一種營養(yǎng)培養(yǎng)基和細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)基。
[0098] 本文中提到的"穿梭微生物"是其中表達(dá)甲基轉(zhuǎn)移酶的微生物，并且其不同于目標(biāo) 微生物。
[0099] 本文中提到的"目標(biāo)微生物"是其中表達(dá)包括在表達(dá)構(gòu)建體/載體上的基因的微 生物，并且其不同于所述穿梭微生物。
[0100] 術(shù)語"主要發(fā)酵產(chǎn)物"旨在意指以最高濃度和/或產(chǎn)率產(chǎn)生的那種發(fā)酵產(chǎn)物。
[0101] 當(dāng)用于發(fā)酵過程時，術(shù)語"提高效率"、"提高的效率"等包括但不限于提高如下中 的一個或多個：催化所述發(fā)酵的微生物的生長速率、在提高的產(chǎn)物濃度下的生長和/或產(chǎn) 物產(chǎn)生速率、產(chǎn)生的所需產(chǎn)物的體積/消耗的底物的體積、所需產(chǎn)物的產(chǎn)生速率或產(chǎn)生水 平、以及產(chǎn)生的所需產(chǎn)物與所述發(fā)酵的其它副產(chǎn)物相比的相對比例。
[0102] 短語"含一氧化碳的底物"及類似術(shù)語應(yīng)被理解為包括任意底物，其中一氧化碳可 被一種或多種細(xì)菌菌株用于例如生長和/或發(fā)酵。
[0103] 短語"含一氧化碳的氣態(tài)底物"及類似短語和術(shù)語包括含有某一水平一氧化碳的 任意氣體。在某些實施方案中，所述底物含有至少約20體積％至約100體積％的C0、20體 積％至70體積％的C0、30體積％至60體積％的C0、40體積％至55體積％的CO。在具體 的實施方案中，底物包含約25體積％、或約30體積％、或約35體積％、或約40體積％、或 約45體積％或約50體積％的C0,或約55體積％或約60體積％的C0。
[0104] 雖然所述底物不必需含有任何氫氣，但是存在H2應(yīng)該不會對本發(fā)明方法的產(chǎn)物形 成不利。在具體的實施方案中，存在氫氣可獲得提高的醇生產(chǎn)的總體效率。例如，在具體的 實施方案中，所述底物可包含約2:1、或1:1或1:2比例的H 2:CO。在一個實施方案中，所述 底物包含約30體積％或更少的H2、20體積％或更少的H 2、約15體積％或更少的H2或約10 體積％或更少的4。在其它實施方案中，所述底物流包含低濃度的H 2，例如低于5%、或低于 4 %、或低于3 %、或低于2 %、或低于1 %，或基本上不含氫氣。所述底物還可包含一些CO2， 例如，約1體積％至約80體積％的CO2、或1體積％至約30體積％的CO 2。在一個實施方案 中，所述底物包含低于或等于約20體積％的CO2。在具體的實施方案中，所述底物包含低于 或等于約15體積％的CO 2、低于或等于約10體積％的CO2、低于或等于約5體積％的C02,或 基本上不含CO 2。
[0105] 在以下的說明書中，從遞送和發(fā)酵"含CO的氣態(tài)底物"的方面描述本發(fā)明的實施 方案。但是，應(yīng)理解，所述氣態(tài)底物可以其他形式提供。例如，所述含CO的氣態(tài)底物可以溶 解于液體中的形式提供。實質(zhì)上，將液體用含一氧化碳的氣體飽和，然后將所述液體加入 生物反應(yīng)器中。這可使用標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)完成。例如，可使用微泡分散發(fā)生器（Hensirisak et al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation ； Applied Biochemistry and Biotechnology 第 101 卷，第 3 期 /2002 年 10 月）。又例如， 可將所述含CO的氣態(tài)底物吸附到固相載體上。術(shù)語"含CO的底物"等的使用涵蓋了此類 替代方法。
[0106] 在本發(fā)明的具體的實施方案中，所述含CO的氣態(tài)底物是工業(yè)排氣或廢氣。"工業(yè) 廢氣或工業(yè)排氣"應(yīng)被廣義地認(rèn)為包括工業(yè)過程產(chǎn)生的任何含CO的氣體，并且包括鐵金屬 產(chǎn)品制備、有色金屬產(chǎn)品制備、石油精煉過程、煤的氣化、生物質(zhì)的氣化、電力生產(chǎn)、炭黑生 產(chǎn)和焦炭制備所產(chǎn)生的氣體。本文其它部分可提供另外的實例。
[0107] 除非另有說明，否則本文所用的短語"發(fā)酵"、"發(fā)酵過程"或"發(fā)酵反應(yīng)"等旨在涵 蓋所述過程的生長階段和產(chǎn)物生物合成階段。如本文將進(jìn)一步描述，在一些實施方案中，所 述生物反應(yīng)器可包括第一生長反應(yīng)器和第二發(fā)酵反應(yīng)器。因此，向發(fā)酵反應(yīng)中加入金屬或 組合物應(yīng)被理解為包括加入到這些反應(yīng)器之一或兩個中。
[0108] 術(shù)語"生物反應(yīng)器"包括由一個或多個容器和/或塔或管道排布組成的發(fā)酵裝置， 其包括連續(xù)攪拌槽式反應(yīng)器（CSTR)、固定化細(xì)胞反應(yīng)器（ICR)、滴流床反應(yīng)器（TBR)、鼓泡 塔、氣升式發(fā)酵罐、靜態(tài)混合器，或適于氣液接觸的其它容器或其它裝置。在一些實施方案 中，所述生物反應(yīng)器可包含第一生長反應(yīng)器和第二發(fā)酵反應(yīng)器。因此，當(dāng)提到將底物加入到 所述生物反應(yīng)器或發(fā)酵反應(yīng)中時，如果合適，應(yīng)理解為加入到這些反應(yīng)器中之一或兩個中。
[0109] "外源核酸"是源自待引入其的微生物之外的核酸。外源核酸可源自任何合適的來 源，包括但不限于與待引入它們的生物不同的微生物菌株或種，或者它們可通過人工或重 組方法形成。所述外源核酸代表了非天然存在于待引入其的微生物內(nèi)的核酸序列，并且使 得能夠表達(dá)非天然存在于所述微生物內(nèi)的產(chǎn)物。所述外源核酸可被改造為適于整合到待引 入其的微生物的基因組中或保持染色體外狀態(tài)。通常，所述外源核酸是異源的，來自與受體 不同的種、不同的屬、或不同的門或界。
[0110] 應(yīng)理解，可使用其序列與本文具體示例的序列不同的核酸來實施本發(fā)明，只要它 們執(zhí)行基本上相同的功能。對于編碼蛋白或肽的核酸序列來說，這意味著所編碼的蛋白或 肽具有基本上相同的功能。對于代表啟動子序列的核酸序列來說，所述變體序列將具有促 進(jìn)一種或多種基因表達(dá)的能力。此類核酸在本文可稱為"功能等價變體"。舉例來說，核酸 的功能等價變體包括等位基因變體、基因片段、包含突變（缺失、插入、核苷酸置換等）的基 因和/或多態(tài)性等。來自其它微生物的同源基因也可被視為本文具體示例的序列的功能等 價變體的實例。這些包括在如大腸桿菌（E.coli)、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)、拜 氏梭菌的種之中的同源基因，它們的詳細(xì)情況可從如Genbank或NCBI的網(wǎng)站公開獲得。所 述短語"功能等價變體"也應(yīng)被視為包括由特定生物體的密碼子優(yōu)化而導(dǎo)致的序列變化的 核酸。本文的核酸的"功能等價變體"將優(yōu)選地具有與已鑒定的核酸至少約70%、優(yōu)選約 80%、更優(yōu)選約85%、優(yōu)選約90%、優(yōu)選約95%或更高的核酸序列同一性。
[0111] 還應(yīng)理解，可使用其序列與本文具體示例的氨基酸序列不同的多肽來實施本發(fā) 明。這些變體在本文可稱為"功能等價變體"。蛋白或肽的功能等價變體包括與已鑒定的蛋 白或肽共有至少40%、優(yōu)選50%、優(yōu)選60%、優(yōu)選70%、優(yōu)選75%、優(yōu)選80%、優(yōu)選85%、優(yōu) 選90%、優(yōu)選95%或更高的氨基酸同一性并與所述目的肽或蛋白具有基本上相同的功能 的那些蛋白或肽。此類變體在其范圍內(nèi)包括這樣的蛋白或肽片段，其中所述片段包括多肽 的截短形式，其中缺失可以為1至5、至10、至15、至20、至25個氨基酸，并且可在多肽的任 一末端延伸1至25個殘基，并且其中缺失可以為所述區(qū)域內(nèi)的任何長度，或可以在內(nèi)部位 置。本文特定多肽的功能等價變體也應(yīng)視為包括例如如在之前段落中所示例的，在其它細(xì) 菌種中由同源基因表達(dá)的多肽。
[0112] 本文使用的"基本上相同的功能"旨在意指所述核酸或多肽能夠執(zhí)行作為變體來 源的核酸或多肽的功能。例如，本發(fā)明的酶的變體將能夠催化與該酶所催化的反應(yīng)相同的 反應(yīng)。但是，不應(yīng)認(rèn)為意指所述變體與作為所述變體來源的核酸或多肽具有相同水平的活 性。
[0113] 可使用任意數(shù)量的已知方法來評估功能等價變體是否與作為所述 變體來源的核酸或多肽具有基本上相同的功能。但是，舉例來說，Zhang等 (1997, J.Bacteriol.，179:3030-5)、Lawhorn 等（2004, Organic&Biomolecular Chemistry, 2:2538-46)中所概述的方法可用于評估關(guān)于ThiC的功能； Powers&Snell (1976, Biol. Chem. 251，3786-3793)可用于評估關(guān)于PanB 的功能； Cronan 等（1982, J. Bacteriol. 149:916-922)可用于評估關(guān)于 PanC 的功能；或者 Williamson(1985, Methods Enzymol. 113:589-595)可用于評估關(guān)于 PanD 的功能；或者可 以使用關(guān)于硫胺素基因的Lawhorn等（2004, J. Soc. Biol. Chem.，279:43555-9)所概述的遺 傳篩選。
[0114] "親代微生物"是用于產(chǎn)生本發(fā)明的重組微生物的微生物。所述親代微生物可以是 天然存在的微生物（即，野生型微生物），或之前曾被修飾但不表達(dá)微生物生長所需的一種 或多種維生素生物合成途徑中的一種或多種酶的微生物。因此,對本發(fā)明的重組微生物進(jìn) 行了修飾以表達(dá)在親代微生物中不表達(dá)的所述一種或多種酶。
[0115] 術(shù)語核酸"構(gòu)建體"或"載體"及類似術(shù)語應(yīng)被廣義地認(rèn)為包括適合用作載體將遺 傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的任意核酸（包括DNA和RNA)。所述術(shù)語應(yīng)被認(rèn)為包括質(zhì)粒、病毒（包 括噬菌體）、粘粒和人工染色體。構(gòu)建體或載體可包含一種或多種調(diào)控元件、復(fù)制起點、多克 隆位點和/或選擇標(biāo)記。在具體的實施方案中，所述構(gòu)建體或載體被改造為適于使得由所 述構(gòu)建體或載體編碼的一種或多種基因表達(dá)。核酸構(gòu)建體或載體包括裸核酸，以及用一種 或多種可幫助向細(xì)胞遞送的試劑（例如，脂質(zhì)體綴合的核酸、其中包含所述核酸的有機(jī)體 (organism))配制的核酸。
[0116] 本發(fā)明適用于通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生"一種或多種產(chǎn)物"。提到"一種或多種產(chǎn)物" 應(yīng)被廣義地認(rèn)為包括可通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。但是，舉例來說，其包括乙醇、乙 酸、丁醇、異丙醇、一種或多種維生素、丙酮、2, 3- 丁二醇。
[0117] "污染性微生物"或"不合需要的微生物"應(yīng)被廣義地認(rèn)為意指無論由于何種原因 而不合需要的任何微生物。
[0118] 當(dāng)在本發(fā)明方法的上下文中使用時，"防止生長"及類似術(shù)語應(yīng)被廣義地認(rèn)為包括 對一種或多種微生物生長水平的任何程度的防止或降低。所述術(shù)語不應(yīng)被解釋為意指微生 物的生長受到完全阻止、抑制或中止。但是，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述微生物的生長 基本上被阻止。
[0119] "生長所需的"被視為意指所述維生素是達(dá)到所需生長水平所需要的，以使得在微 生物將在其中或其上生長的培養(yǎng)基中不存在所述維生素足以正選擇重組微生物（能夠形 成維生素）或負(fù)選擇不合需要的或污染性的微生物。在一個實施方案中，維生素是微生物 的"生長必需的"。在這種情況下，沒有所述維生素，微生物基本上不會生長或可能死亡。
[0120] "厭氧菌"或"厭氧微生物"或類似術(shù)語應(yīng)被廣義地認(rèn)為包括專性和兼性厭氧菌。
[0121] 重鉬微牛物
[0122] 如前文所討論的，本發(fā)明提供了重組微生物。所述重組微生物包含至少一種外源 核酸，所述核酸編碼在產(chǎn)生微生物的生長需要的維生素的一種或多種維生素生物合成途徑 中的一種或多種基因。因此所述重組微生物能夠產(chǎn)生所述一種或多種維生素。所述重組微 生物是厭氧菌。
[0123] 所述重組微生物由親代微生物產(chǎn)生。
[0124] 所述親代微生物可選自缺乏所述一種或多種維生素生物合成途徑中的所述一種 或多種基因的任何微生物。
[0125] 在一個實施方案中，所述維生素選自硫胺素、泛酸鹽、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物 素、葉酸和氰鈷胺素。在一個具體的實施方案中，所述維生素是硫胺素（BI)或泛酸鹽（B5)。
[0126] 所述一種或多種酶可以是參與維生素生物合成途徑的任意一種。但是，舉例來說， 所述一種或多種酶可選自下表1至表8中列出的那些。
[0127] 表1 :硫胺素（BI)牛物合成:
[0128] 半胱氨酸脫硫酶[EC :2. 8. 1. 7]
[0129] 甘氨酸氧化酶[EC: 1. 4. 3. 19]
[0130] 羥乙基噻唑激酶[EC: 2. 7. 1. 50]
[0131] 羥甲基嘧啶[EC: 2. 7. 4. 7]
[0132] 核苷三磷酸酶[EC: 3. 6. 1. 15]
[0133] 磷酸甲基嘧啶激酶[EC:2. 7. L 49]
[0134] 硒代半胱氨酸裂解酶[EC:4. 4. I. 16]
[0135] 硫載體蛋白ThiS腺苷酰轉(zhuǎn)移酶[EC:2. 7. 7. 73]
[0136] 硫胺素酶[EC: 3. 5. 99. 2]
[0137] 硫胺素生物合成蛋白ThiC [EC 4. 1. 99. 17]
[0138] 硫胺素生物合成蛋白ThiG
[0139] 硫胺素生物合成蛋白ThiH
[0140] 硫胺素生物合成蛋白ThiI
[0141] 硫胺素激酶[EC :2. 7. 1. 89]
[0142] 硫胺素吡啶基酶[EC:2. 5. 1. 2]
[0143] 硫胺素焦磷酸激酶[EC: 2. 7. 6. 2]
[0144] 硫胺素單磷酸激酶[EC: 2. 7. 4. 16]
[0145] 磷酸硫胺素焦磷酸化酶[EC: 2. 5. 1. 3]
[0146] 硫胺素三磷酸酶[EC :3. 6. 1. 28]
[0147] 表2 :核黃素（B2)牛.物合成：
[0148] GTP 環(huán)化水解酶 II [EC: 3. 5. 4. 25]
[0149] 2, 5-二氨基-6-(核糖基氨基）-4 (3H)-嘧啶酮5' -磷酸還原酶[EC: I. I. 1. 302]
[0150] 2-氨基-5-甲?；被?6-核糖基氨基嘧啶-4 (3H)-酮5' -單磷酸去甲酰酶 [EC:3. 5. 1. 102]
[0151] 3, 4-二羥基 2-丁酮 4-磷酸合酶[EC: 4. 1.99. 12]
[0152] 4-肌醇六磷酸酶/酸性磷酸酶[EC: 3. L 3. 2/3. L 3. 26]
[0153] 5, 6-二甲基苯并咪唑合酶[EC: L 14. 99. 40]
[0154] 5-氨基-6-(5-磷酸核糖基氨基）尿嘧啶還原酶[EC: I. I. 1. 193]
[0155] 6, 7-二甲基-8-核糖醇基二氧四氫蝶啶合酶[EC:2. 5. 1.78]
[0156] 酸性磷酸酶（A 類）[EC: 3. 1. 3. 2]
[0157] 酸性磷酸酶（B 類）[EC:3. 1. 3. 2]
[0158] 酸性磷酸酶[EC:3. L 3. 2]
[0159] 水鈷胺素還原酶 /NAD(P)H-黃素還原酶[EC: 1. 5. 1. 41/1. 16. 1. 3]
[0160] 膽綠素還原酶/黃素還原酶[EC: L 5. L 30/L 3. L 24]
[0161] 二氨基羥基磷酸核糖基氨基嘧啶脫氨酶/5-氨基-6-(5-磷酸核糖基氨基）尿嘧 啶還原酶[EC: I. I. 1. 193/3. 5. 4. 26]
[0162] 二氨基羥基磷酸核糖基氨基嘧啶脫氨酶[EC:3. 5. 4. 26]
[0163] 核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員1/3 [EC:3. 6. 1.9/3. 1.4. 1]
[0164] FAD 合成酶[EC: 2. 7. 7. 2]
[0165] FMN 還原酶[EC :1· 5. 1. 38]
[0166] GTP 環(huán)化水解酶 II [EC: 3. 5. 4. 25]
[0167] GTP 環(huán)化水解酶 IIa[EC: 3. 5. 4. 29]
[0168] 低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶[EC: 3. 1. 3. 48/3. 1. 3. 2]
[0169] 6型溶血磷脂酸磷酸酶[EC: 3. L 3. 2]
[0170] FMN 腺苷酰轉(zhuǎn)移酶[EC: 2. 7. 7. 2]
[0171] 核黃素激酶[EC:2. 7. I. 26/EC:2. 7. I. 161]
[0172] 核黃素合酶[EC:2. 5. I. 9]
[0173] 5型抗酒石酸酸性磷酸酶[EC:3. I. 3· 2]
[0174] tRNA假尿苷合酶8/2, 5-二氨基-6- (5-磷酸-D-核糖醇氨基）-嘧啶-4 (3Η)-酮 脫氨酶[EC :5.4. 99·-]
[0175] 酪氨酸酶[EC: 1. 14. 18. 1]
[0176] 表3:煙酸（B3)牛物合成:
[0177] 5'-核苷酸酶[EC: 3. 1. 3. 5]
[0178] 6-羥基-3-琥珀酰吡啶羥化酶[EC:3. 7. 1. _]
[0179] 6-羥基煙酸 3-單氧合酶[EC:1. 14. 13. 114]
[0180] 醛氧化酶[EC: 1. 2. 3. 1]
[0181] 天冬氨酸脫氫酶[EC: I. 4. 1. 21]
[0182] 雙官能NMN腺苷酰轉(zhuǎn)移酶/nudix水解酶[EC: 3. 6. L -2. 7. 7. 1]
[0183] 核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員1/3 [EC:3. 6. 1.93. 1.4. 1]
[0184] enamidase[EC:3. 5. 2. 18]
[0185] L-天冬氨酸氧化酶[EC: I. 4· 3· 16]
[0186] 馬來酰胺酸酰胺水解酶[EC:3. 5. I. 107]
[0187] 馬來酸異構(gòu)酶[EC:5. 2. I. 1]
[0188] NAD(P)轉(zhuǎn)氫酶[EC: L 6. L 1]
[0189] NAD(P)轉(zhuǎn)氫酶 α 亞基[EC :1. 6. 1. 2]
[0190] NAD(P)轉(zhuǎn)氫酶 β 亞基[EC: L 6. L 2]
[0191] NAD+二磷酸酶[EC:3. 6. 1. 22]
[0192] NAD+激酶[EC:2. 7. 1. 23]
[0193] NAD+ 核苷酶[EC: 3. 2. 2. 5]
[0194] NAD+合酶（谷氨酰胺水解）[EC: 6· 3· 5· 1]
[0195] NAD+合酶[EC: 6. 3. L 5]
[0196] N-甲?；R來酰胺酸去甲酰酶[EC:3. 5. 1. 106]
[0197] 煙酰胺酶[EC: 3. 5. 1. 19]
[0198] 煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶[EC :2. 7. 7. 182. 7. 7. 1]
[0199] 煙酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶[EC:2. I. I. 1]
[0200] 煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶[EC:2. 4. 2. 12]
[0201] 煙酰胺核糖苷激酶[EC:2. 7. L 22]
[0202] 煙酰胺-核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶[EC:2. 7. 7. 1]
[0203] 煙酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶[EC: 2. 4. 2. 11 ]
[0204] 煙酸-核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶[EC: 2. 7. 7. 18]
[0205] 煙酸-核苷酸焦磷酸化酶（羧化）[EC: 2. 4. 2. 19]
[0206] 嘌呤核苷酶[EC: 3. 2. 2. 1]
[0207] 嘌呤-核苷磷酸化酶[EC: 2. 4. 2. 1]
[0208] 吡嗪酰胺酶[EC: 3. 5. L _]
[0209] 喹啉酸合酶[EC:2. 5. I. 72]
[0210] UDP-糖二磷酸酶[EC: 3· 6. I. 45]
[0211] 表4 :泛酸鹽（Β5)牛物合成:
[0212] 2-脫氫泛酸 2-還原酶[EC: I. I. L 169]
[0213] 3-甲基-2-氧代丁酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶PanB[EC:2. 1. 2. 11]
[0214] 4' -磷酸泛硫乙胺基轉(zhuǎn)移酶[EC: 2. 7. 8. _]
[0215] 4-磷酸泛酸-β -丙氨酸連接酶[EC: 6. 3. 2. 36]
[0216] 乙酰乳酸合酶Ι/ΙΙ/ΙΙΙ大亞基EC:2. 2. 1. 6]
[0217] 乙酰乳酸合酶I/III小亞基[EC:2. 2. 1. 6]
[0218] 乙酰乳酸合酶II小亞基[EC:2. 2. L 6]
[0219] ?；d體蛋白磷酸二酯酶[EC:3. L 4. 14]
[0220] 天冬氨酸 1-脫羧酶 PanD[EC:4. I. 1. 11]
[0221] β-脲酰丙酸酶[EC:3. 5. 1.6]
[0222] 生物素-[乙酰-CoA-羧化酶]連接酶[EC :6. 3. 4. 15]
[0223] 支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶[EC:2. 6. L 42]
[0224] 脫磷酸-CoA 激酶[EC: 2· 7. L 24]
[0225] 二氫嘧啶酶[EC:3. 5. 2. 2]
[0226] 二氫嘧啶脫氫酶（NADP+) [EC: I. 3. 1. 2]
[0227] 二羥酸脫水酶[EC:4. 2. 1. 9]
[0228] 核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員1/3 [EC: 3. 6. 1. 93. 1. 4. 1]
[0229] 全-[?；d體蛋白]合酶[EC: 2. 7. 8. 7]
[0230] 酮醇酸還原異構(gòu)酶[EC: I. I. 1. 86]
[0231] 泛硫乙胺水解酶[EC :3. 5. 1. 92]
[0232] 泛硫乙胺-磷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶[EC: 2. 7. 7. 3]
[0233] 泛酸激酶[EC: 2. 7. L 169]
[0234] 泛酸連接酶/胞苷酸激酶[EC :2. 7. 4. 14/6. 3. 2. 1]
[0235] 泛酸-β-丙氨酸連接酶 PanC[EC:6. 3. 2. 1]
[0236] 磷酸泛硫乙胺腺苷酰轉(zhuǎn)移酶/脫磷酸-CoA激酶[EC: 2. 7. 1. 242. 7. 7. 3]
[0237] 磷酸泛酸-半胱氨酸連接酶[EC: 6. 3. 2. 5]
[0238] 磷酸泛酸-半胱氨酸連接酶[EC: 6. 3. 2. 5]
[0239] 磷酸泛酰半胱氨酸脫羧酶[EC:4. I. 1. 36]
[0240] I 型泛酸激酶[EC: 2. 7. L 33]
[0241] II 型泛酸激酶[EC:2. 7. L 33]
[0242] III 型泛酸激酶[EC:2. 7. 1. 33]
[0243] 表5 :吡咚醇（B6)牛物合成:
[0244] 4-羥基蘇氨酸-4-磷酸脫氫酶[EC: I. I. 1. 262]
[0245] 醛氧化酶[EC: L 2. 3. 1]
[0246] D-赤蘚糖4-磷酸脫氫酶[EC: 1. 2. 1. 72]
[0247] 赤糖酸-4-磷酸脫氫酶[EC: I. I. L 290]
[0248] 谷氨酰胺酰胺轉(zhuǎn)移酶[EC: 2. 6.
[0249] 磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶[EC:2. 6. 1. 52]
[0250] 吡哆醛磷酸酶[EC: 3. 1. 3. 74]
[0251] 磷酸吡哆醛磷酸酶EC: 3. 1. 3. 74]
[0252] 5' -磷酸吡哆胺氧化酶[EC: L 4. 3. 5]
[0253] 吡哆醇 4-脫氫酶[EC: I. I. L 65]
[0254] 5-磷酸吡哆醇合酶[EC: 2. 6. 99. 2]
[0255] 吡哆醇生物合成蛋白[EC:4.
[0256] 吡哆醇激酶[EC:2. 7. L 35]
[0257] 蘇氨酸合酶[EC:4. 2. 3. 1]
[0258] 表6 :牛物素（B7)牛物合成:
[0259] 6-羧基己酸-CoA 連接酶[EC:6. 2. 1. 14]
[0260] 8-氨基-7-氧代壬酸合酶[EC: 2. 3. 1. 47]
[0261] 腺苷甲硫氨酸-8-氨基-7-氧代壬酸氨基轉(zhuǎn)移酶[EC:2. 6. 1.62]
[0262] 生物素合成酶[EC:2. 8. 1. 6]
[0263] 生物素-[乙酰-CoA-羧化酶]連接酶[EC :6. 3. 4. 15]
[0264] 生物素酶[EC :3· 5. 1. 12]
[0265] 生物素-蛋白連接酶[EC:6. 3. 4. 156. 3. 4. 116. 3. 4. 106. 3. 4. 9]
[0266] 脫硫生物素合成酶[EC :6. 3. 3. 3]
[0267] III 型泛酸激酶[EC:2· 7. L 33]
[0268] 表7 :葉酸（B9)/對氨某苯甲酸（BlO)牛物合成:
[0269] 2-氨基-4-羥基-6-羥甲基二氫蝶啶二磷酸激酶[EC :2. 7. 6. 3]
[0270] 4-氨基-4-去氧分支酸裂解酶[EC:2.6. I. 85/EC: 4. 1.3.38]
[0271] 6-丙酮酰四氫生物蝶呤合酶[EC:4. 2. 3. 12]
[0272] 6-丙酮酰四氫蝶呤2' -還原酶[EC: I. I. 1. 220]
[0273] 堿性磷酸酶[EC:3. 1. 3. 1]
[0274] 二氫葉酸還原酶[EC: 1. 5. 1. 3]
[0275] 二氫葉酸合酶/葉酰多聚谷氨酸合酶[EC:6. 3. 2. 17/6. 3. 2. 12]
[0276] 二氫新蝶呤還原酶（dihydromonapterin reductase) [EC: I. 5. 1. _]
[0277] 二氫新蝶呤醛縮酶/2-氨基-4-羥基-6-羥甲基二氫蝶啶
[0278] 二磷酸激酶[EC: 2. 7. 6. 3/4. 1. 2. 25]
[0279] 二氫新蝶呤醛縮酶[EC :4. 1. 2. 25]
[0280] 二氫蝶啶還原酶[EC: I. 5. L 34]
[0281] 二氫蝶酸合酶[EC: 2. 5. 1. 15]
[0282] 葉酰多聚谷氨酸合酶[EC: 6. 3. 2. 17]
[0283] Y -谷氨酰水解酶[EC: 3. 4. 19. 9]
[0284] GTP 環(huán)化水解酶 I [EC: 3. 5. 4. 16]
[0285] 鑰輔因子生物合成蛋白
[0286] 鑰蝶呤合酶催化亞基[EC: 2. _· _· _]
[0287] 鑰蝶呤合酶硫載體亞基
[0288] 對氨基苯甲酸合成酶[EC:2. 6. L 85]
[0289] 對氨基苯甲酸合成酶組分I [EC: 2. 6. 1 · 85]
[0290] 對氨基苯甲酸合成酶組分II [EC: 2. 6. 1. 85]
[0291] 墨蝶呤還原酶[EC: I. I. L 153]
[0292] 胸苷酸合酶[EC: 2. I. L 45]
[0293] 表8 :鈷胺素（B12)牛物合成
[0294] 5-氨基乙酰丙酸合酶[EC: 2. 3. L 37]
[0295] 5-氨基乙酰丙酸：丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶[EC 2. 6. 1. 43]
[0296] 腺苷鈷啉醇酰胺激酶/腺苷鈷啉醇酰胺-磷酸鳥苷?；D(zhuǎn)移酶 [EC:2. 7. 1. 156/2. 7. 7. 62]
[0297] 腺苷鈷啉醇酰胺-GDP核唑轉(zhuǎn)移酶[EC: 2. 7. 8. 26]
[0298] 腺苷鈷啉醇酰胺-磷酸合酶[EC: 6. 3. 1. 10]
[0299] 腺苷鈷啉胺酸合酶[EC: 6. 3. 5. 10]
[0300] α -核唑磷酸酶[EC: 3. 1. 3. 73]
[0301] 鈷胺素（I)腺苷轉(zhuǎn)移酶[EC: 2. 5. L 17]
[0302] 鈷（II)啉酸 a, C-二酰胺還原酶[EC: 1. 16. 8. 1]
[0303] 鈷-前咕啉 5A 水解酶[EC: 3. 7. 1. 12]
[0304] 鈷-前咕啉-5B (Cl) -甲基轉(zhuǎn)移酶[EC: 2. L L 195]
[0305] 鈷-前咕啉-7 (C15)-甲基轉(zhuǎn)移酶[EC: 2. L L 196]
[0306] 鈷螯合酶 CobN [EC: 6. 6. L 2]
[0307] 鈷啉酸 a, C-二酰胺合酶[EC: 6. 3. 5. 9/6. 3. 5. 11]
[0308] 鐵蛋白[EC: L 16. 3. 1]
[0309] 谷氨酸-1-半醛2, 1-氨基變位酶[EC: 5. 4. 3. 8]
[0310] 谷氨酰-tRNA 還原酶[EC: 1. 2· 1. 70]
[0311] 谷氨酰-tRNA 合成酶[EC: 6. I. 1. 17]
[0312] 羥甲基膽色烷合酶[EC: 2. 5. L 61]
[0313] 煙酸-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶[EC: 2. 4. 2. 21]
[0314] 氧非依賴性糞卟啉原III氧化酶[EC: L 3. 99. 22]
[0315] 膽色素原合酶[EC: 4. 2. 1. 24]
[0316] 前咕啉_2脫氫酶/賽羅氫綠素（sirohydrochlorin)亞鐵螯合酶 [EC:1. 3. 1. 76/4. 99. 1. 4]
[0317] 前咕啉-2/鈷因子-2C20-甲基轉(zhuǎn)移酶[EC: 2. I. L 130/2. I. L 151]
[0318] 前咕啉-3B 合酶[EC: 1. 14. 13. 83]
[0319] 前咕啉-3B C17-甲基轉(zhuǎn)移酶[EC:2. I. 1. 131]
[0320] 前咕啉-4C11-甲基轉(zhuǎn)移酶[EC:2. L 1. 133]
[0321] 前咕啉-6X 還原酶[EC:1. 3. 1. 54]
[0322] 前咕啉-6Y C5, 15-甲基轉(zhuǎn)移酶[EC: 2. I. L 132]
[0323] 前咕啉-8W 脫羧酶[EC: L _· _· _]
[0324] 前咕啉-8X甲基變位酶[EC:5. 4. I. 2]
[0325] 賽羅氫綠素鈷螯合酶[EC:4. 99. I. 3]
[0326] 蘇氨酸-磷酸脫羧酶[EC:4. L L 81]
[0327] 尿卟啉原脫羧酶[EC:4. I. L 37]
[0328] 尿卟啉原III甲基轉(zhuǎn)移酶/合酶[EC: 2. L L 1074. 2. L 75]
[0329] 在一個具體的實施方案中，所述親代微生物缺乏編碼以下酶的一種或多種基因： 硫胺素生物合成蛋白ThiC(EC 4. 1.99. 17)、3_甲基-2-氧代丁酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶PanB(EC 2. 1.2. 11)、泛酸-β-丙氨酸連接酶PanC(EC 6. 3. 2. 1)和天冬氨酸1-脫羧酶Pan D(EC 4. I. I. 11)。在一個實施方案中，所述親代微生物缺乏編碼酶ThiC的基因。在另一個實施 方案中，所述親代微生物缺乏編碼PanB、PanC和PanD中的一種或多種或全部的一種或多種 酶。
[0330] 雖然本文以某些維生素生物合成途徑舉例說明了本發(fā)明，但是應(yīng)理解，可使用其 它生物合成途徑。通過本發(fā)明的知識，可使用數(shù)據(jù)庫比如Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KEGG(http://www. genome, jp/kegg/ ；Kanehisa et al.,2012, Nucleic Acids Res. 40, D109_D114;Kanehisa 和 Goto, 2000, Nucleic Acids Res. 28, 27-30)或 BioCyc(http://biocyc. org/;Caspi et al·，，2010,Nucleic Acids Res. 38:D473_479)對 任何測序的生物體進(jìn)行分析，以鑒定存在于特定生物合成途徑或從特定生物合成途徑缺失 的基因。
[0331] 所述親代微生物可選自任何厭氧微生物，在一個實施方案中，選自厭氧細(xì)菌。
[0332] 在一個實施方案中，微生物選自以下屬：梭菌屬、真細(xì)菌屬、消化鏈球菌屬、消化球 菌屬、放線菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、丙酸桿菌屬、擬桿菌屬、梭桿菌屬、彎曲桿菌屬或韋 永氏球菌屬。
[0333] 在一個具體的實施方案中，所述親代微生物選自一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌。在某 些實施方案中，所述微生物選自自產(chǎn)乙醇梭菌、楊氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏 梭菌、糞味梭菌、醋酸梭菌、蟻酸醋酸梭菌、大梭菌、甲基營養(yǎng)丁酸桿菌、伍氏醋酸桿菌、巴 氏嗜喊菌、Blautia producta、游泥真桿菌、熱醋穆爾氏菌、熱自養(yǎng)穆爾氏菌、卵形鼠孢菌、 Sporomusa silvacetica、球形鼠孢菌、普氏產(chǎn)醋桿菌和凱伍熱厭氧菌。
[0334] 在一個具體的實施方案中，所述親代微生物選自產(chǎn)乙醇、產(chǎn)乙酸梭菌屬的簇， 包括自產(chǎn)乙醇梭菌、楊氏梭菌和拉氏梭菌種以及相關(guān)分離株。這些包括但不限于以下 菌株：自產(chǎn)乙醇梭菌 JAI-It (DSM10061) [Abrini J，Naveau H，Nyns E-J: Clostridium autoethanogenum, sp. nov. , an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994, 4:345-351]、自產(chǎn)乙醇梭菌 LBS1560 (DSM19630) [Simpson SD，F(xiàn)orster RL，Tran PT, Rowe MJj Warner IL:Novel bacteria and methods thereof.國際專利 2009, W0/2009/064200]、自產(chǎn)乙醇梭菌 LBS1561 (DSM23693)、楊氏梭菌 PETCt(DSM13528 = ATCC 55383) [Tanner RSjMiller LMjYang D:Clostridium ljungdahlii sp.nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I.Int J Syst Bacteriol 1993,43:232-236]、楊氏梭菌ERI-2(ATCC 55380) [Gaddy JL:Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases.美國專利 1997, 5, 593, 886]、 楊氏梭菌C-01 (ATCC 55988) [Gaddy JL，Clausen EC，Ko C_W:Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth.美國專利 2002, 6,368, 819]、楊氏梭菌 0-52 (ATCC 55989) [Gaddy JL，Clausen ECj Ko C-W:Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth.美 國專利 2002, 6, 368, 819]、拉氏梭菌 PIIt(ATCC BAA-622) [Huhnke RL，Lewis RS，Tanner RS:Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.國際專利 2008, WO 2008/028055]，相關(guān)分離株如"科斯卡塔梭菌（C.coskatii)" [Zahn et al-Novel ethanologenic species Clostridium coskatii(美國專利申請?zhí)?US20110229947)] 和"梭菌屬種''（Clostridium sp.)(Tyurin et al·，2012, J. Biotech Res. 4:1-12)， 或突變菌株如楊氏梭菌 OTA-1 (Tirado-Acevedo 0· Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium I jungdahlii. PhD thesis, North Carolina State UniversityjOlO)。這些菌株形成梭菌rRNA簇I內(nèi)的亞簇，并且它們的16S rRNA基因 有99%以上是相同的，而具有約30%的相似的低GC含量。但是，DNA-DNA重新組合和DNA 指紋實驗顯不，這些菌株屬于不同的種[Huhnke RL，Lewis RS，Tanner RS:Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.國際專利 2008, WO 2008/028055]。
[0335] 該簇的所有菌種具有相似的形態(tài)和大?。▽?shù)生長細(xì)胞為0. 5-0. 7X3-5 μ m)， 是嗜溫的（最適生長溫度為30-37°C)，并且是嚴(yán)格厭氧菌[Tanner RsiMiller LM，Yang D:Clostridium Ijungdahlii sp. nov. , an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I.Int J Syst Bacteriol 1993, 43:232-236 ；Abrini JjNaveau HjNyns E-J: Clostridium autoethanogenum, sp. nov. , an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994,4:345-351 ;Huhnke RLj Lewis RS，Tanner RS:Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.國 際專利2008, WO 2008/028055]。此外，它們均共有相同的主要系統(tǒng)發(fā)育特征，如相同 的pH范圍（pH4-7. 5,最適的初始pH為5. 5-6)，基于含CO的氣體以相似的生長速率進(jìn) 行強(qiáng)的自養(yǎng)生長，以及類似的代謝譜--以乙醇與乙酸作為主要發(fā)酵終產(chǎn)物并且在某 些條件下形成的少量 2, 3-丁二醇與乳酸[Tanner RS，Miller LM，Yang D:Clostridium Ijungdahlii sp. nov. , an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I.Int J Syst Bacteriol 1993, 43:232-236 ；Abrini JjNaveau HjNyns E-J: Clostridium autoethanogenum, sp. nov. , an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994,4:345-351 ;Huhnke RLj Lewis RS，Tanner RS: Isolationand Characterization of novel Clostridial Species.國際專利 2008, WO 2008/028055]。所有的三個種觀察到了吲哚產(chǎn)生。但是，這些種在對不同糖（例如鼠李糖， 阿拉伯糖）、酸（例如葡糖酸、檸檬酸）、氨基酸（例如精氨酸、組氨酸）或其它底物（例如 甜菜堿、丁醇）的底物利用上是不同的。此外，發(fā)現(xiàn)一些種是某些維生素（例如硫胺素、生 物素）的營養(yǎng)缺陷型而其它種則不是。
[0336] 該簇的菌株由共有的特征定義，它們有著類似的基因型和表型，并且它們均具有 相同的保存能量和發(fā)酵代謝模式。該簇的菌株缺少細(xì)胞色素并通過Rnf復(fù)合體保存能量。
[0337] 該簇的所有菌株的基因組大小為約4. 2MBp的基因組大?。↘0pke et al.，2010) 和 GC 組成為約 32 % mol(Abrini et al.，1994 ; Kdpke et al. , 2010 ；Tanner et al.，1993) (WO 2008/028055 ;美國專利2011/0229947)，并且具有保守的必要關(guān)鍵基因 操縱子，所述操縱子編碼Wood-Ljungdahl途徑的酶（一氧化碳脫氫酶、甲?；?四氫 葉酸合成酶、亞甲基-四氫葉酸脫氫酶、甲酰基-四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基-四氫 葉酸還原酶和一氧化碳脫氫酶/乙酰基-CoA合酶）、氫化酶、甲酸脫氫酶、Rnf復(fù)合體 (rnf⑶GEAB)、丙酮酸：鐵氧還蛋白氧化還原酶、乙醒：鐵氧還蛋白氧化還原酶（K0pke et al.，2010, 2011)。已發(fā)現(xiàn)所述負(fù)責(zé)氣體攝取的Wood-Ljungdahl途徑基因的結(jié)構(gòu)和數(shù)目在 所有種中都是一樣的，盡管在核酸和氨基酸序列方面不同（ K0pke et al.，2011)。
[0338] 在一系列這些生物體中，已證實了羧酸還原成其相應(yīng)的醇（Perez, Richter, Loftu s，&Angenent, 2012)。
[0339] 因此，所述特征不是一種生物（如自產(chǎn)乙醇梭菌或楊氏梭菌）所特有的，而是一氧 化碳營養(yǎng)型的且能夠合成乙醇的梭菌屬的一般特征。因此，可預(yù)期本發(fā)明可用于這些菌株， 盡管表現(xiàn)上可能會有不同。
[0340] 可使用任意數(shù)量的本領(lǐng)域已知的用于產(chǎn)生重組微生物的技術(shù)由親代一氧化碳營 養(yǎng)型產(chǎn)乙酸微生物和一種或多種外源核酸制備本發(fā)明的重組一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸微生 物。僅舉例來說，轉(zhuǎn)化（包括轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染）可通過電穿孔、電融合、超聲、聚乙二醇介導(dǎo) 的轉(zhuǎn)化、接合或化學(xué)感受態(tài)和天然感受態(tài)來實現(xiàn)。合適的轉(zhuǎn)化技術(shù)記載于例如Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989。
[0341] 電穿孔已被描述用于若干一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌，如楊氏梭菌（K0pk.e et al. , 2010 ；Leang,Ueki,Nevin, &Lovley, 2012) (PCT/NZ2011/000203 ；W02012/053905), 自產(chǎn)乙醇梭菌（PCT/NZ2011/000203 ;W02012/053905)、伍氏醋酸桿菌（Striitz, Sauer, Kuhn, &Diirre, 1994)或熱醋穆爾氏菌（Kita et al·, 2012)，并且是用于很多梭菌如 丙酮丁醇梭菌（Mermelstein, Welker, Bennett, &Papoutsakis, 1992)、解纖維梭菌（Jenner t, Tardif, Young, &Young, 2000)或熱纖梭菌（MV Tyurin, Desai, &Lynd, 2004)的標(biāo)準(zhǔn)方法。
[0342] 電融合已被描述用于產(chǎn)乙酸梭菌菌屬種（Clostridium sp. )MT351 (Tyurin和 Kiriukhin, 2012)〇
[0343] 原噬菌體誘導(dǎo)已被描述用于一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌以及糞味梭菌（Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project Western Kentucky University)〇
[0344] 接合已被描述為產(chǎn)乙酸菌艱難梭菌（Clostridium difficile) (Herbert, 0'Keeff e, Purdy, Elmore, &Minton, 2003)和包括丙酮丁醇梭菌（Williams, Young, &Young, 1990)的 許多其它梭菌的可選方法。在一個實施方案中，所述親代菌株使用CO作為其唯一碳源和能 源。
[0345] 在一個實施方案中，所述親代微生物是自產(chǎn)乙醇梭菌或楊氏梭菌。在一個具體的 實施方案中，所述微生物是自產(chǎn)乙醇梭菌DSM23693。在另一個具體的實施方案中，所述微生 物是楊氏梭菌DSM13528 (或ATCC55383)。
[0346] 在一個具體的實施方案中，所述親代微生物是自產(chǎn)乙醇梭菌，所述生物合成途徑 是硫胺素或泛酸鹽生物合成途徑，而所述親代微生物缺乏基因 thiC或者panB、panC和panD 中的一種或多種。
[0347] 在一個具體的實施方案中，所述重組微生物被改造為適于表達(dá)在產(chǎn)生維生素的維 生素生物合成途徑中的一種或多種酶，所述維生素是微生物生長所需的并且不是天然存在 于所述親代微生物中。
[0348] 所述微生物可被改造為適于通過任意數(shù)量的重組方法表達(dá)一種或多種酶，所述方 法包括，例如，引入編碼不是天然存在于親代微生物中的酶并被改造為適于表達(dá)所述酶的 外源核酸。
[0349] 在本文他處定義了用于本發(fā)明的重組微生物的維生素和酶。
[0350] 在一個實施方案中，所述微生物包含一種或多種外源核酸，所述核酸編碼在本文 其它地方提及的一種或多種酶并被改造為適于表達(dá)所述酶。在一個實施方案中，所述微生 物包含編碼至少所述兩種酶并被改造為適于表達(dá)所述酶的一種或多種外源核酸。在其它實 施方案中，所述微生物包含編碼3、4、5或6種所述酶并被改造為適于表達(dá)所述酶的一種或 多種外源核酸。
[0351] 所述微生物可包含一種或多種外源核酸。當(dāng)需要用兩種或多種遺傳元件（如）轉(zhuǎn) 化親代微生物時，它們可被包含在一種或多種外源核酸上。
[0352] 在一個實施方案中，所述一種或多種外源核酸是核酸構(gòu)建體或載體，在一個具體 的實施方案中是質(zhì)粒，其編碼本文提及的一種或多種酶的任何組合。
[0353] 在轉(zhuǎn)化親代微生物時，所述外源核酸可保持在染色體外或可優(yōu)選地整合到所述親 代微生物的基因組中。因此，它們可以包含另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列被改 造為適于幫助整合（例如，可允許同源重組并靶向整合到宿主基因組中的區(qū)域）或幫助染 色體外構(gòu)建體的表達(dá)和復(fù)制（例如復(fù)制起點、啟動子和其它調(diào)控元件或序列）。
[0354] 在一個實施方案中，如前文提到的編碼一種或多種酶的外源核酸還將包含啟動 子，其被改造為適于促進(jìn)由所述外源核酸編碼的一種或多種酶的表達(dá)。在一個實施方案中， 所述啟動子是組成型啟動子，其優(yōu)選地在合適的發(fā)酵條件下具有高活性。還可使用誘導(dǎo)型 啟動子。在優(yōu)選的實施方案中，所述啟動子選自Wood-Ljungdahl基因簇和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/ 乙酸激酶啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，可指導(dǎo)表達(dá)（優(yōu)選在合適的發(fā)酵條件下高水平 表達(dá)）的其它啟動子可有效地作為所示例的實施方案的替代方案。
[0355] 在一個實施方案中，所述外源核酸是表達(dá)質(zhì)粒。
[0356] 核酸
[0357] 本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的重組微生物的核酸和核酸構(gòu)建體。
[0358] 所述核酸包含編碼一種或多種維生素生物合成途徑中的一種或多種酶的序列，這 些序列當(dāng)在微生物中表達(dá)時使得所述微生物能夠產(chǎn)生微生物生長所需的維生素。在一個具 體的實施方案中，本發(fā)明提供了編碼兩種或更多種酶的核酸。在一個實施方案中，本發(fā)明的 核酸編碼3、4、5或6種此類酶。
[0359] 本發(fā)明的核酸編碼維生素生物合成途徑中的一種或多種酶。在一個具體的實施方 案中，本發(fā)明的核酸編碼硫胺素、泛酸鹽、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、葉酸和氰鈷胺素中 的一種或多種的生物合成途徑中的一種或多種酶。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸編碼 前文表3至10中列出的一種或多種酶。
[0360] 在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的核酸編碼硫胺素生物合成途徑中的一種或多 種酶。在一個實施方案中，所述核酸編碼ThiC。
[0361] 在另一個實施方案中，本發(fā)明的核酸編碼泛酸鹽途徑中的一種或多種酶。在一個 具體的實施方案中，所述核酸編碼panB、panC或panD中的一種或多種或全部。
[0362] 考慮到本文、GenBank和其它數(shù)據(jù)庫中所含的信息以及遺傳密碼，技術(shù)人員會很容 易地了解編碼可用于本發(fā)明的酶或其功能等價變體的核酸序列。但是，僅舉例來說，編碼與 本發(fā)明相關(guān)的酶的示例性氨基酸序列和核酸序列可從數(shù)據(jù)庫如例如NCBI、KEGG和BRENDA 數(shù)據(jù)庫中獲得。
[0363] 僅舉例來說，在一個實施方案中，ThiC具有SEQ ID No. 3的序列，或為其功能等價 變體。進(jìn)一步舉例來說，在一個實施方案中，PanB具有YP_001309722. I(GenBank)的序列， 或為其功能等價變體，PanC具有YP_001309721. I(GenBank)的序列或為其功能等價變體， 并且panD具有YP_001309720. I (GenBank)的序列或為其功能等價變體。
[0364] 同樣地，僅舉例來說，在一個實施方案中，編碼ThiC的核酸具有SEQ ID No. 2 的序列或為其功能等價變體。進(jìn)一步舉例來說，在一個實施方案中，編碼PanB的核酸 具有Cbei_2610 ;Gene ID:5293811的序列或為其功能等價變體，編碼panC的核酸具有 Cbei_2609 ;Gene ID:5293810的序列或為其功能等價變體，并且編碼panD的核酸具有 Cbei_2608 ;Gene ID:5293809的序列或為其功能等價變體。
[0365] 在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸還會包含啟動子。在一個實施方案中，所述啟動 子允許在其控制下基因的組成型表達(dá)。但是，也可以采用誘導(dǎo)型啟動子。本領(lǐng)域的技術(shù)人 員將容易地了解本發(fā)明中使用的啟動子。優(yōu)選地，所述啟動子可指導(dǎo)在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件下 的高水平表達(dá)。在一個具體的實施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇啟動子。在另一個實施 方案中，使用磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶啟動子。在另一個實施方案中，使用丙酮酸：鐵氧還 蛋白氧化還原酶啟動子、Rnf復(fù)合體操縱子啟動子或ATP合酶操縱子啟動子。在一個具體 的實施方案中，所述啟動子來自自產(chǎn)乙醇梭菌。
[0366] 在轉(zhuǎn)化親代微生物時，本發(fā)明的核酸可保持在染色體外或者可優(yōu)選地被改造為適 于整合到所述微生物的基因組中。因此，本發(fā)明的核酸可以包含另外的核苷酸序列，所述另 外的核苷酸序列被改造為適于幫助整合（例如，可允許同源重組并靶向整合到宿主基因組 中的區(qū)域）或幫助染色體外構(gòu)建體的穩(wěn)定表達(dá)和復(fù)制（例如復(fù)制起點、啟動子和其它調(diào)控 序列）。
[0367] 在一個實施方案中，所述核酸是核酸構(gòu)建體或載體。在一個具體的實施方案中，所 述核酸構(gòu)建體或載體是表達(dá)構(gòu)建體或載體，但是，本發(fā)明涵蓋其它構(gòu)建體或載體（如用于 克隆的那些）。在一個具體的實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體或載體是質(zhì)粒。
[0368] 應(yīng)理解，除了啟動子以外，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體/載體還可包含任何多種調(diào)控元 件，以及需要時，可包含適于表達(dá)其它蛋白的另外基因。在一個實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建 體/載體包含一個啟動子。在另一個實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體/載體包含兩個或更多 個啟動子。在一個具體的實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體/載體包含用于每個待表達(dá)的基因 的一個啟動子。在一個實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體/載體包含一個或多個核糖體結(jié)合位 點，優(yōu)選用于每個待表達(dá)的基因的一個核糖體結(jié)合位點。
[0369] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本文描述的核酸序列和構(gòu)建體/載體序列可包含標(biāo)準(zhǔn)接 頭核苷酸，如核糖體結(jié)合位點和/或限制性位點所需要的那些。此類接頭序列不應(yīng)被解釋 為是必需的，也不應(yīng)限制所定義的序列。
[0370] 本發(fā)明的核酸和核酸構(gòu)建體（包括表達(dá)構(gòu)建體/載體）可使用任意數(shù)量的本領(lǐng)域 的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建。例如，可使用化學(xué)合成或重組技術(shù)。此類技術(shù)記載于例如Sambrook等 (Molecular Cloning:A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。其他示例性技術(shù)記載于下文的"實施例"部分。實質(zhì)上，所述個 體基因和調(diào)控元件將被可操作地相互連接以使得可表達(dá)所述基因來形成所需的蛋白。本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員會了解可用于本發(fā)明的合適的載體。但是，舉例來說，下述載體可能是合適 的：PMTL80000載體、pMPl、pJIR750以及下文"實施例"部分所中示例的質(zhì)粒。
[0371] 應(yīng)理解本發(fā)明的核酸可以是任何合適的形式，包括RNA、DNA或cDNA。
[0372] 本發(fā)明還提供了包含任何一種或多種本文所述核酸的宿主生物，特別是微生物， 包括病毒、細(xì)菌和酵母。
[0373] 可將所述一種或多種外源核酸以裸核酸形式遞送到親代微生物或可將其用一種 或多種可促進(jìn)轉(zhuǎn)化過程的試劑（例如，脂質(zhì)體綴合的核酸、其中包含所述核酸的有機(jī)體）配 制。合適時，所述一種或多種核酸可以是DNA、RNA或其組合。限制性抑制劑可用于某些實 施方案；參見，例如 Murray, N. E. et al. (2000)Microbial. Molec. Biol. Rev. 64, 412)。
[0374] 可使用任意數(shù)量的本領(lǐng)域中已知用于產(chǎn)生重組微生物的技術(shù)由親代微生物和一 種或多種外源核酸制備本發(fā)明的微生物。僅舉例來說，轉(zhuǎn)化（包括轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染）可通過電 穿孔、超聲、聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、化學(xué)感受態(tài)或天然感受態(tài)或接合來實現(xiàn)。合適的轉(zhuǎn)化技 術(shù)記載于例如 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989。
[0375] 在某些實施方案中，由于在待轉(zhuǎn)化的微生物中存在具有活性的限制性系統(tǒng)，需要 將待引入所述微生物的核酸甲基化。這可使用多種技術(shù)進(jìn)行，所述技術(shù)包括下文描述的那 些，其在下文"實施例"部分進(jìn)一步示例說明。
[0376] 舉例來說，在一個實施方案中，通過包括如下步驟的方法產(chǎn)生本發(fā)明的重組微生 物：
[0377] a.將⑴本文所述的表達(dá)構(gòu)建體/載體和（ii)包含甲基轉(zhuǎn)移酶基因的甲基化構(gòu) 建體/載體導(dǎo)入穿梭微生物；表達(dá)所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因；
[0378] b.從所述穿梭微生物分離一種或多種構(gòu)建體/載體；和，
[0379] c.將所述一種或多種構(gòu)建體/載體導(dǎo)入目標(biāo)微生物。
[0380] 在一個實施方案中，步驟B的甲基轉(zhuǎn)移酶基因是組成型表達(dá)的。在另一個實施方 案中，步驟B的甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)是誘導(dǎo)的。
[0381] 所述穿梭微生物是可促進(jìn)對構(gòu)成所述表達(dá)構(gòu)建體/載體的核酸序列甲基化的微 生物，優(yōu)選限制性酶陰性的微生物。在一個具體的實施方案中，所述穿梭微生物是限制 性陰性的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis)或乳酸乳球菌（Lactococcus Iactis)〇
[0382] 所述甲基化構(gòu)建體/載體包含編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。
[0383] 一旦所述表達(dá)構(gòu)建體/載體和甲基化構(gòu)建體/載體被導(dǎo)入所述穿梭微生物，存在 于所述甲基化構(gòu)建體/載體上的甲基轉(zhuǎn)移酶基因就被誘導(dǎo)?？赏ㄟ^任何合適的啟動子系統(tǒng) 進(jìn)行誘導(dǎo)，但在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述甲基化構(gòu)建體/載體包含誘導(dǎo)型Iac 啟動子，并通過加入乳糖或其類似物，更優(yōu)選異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)來誘導(dǎo)。 其它合適的啟動子包括ara、tet或T7系統(tǒng)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述甲基化構(gòu) 建體/載體啟動子是組成型啟動子。
[0384] 在一個具體的實施方案中，所述甲基化構(gòu)建體/載體具有對所述穿梭微生物類型 特異性的復(fù)制起點，以使存在于所述甲基化構(gòu)建體/載體上的任何基因均可在所述穿梭微 生物中表達(dá)。優(yōu)選地，所述表達(dá)構(gòu)建體/載體具有對所述目標(biāo)微生物類型特異性的復(fù)制起 點，以使存在于所述表達(dá)構(gòu)建體/載體上的任何基因均可在所述目標(biāo)微生物中表達(dá)。
[0385] 所述甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)可導(dǎo)致存在于所述表達(dá)構(gòu)建體/載體上的基因的甲基化。 然后，可根據(jù)多種已知方法中的任一種將所述表達(dá)構(gòu)建體/載體從所述穿梭微生物中分 離。僅舉例來說，可使用下文實施例部分描述的方法分離所述表達(dá)構(gòu)建體/載體。
[0386] 在一個具體的實施方案中，兩種構(gòu)建體/載體被同時分離。
[0387] 可使用任意數(shù)量的已知方法，將所述表達(dá)構(gòu)建體/載體導(dǎo)入所述目標(biāo)微生物。但 是，舉例來說，可使用下文實施例部分所述的方法。由于所述表達(dá)構(gòu)建體/載體是甲基化 的，存在于所述表達(dá)構(gòu)建體/載體上的核酸序列可被納入所述目標(biāo)微生物并成功表達(dá)。
[0388] 可以想到，可將甲基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)氪┧笪⑸锊⑦^表達(dá)。因此，在一個實施方案 中，可使用已知方法收集所產(chǎn)生的甲基轉(zhuǎn)移酶并在體外用于甲基化表達(dá)質(zhì)粒。然后，可將所 述表達(dá)構(gòu)建體/載體導(dǎo)入所述目標(biāo)微生物用于表達(dá)。在另一個實施方案中，將甲基轉(zhuǎn)移酶 基因?qū)胨龃┧笪⑸锏幕蚪M，然后將所述表達(dá)構(gòu)建體/載體導(dǎo)入所述穿梭微生物， 從所述穿梭微生物分離一種或多種構(gòu)建體/載體，然后將所述表達(dá)構(gòu)建體/載體導(dǎo)入所述 目標(biāo)微生物。
[0389] 可以想到，可將如上文所定義的表達(dá)構(gòu)建體/載體和甲基化構(gòu)建體/載體結(jié)合以 提供一種目標(biāo)組合物（a composition of matter)。這樣的組合物在繞過限制性屏障機(jī)制 以產(chǎn)生本發(fā)明的重組微生物方面特別有用。
[0390] 在一個具體的實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體/載體和/或甲基化構(gòu)建體/載體是 質(zhì)粒。
[0391] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會了了解可用于產(chǎn)生本發(fā)明的微生物的多種合適的甲基轉(zhuǎn) 移酶。但是，可使用例如枯草芽孢桿菌噬菌體ΦΤ1甲基轉(zhuǎn)移酶和具有SEQ ID 14的序列的 甲基轉(zhuǎn)移酶或其功能等價變體?？紤]到所需甲基轉(zhuǎn)移酶的序列和遺傳密碼，應(yīng)容易地了解 編碼合適的甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸。在一個實施方案中，編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸為SEQ ID 15 的核酸，或為其功能等價變體。
[0392] 可以使用任意數(shù)量的被改造為適于表達(dá)甲基轉(zhuǎn)移酶基因的構(gòu)建體/載體，來產(chǎn)生 所述甲基化構(gòu)建體/載體。但是，舉例來說，可使用下文實施例部分描述的質(zhì)粒。
[0393] 產(chǎn)牛方法
[0394] 本發(fā)明提供了通過用本發(fā)明的重組微生物對底物進(jìn)行微生物發(fā)酵而產(chǎn)生一種或 多種所需產(chǎn)物的方法。
[0395] 適于厭氧發(fā)酵的任何底物均可用于發(fā)酵，包括例如碳水化合物、糖、含CO的底物、 含二氧化碳和氫氣的底物、甘油、脂肪酸、淀粉、糖蜜、戊糖和己糖、生物質(zhì)。在一個實施方案 中，所述底物是含CO的底物。在所述實施方案中，本發(fā)明的方法可用于減少來自工業(yè)過程 的總的大氣碳排放。
[0396] 優(yōu)選地，所述發(fā)酵包括使用本發(fā)明的重組微生物在生物反應(yīng)器中發(fā)酵底物從而產(chǎn) 生所述一種或多種產(chǎn)物的步驟。
[0397] 在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟：
[0398] (a)將底物提供至包含本發(fā)明的一種或多種微生物的培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器；和
[0399] (b)在所述生物反應(yīng)器中厭氧發(fā)酵所述培養(yǎng)物以產(chǎn)生所述一種或多種產(chǎn)物。
[0400] 在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟：
[0401] (a)在由工業(yè)過程產(chǎn)生的含CO的氣體釋放到大氣中之前，將所述氣體捕獲；
[0402] (b)通過包含一種或多種本發(fā)明微生物的培養(yǎng)物厭氧發(fā)酵所述含CO的氣體以產(chǎn) 生所述一種或多種產(chǎn)物。
[0403] 在本發(fā)明的一個實施方案中，被所述微生物發(fā)酵的氣態(tài)底物是含CO的氣態(tài)底物。 所述氣態(tài)底物可以是作為工業(yè)過程副產(chǎn)物獲得的或從某些其它來源（如汽車廢氣）獲得的 含CO的廢氣。在某些實施方案中，所述工業(yè)過程選自鐵金屬產(chǎn)品制備（如鋼廠）、有色金屬 產(chǎn)品制備、石油精煉過程、煤的氣化、電力生產(chǎn)、炭黑生產(chǎn)、氨生產(chǎn)、甲醇生產(chǎn)和焦炭制備。在 這些實施方案中，可在所述含CO的氣體被排放到大氣中之前使用任意方便的方法從所述 工業(yè)過程中將其捕獲。所述⑶可以是合成氣（含一氧化碳和氫氣的氣體）的組分。從工 業(yè)過程產(chǎn)生的CO通常被燃燒掉以產(chǎn)生CO 2，因此本發(fā)明在減少0)2溫室氣體排放并產(chǎn)生用 作生物燃料的丁醇方面尤其有用。根據(jù)所述含CO的氣態(tài)底物的組成，還可能需要對其進(jìn)行 處理，以在將其導(dǎo)入所述發(fā)酵之前除去任何不合需要的雜質(zhì)如塵粒。例如，可使用已知的方 法過濾或洗滌所述氣態(tài)底物。
[0404] 應(yīng)理解，為使所述細(xì)菌生長并發(fā)生底物到所述一種或多種產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，除所述底 物之外，需要將合適的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)料至所述生物反應(yīng)器。所述底物和培養(yǎng)基可以連 續(xù)、分批或分批補(bǔ)料方式進(jìn)料至所述生物反應(yīng)器。如本領(lǐng)域中已知的，營養(yǎng)培養(yǎng)基會包含多 種足以允許所使用的微生物存活和/或生長的化合物。合適的厭氧和有氧發(fā)酵培養(yǎng)基是本 領(lǐng)域中已知的。例如，Biebel (2001)記載了合適的培養(yǎng)基。但是，由于重組微生物能夠產(chǎn) 生維生素，因此本發(fā)明具有不必在培養(yǎng)基中包含一種或多種維生素的優(yōu)勢。因此，可使用 基本培養(yǎng)基，從而降低成本。此外，重組微生物的生長和發(fā)酵通常涉及向培養(yǎng)基中加入選擇 化合物，通常為一種或多種抗生素，以使得正選擇重組微生物，并且任何污染性微生物不存 活?？股氐氖褂迷黾恿税l(fā)酵成本，并且可能存在其它缺點如毒性。本發(fā)明避免了對抗生 素的需要。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述培養(yǎng)基如后文實施例部分中所述。
[0405] 合乎需要地，所述發(fā)酵應(yīng)在用于發(fā)生從所述底物到所述一種或多種產(chǎn)物的發(fā)酵的 合適條件下進(jìn)行。應(yīng)考慮的反應(yīng)條件包括壓力、溫度、氣體流速、液體流速、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng) 基氧化還原電勢、攪拌速率（如果使用連續(xù)攪拌釜反應(yīng)器的話）、接種物水平、確保底物不 成為限制的最大底物濃度和避免產(chǎn)物抑制的最大產(chǎn)物濃度。
[0406] 如果使用含CO的底物，通常需要提高底物流中的CO濃度（或氣態(tài)底物中的CO分 壓），并因此提高CO作為底物時發(fā)酵反應(yīng)的效率。在增加的壓力下操作可顯著增加 CO從 氣相轉(zhuǎn)移到液相的速率，在液相中CO可被所述微生物作為碳源攝取用于產(chǎn)生所述一種或 多種產(chǎn)物。這繼而意味著，當(dāng)生物反應(yīng)器保持在升高的壓力而非大氣壓力下時，可減少保 留時間（定義為生物反應(yīng)器中的液體體積除以輸入氣體流速）。最佳反應(yīng)條件將部分地取 決于本發(fā)明所使用的具體微生物。但是，一般來講，優(yōu)選所述發(fā)酵在高于環(huán)境壓力的壓力 下進(jìn)行。并且，因為給定的CO到所述一種或多種產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率部分地是所述底物保留時 間的函數(shù)，并且實現(xiàn)所需保留時間進(jìn)而限定了生物反應(yīng)器的所需體積，因此使用增壓系統(tǒng) 可大大地減小所需的生物反應(yīng)器體積，從而降低所述發(fā)酵設(shè)備的資本成本。根據(jù)美國專利 no. 5, 593, 886中給出的實例，反應(yīng)器體積的減小可與反應(yīng)器操作壓力的升高成線性比例， 艮P，在10個大氣壓下操作的生物反應(yīng)器只需要在1個大氣壓下操作的那些生物反應(yīng)器體積 的 1/10。
[0407] 舉例來說，已經(jīng)描述了在升高的壓力下進(jìn)行氣體到乙醇的發(fā)酵的有益效果。例如， WO 02/08438描述了在30psig和75psig的壓力下進(jìn)行的氣體到乙醇的發(fā)酵，得到的乙醇產(chǎn) 率分別為150g/l/天和369g/l/天。但是，發(fā)現(xiàn)在大氣壓下使用相似的培養(yǎng)基和輸入氣體 組成進(jìn)行的示例性發(fā)酵產(chǎn)生1/20到1/10的乙醇/升/天。
[0408] 還需要的是，含CO的氣態(tài)底物的導(dǎo)入速率是這樣的，即確保液相中的CO濃度不會 成為限制。這是因為CO受限的條件的結(jié)果可能是產(chǎn)物被所述培養(yǎng)物消耗。
[0409] 用于進(jìn)料給發(fā)酵反應(yīng)的氣流的組成可對所述反應(yīng)的效率和/或成本有顯著影響。 例如，O 2可降低厭氧發(fā)酵過程的效率。在發(fā)酵之前或之后的發(fā)酵過程各階段中，對不需要的 或不必要的氣體的處理可增加這些階段的負(fù)擔(dān)（例如，當(dāng)在氣體流進(jìn)入生物反應(yīng)器之前將 氣體流壓縮時，則可能使用不必要的能量來壓縮發(fā)酵中不需要的氣體）。因此，可能需要處 理底物流（特別是來自工業(yè)來源的底物流）以除去不需要的組分并提高所需組分的濃度。
[0410] 在某些實施方案中，將本發(fā)明的細(xì)菌培養(yǎng)物維持在水性培養(yǎng)基（依據(jù)本發(fā)明，其 不含一種或多種維生素）中。優(yōu)選地，所述水性培養(yǎng)基是基本微生物生長培養(yǎng)基。合適的 培養(yǎng)基是本領(lǐng)域中已知的，并且被記載于例如美國專利no. 5, 173, 429和5, 593, 886以及WO 02/08438中，并且如下文實施例部分所述。
[0411] 可通過本領(lǐng)域已知的方法如分餾或蒸發(fā)、滲透蒸發(fā)、氣提和萃取發(fā)酵（包括例如 液-液萃?。陌l(fā)酵液中回收所述一種或多種產(chǎn)物。
[0412] 在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，可通過以下方式從所述發(fā)酵液中回收所述一種 或多種產(chǎn)物：從所述生物反應(yīng)器中連續(xù)移出部分發(fā)酵液，從所述發(fā)酵液中分離微生物細(xì)胞 (方便地通過過濾），并從所述發(fā)酵液中回收一種或多種產(chǎn)物。醇可通過例如蒸餾方便地回 收。丙酮可通過例如蒸餾回收。所產(chǎn)生的任何酸可通過例如吸附在活性炭上來回收。優(yōu)選 地將分離的微生物細(xì)胞返回到所述發(fā)酵生物反應(yīng)器中。優(yōu)選地將已移除任何醇和酸之后剩 余的無細(xì)胞滲透物返回至所述發(fā)酵生物反應(yīng)器。
[0413] 維生素可使用任何適當(dāng)?shù)姆椒ɑ厥?。但是，舉例來說，可通過濃縮并干燥細(xì)胞（例 如離心或噴霧干燥）隨后提?。ɡ缭诖贾惺褂蒙V法或只是通過差速離心來純化和過 濾）并結(jié)晶來回收維生素 （Survase et al·，2006, Food Technol. Biotechnol. 44:381-96)。
[0414] 在一個實施方案中，所述一種或多種產(chǎn)物（在一個具體的實施方案中是一種或多 種維生素）是從所述發(fā)酵中回收，并傳送到一個或多個其他生物反應(yīng)器中以支持一種或多 種第二微生物的生長，或支持一種或多種第二微生物對底物的發(fā)酵。
[0415] 在一個實施方案中，所述一種或多種第二微生物是這樣的微生物，即不能產(chǎn)生或 不能以足夠的水平產(chǎn)生所述一種或多種維生素，并需要向其生長或發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)充所述一 種或多種維生素以確?；蚓S持生長或發(fā)酵，或提高生長或發(fā)酵效率。
[0416] 可使用任何合適的導(dǎo)管將從第一發(fā)酵中回收的所述一種或多種產(chǎn)物傳送到一個 或多個其他生物反應(yīng)器。
[0417] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法還可以包括由所述一種或多種第二微生物對底 物發(fā)酵以產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物。在一個實施方案中，然后可從所述發(fā)酵液中回收所述一種 或多種產(chǎn)物。
[0418] 詵擇方法
[0419] 本發(fā)明還提供了在混合的微生物群中選擇微生物A的方法，其中微生物A是包含 至少一種外源核酸的重組微生物，所述外源核酸被改造為適于表達(dá)在產(chǎn)生所述混合的微生 物群生長所需的一種或多種維生素的一種或多種維生素生物合成途徑中的一種或多種酶。
[0420] 所述方法包括使混合的微生物群經(jīng)受包括缺乏微生物生長所需的所述一種或多 種維生素的培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件。不能產(chǎn)生所述一種或多種維生素的那些微生物將不會生長 或?qū)⒈回?fù)選擇。
[0421] 在其它實施方案中，所述一種或多種酶如前文所述。所述一種或多種維生素如前 文所述。在一個具體的實施方案中，所述一種或多種維生素選自硫胺素、泛酸鹽、核黃素、煙 酸、吡哆醇、生物素、葉酸和/或氰鈷胺素。
[0422] "培養(yǎng)條件"可以是實現(xiàn)至少維持微生物A的培養(yǎng)物的任何合適的條件，并包括適 于生長和/或發(fā)酵的條件?？紤]到微生物的性質(zhì)和本文包含的信息，技術(shù)人員將認(rèn)識到合 適的條件。但是，舉例來說，生長條件包括合適的環(huán)境條件，包括pH、存在或不存在氧以及其 它氣體、鹽度、溫度等。
[0423] 可以使用任何合適的培養(yǎng)基，只要其如前文所述不含微生物生長所需的所述一種 或多種維生素（其可由微生物A產(chǎn)生）。技術(shù)人員將容易地認(rèn)識到多種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基。但 是，在一個實施方案中，所述培養(yǎng)基是基本培養(yǎng)基。
[0424] 雖然本發(fā)明克服了對使用替代選擇方法或?qū)⑴囵B(yǎng)基補(bǔ)充如抗生素的成分的需要， 但是如果需要的話，這些方法可與本發(fā)明相結(jié)合。
[0425] 本發(fā)明該方面的方法可用于在產(chǎn)生重組微生物的過程中區(qū)分重組與非重組微生 物，例如在轉(zhuǎn)化過程中區(qū)分成功轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。
[0426] 所述方法還可用于在實驗室或商業(yè)規(guī)模的微生物培養(yǎng)和/或發(fā)酵反應(yīng)期間負(fù)選 擇污染性微生物的目的。沒有選擇措施時，不合需要的微生物可生長至危害所需的微生物， 或以其它方式影響培養(yǎng)或發(fā)酵反應(yīng)的效率。
[0427] 因此，本發(fā)明還提供了防止一種或多種不合需要的微生物在微生物培養(yǎng)物或發(fā)酵 液中生長的方法，其中所述微生物培養(yǎng)物或發(fā)酵液包含微生物A和營養(yǎng)培養(yǎng)基，其中微生 物A是包含至少一種外源核酸的重組微生物，所述核酸被改造為適于表達(dá)在產(chǎn)生一種或多 種微生物A和不合需要的微生物生長所需的維生素的一種或多種維生素生物合成途徑中 的一種或多種酶，以使得微生物A可產(chǎn)生所述一種或多種維生素，其中所述培養(yǎng)基缺乏所 述一種或多種維生素。
[0428] 本發(fā)明還提供了用于微生物A的選擇性生長或培養(yǎng)的方法，并且其中微生物A是 包含至少一種外源核酸的重組微生物，所述核酸被改造為適于表達(dá)在產(chǎn)生一種或多種微生 物生長所需的維生素的一種或多種維生素生物合成途徑中的一種或多種酶，以使得微生物 A可產(chǎn)生所述一種或多種維生素，并且其中生長或培養(yǎng)培養(yǎng)基缺乏所述一種或多種維生素。
[0429] 在一個實施方案中，所述條件負(fù)選擇一種或多種不合需要的微生物的生長。
[0430] 在另一方面，本發(fā)明提供了通過微生物A對底物進(jìn)行微生物發(fā)酵而產(chǎn)生一種或多 種產(chǎn)物的方法，其中微生物A是包含至少一種外源核酸的重組微生物，所述核酸被改造為 適于表達(dá)在產(chǎn)生一種或多種微生物生長所需的維生素的一種或多種維生素生物合成途徑 中的一種或多種酶，以使得微生物A可產(chǎn)生所述一種或多種維生素，并且其中發(fā)酵在缺乏 所述一種或多種維生素的生長培養(yǎng)基之中或之上進(jìn)行。
[0431] 在一個實施方案中，所述條件正選擇微生物A的生長并且負(fù)選擇一種或多種不合 需要的微生物的生長。
[0432] 應(yīng)理解，本發(fā)明該方面的微生物（包括重組微生物A)可選自任何目的微生物，并 且不限于厭氧菌。但是，在一個實施方案中，它們選自厭氧微生物。在一個實施方案中，它 們選自一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌。
[0433] 可容易地采用前文描述的產(chǎn)生本發(fā)明其它方面的厭氧重組微生物的方法以及本 領(lǐng)域中已知的方法來產(chǎn)生將在本發(fā)明該方面中選擇的重組微生物,在必要時進(jìn)行調(diào)整以適 應(yīng)具體的微生物。例如，如果所述微生物不是厭氧菌，則可使用有氧條件。所述親代微生物 可選自任何類的微生物，并且不限于厭氧菌。但是，在一個實施方案中，它們可選自厭氧微 生物，并在一個具體的實施方案中，選自一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌。
[0434] 相似地，根據(jù)目的微生物的類型的需要，采用所調(diào)整的條件（例如，取代厭氧和有 氧條件），可將本發(fā)明其它方面所述的生長和發(fā)酵方法用于本發(fā)明的該方面。
[0435] 本發(fā)明還提供了根據(jù)前文所述的方法培養(yǎng)或生長的微生物，以及通過如前文所述 的方法產(chǎn)生的產(chǎn)物。
[0436] 實施例
[0437] 現(xiàn)將參照以下非限制性實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0438] 方法
[0439] 楊氏梭菌、自產(chǎn)乙醇梭菌和拉氏梭菌的維生素生物合成途徑的分析
[0440] 本發(fā)明人分析了一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌楊氏梭菌（NC_014328. I ; K0pke et al.，2010, Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A.，107:13087-13092)、自產(chǎn)乙醇梭菌和拉氏梭菌的基 因組。據(jù)發(fā)現(xiàn)，由于缺乏參與由1_(5' -磷酸核糖）-5-氨基咪唑核糖核苷酸（AIR)合成4-氨 基-5-羥甲基-2-甲基嘧啶的硫胺素生物合成蛋白ThiC，楊氏梭菌以及自產(chǎn)乙醇梭菌兩 者都不能合成硫胺素。ThiC是已經(jīng)鑒定用于大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌（S. typhimurium) 和枯草芽孢桿菌中嘧啶生物合成的唯一需要的基因產(chǎn)物（Begeley et al，1999，Arch Microbiol, 171:293-300)。另一方面，ThiC和整個硫胺素生物合成途徑也存在于拉氏梭菌 和其它生物體中。在血清瓶和發(fā)酵實驗中證明了楊氏梭菌和自產(chǎn)乙醇梭菌的硫胺素營養(yǎng)缺 陷型，從而確認(rèn)了需要將硫胺素加入發(fā)酵培養(yǎng)基中（見下文）。
[0441] 據(jù)發(fā)現(xiàn)，在所有三種生物體：楊氏梭菌、自產(chǎn)乙醇梭菌和拉氏梭菌中，由于缺乏生 物合成基因 panBCD，泛酸鹽/CoA生物合成途徑是不完整的，所述生物合成基因編碼3-甲 基-2-氧代丁酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（EC:2. 1.2. 11 ;催化5, 10-亞甲基四氫葉酸和3-甲基-2-氧 代丁酸轉(zhuǎn)化成四氫葉酸和2-脫氫泛酸）、泛酸-β -丙氨酸連接酶（EC:6. 3. 2. 1 ;催化 (R)-泛酸+ β-丙氨酸反應(yīng)為二磷酸+泛酸）以及天冬氨酸1-脫羧酶（EC:4. I. I. 11 ;催化 L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化成β -丙氨酸）。
[0442] 這個概念可擴(kuò)展到梭菌屬的其它種，包括不產(chǎn)乙酸的梭菌屬種或其它產(chǎn)乙 酸的菌種。可從公共資源如 NCBI (/genome/browse/)或 KEGG(genome. jp/kegg-bin/ get_hteXt)獲得基因組，然后分析編碼表1-8所列的維生素生物合成蛋白的基因的存 在。例如，據(jù)發(fā)現(xiàn)，在最近測序的另一種一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌伍氏醋酸桿菌中，基 因 pan⑶也缺失（Poehlein et al.，2012)，或者在另一梭菌屬種如發(fā)酵植物多糖梭菌 (C. phytofermentans)中panB⑶基因缺失，而泛酸鹽途徑的所有其它基因均存在。
[0443] 使用楊氏梭菌、自產(chǎn)乙醇梭菌和拉氏梭菌在不含硫胺素的培養(yǎng)基中的生長實驗
[0444] 使用得自DSMZ(德國微生物菌種保藏中心，德國布倫瑞克， Inhoffenstra β e 7 B,38124 (The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, InhoffenstraPe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany))的自產(chǎn)乙醇梭菌 DSM10061和DSM23693(DSM10061的衍生株）以及楊氏梭菌進(jìn)行實驗。拉氏梭菌ATCC BAA-622來源自ATCC(美國，VA 20108,馬納薩斯的美國典型培養(yǎng)物收藏中心（American Type Culture Collection, Manassas, VA 20108,USA))。
[0445] 使用嚴(yán)格厭氧條件和技術(shù)（Hungate, 1969, Methods in Microbiology,第 3B 卷· Academic Press, New York:117-132 ;Wolfe，1971，Adv. Microb. Physiol.，6:107-146) 在37°C下在化學(xué)上確定成分的不含酵母提取物的PETC培養(yǎng)基（表9)中培養(yǎng)所有菌株。 30psi的含一氧化碳的鋼廠廢氣（收集自New Zealand Steel site in Glenbrook, NZ ;組 成：44% C0、32% N2、22% C02、2% H2)作為唯一碳源和能源。
[0446] 表· 9 :PETC 培養(yǎng)基
[0447]

【權(quán)利要求】
1. 一種將含CO的氣態(tài)底物中的CO轉(zhuǎn)化成較高分子量的產(chǎn)物的方法，所述方法包括： 將所述含C0的氣態(tài)底物傳送到包含在培養(yǎng)基中的一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌的培養(yǎng)物 的生物反應(yīng)器中，使得所述細(xì)菌將C0轉(zhuǎn)化成較高分子量的產(chǎn)物，以及 從所述生物反應(yīng)器中回收所述較高分子量的產(chǎn)物， 其中所述一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌經(jīng)遺傳工程改造以表達(dá)所述培養(yǎng)基中不存在的必 需營養(yǎng)素的生物合成途徑中的酶，并且其中所述一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌借助編碼所述酶 的外源基因而成為對選自硫胺素、泛酸鹽、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、葉酸和氰鈷胺素 的必需營養(yǎng)素原養(yǎng)型的。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)菌借助異源thiC基因和/或異源panBCD基因簇而 成為對硫胺素和/或泛酸鹽原養(yǎng)型的。
3. -種分離的、經(jīng)遺傳工程改造的一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌，其借助表達(dá)的外源基因 而成為對選自硫胺素、泛酸鹽、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、葉酸和氰鈷胺素的維生素原 養(yǎng)型的，所述外源基因編碼產(chǎn)生所述維生素的生物合成途徑中的酶。
4. 權(quán)利要求3的細(xì)菌，其借助異源thiC基因和/或異源panBCD基因簇而成為對硫胺 素和/或泛酸鹽原養(yǎng)型的。 5?權(quán)利要求3的細(xì)菌，其選自自產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)、 楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei)、食一氧 化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌（Clostridium drakei)、奠味 梭菌（Clostridium scatologenes)、醋酸梭菌（Clostridium aceticum)、蟻酸醋酸梭 菌（Clostridium formicoaceticum)、大梭菌（Clostridium magnum)、甲基營養(yǎng)丁酸桿 菌（Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏醋酸桿菌（Acetobacterium woodii) > 巴氏嗜喊菌（Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、游泥真桿菌（Eubacterium limosum)、熱醋穆爾氏菌（Moorella thermoacetica)、熱自養(yǎng)穆爾氏菌（Moorella thermautotrophica)、卵形鼠抱菌（Sporomusa ovata) > Sporomusa silvacetica、球形鼠 抱菌（Sporomusa sphaeroides)、普氏產(chǎn)醋桿菌（Oxobacter pfennigii)和凱伍熱厭氧菌 (Thermoanaerobacter kiuvi)〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)菌，其在不存在所述異源thiC基因的情況下不能將4-氨 基咪唑核糖核苷酸轉(zhuǎn)化成4-氨基-5-羥甲基-2-甲基嘧啶。
7. 權(quán)利要求4的細(xì)菌，其中所述異源thiC基因來自拉氏梭菌。
8. 權(quán)利要求3的細(xì)菌，其在質(zhì)粒消除時為硫胺素營養(yǎng)缺陷型的。
9. 權(quán)利要求3的細(xì)菌，其在質(zhì)粒消除時為泛酸鹽營養(yǎng)缺陷型的。
10. 權(quán)利要求4的細(xì)菌，其中所述異源panBCD基因簇來自拜氏梭菌 (C.beijerenckei) 〇
11. 一種培養(yǎng)權(quán)利要求3的細(xì)菌的方法，所述方法包括在包含氣態(tài)碳源的培養(yǎng)基中使 所述細(xì)菌生長，其中所述碳源包括C0。
12. -種培養(yǎng)權(quán)利要求3的細(xì)菌的方法，所述方法包括在包含能源的培養(yǎng)基中使所述 細(xì)菌生長，其中所述能源包括C0。
13. 權(quán)利要求11或12的方法，其中所述培養(yǎng)是嚴(yán)格厭氧的。
14. 權(quán)利要求11或12的方法，其中所述細(xì)菌包含異源thiC基因并且所述培養(yǎng)基不含 硫胺素。
15. 權(quán)利要求11或12的方法，其中所述細(xì)菌包含異源panBCD基因簇并且所述培養(yǎng)基 不含泛酸鹽。
16. 權(quán)利要求11或12的方法，其中所述氣態(tài)碳源包括選自以下的產(chǎn)物：汽車廢氣、來 自鐵金屬產(chǎn)品制備的廢氣、來自有色金屬產(chǎn)品制備的廢氣、來自石油精煉過程的廢氣、來自 煤的氣化的廢氣、來自電力生產(chǎn)的廢氣、來自炭黑生產(chǎn)的廢氣、來自氨生產(chǎn)的廢氣、來自甲 醇生產(chǎn)的廢氣、來自焦炭制備的廢氣和合成氣。
17. 權(quán)利要求11或12的方法，其中所述碳源包括鋼廠廢氣。
18. -種將異源核酸轉(zhuǎn)移到一群為對必需營養(yǎng)素營養(yǎng)缺陷型的一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸 菌中的方法，所述方法包括： 用包含必需營養(yǎng)素的生物合成途徑中的外源基因的第一核酸轉(zhuǎn)化所述細(xì)菌，所述基因 可操作地連接到啟動子； 在所述轉(zhuǎn)化的細(xì)菌之中選擇對所述必需營養(yǎng)素原養(yǎng)型的細(xì)菌。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述轉(zhuǎn)化步驟包括用第二核酸共轉(zhuǎn)化所述細(xì)菌，所述第 二核酸包含當(dāng)在所述細(xì)菌中表達(dá)時賦予所需性質(zhì)的異源或內(nèi)源基因。
20. 權(quán)利要求18的方法，其中所述必需營養(yǎng)素選自硫胺素、泛酸鹽、核黃素、煙酸、吡哆 醇、生物素、葉酸和氰鈷胺素。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述必需營養(yǎng)素是硫胺素或泛酸鹽，并且所述異源核酸 分別是thiC基因或panB⑶基因簇。
22. 權(quán)利要求19的方法，其中所述第一和第二核酸在單獨(dú)的分子上。
23. 權(quán)利要求19的方法，其中所述第一和第二核酸在相同的分子中。
24. 權(quán)利要求18的方法，所述方法還包括針對所述第一核酸或第二核酸的存在情況篩 選原養(yǎng)型、轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的步驟。
25. 權(quán)利要求19的方法，其中在共轉(zhuǎn)化步驟之前對所述第一和第二核酸進(jìn)行處理以形 成甲基化的第一和第二核酸。
26. -種分離的、經(jīng)遺傳工程改造的細(xì)菌，其借助表達(dá)的外源基因而成為對維生素或必 需營養(yǎng)素原養(yǎng)型的，所述外源基因編碼產(chǎn)生所述維生素的生物合成途徑中的酶，其中所述 細(xì)菌使用原養(yǎng)型作為轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中在不存在任何其它選擇劑的情況下所述細(xì)菌使用原養(yǎng)型 作為轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記。
28. 權(quán)利要求26的方法，其中所述光養(yǎng)是針對選自硫胺素、泛酸鹽、核黃素、煙酸、吡哆 醇、生物素、葉酸和氰鈷胺素的維生素。
29. 權(quán)利要求26的方法，其中所述經(jīng)遺傳工程改造的細(xì)菌是一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸 菌。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中所述細(xì)菌是梭菌。
【文檔編號】C12P3/00GK104487580SQ201380039316
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月23日
【發(fā)明者】M·科普克, B·阿爾-西納維 申請人:新西蘭郎澤科技公司