聚合物的測量的分析的制作方法
【專利摘要】分析了聚合物通過納米孔易位過程中進(jìn)行的聚合物的時序系列的測量。測量取決于納米孔中的k鏈節(jié)的特性，k鏈節(jié)是聚合物的k個聚合物單元，其中，k是正整數(shù)。所述方法包括：從測量系列得出代表測量特性的時序特征的特征向量；以及測定得出的特征向量和至少一種其他特征向量之間的相似性。
【專利說明】聚合物的測量的分析

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明總體上涉及分析在聚合物通過納米孔的易位過程中進(jìn)行的包含聚合物單 元的聚合物，例如但不限于多核苷酸的測量的領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 通常，通過使用膜限制溶液的兩個池之間的物質(zhì)流動，進(jìn)行納米孔測量。提供在膜 中的孔以允許物質(zhì)從溶液的一個池轉(zhuǎn)移到另一個?？拙哂屑{米尺度上的至少一個尺寸。隨 著物質(zhì)通過孔易位，測量該物質(zhì)。最常用的設(shè)置依賴施加電壓的應(yīng)用以驅(qū)動分子物種通過 納米孔。將電極放置在每個溶液體積中，并且溶液包含電解質(zhì)，通常為鹽，如I M NaCl。在 電極之間施加的電壓還驅(qū)動電解質(zhì)通過孔并且產(chǎn)生電流。當(dāng)物質(zhì)通過孔時，其改變在電流 測量中直接觀察到的離子的流動。電流阻塞的程度和物質(zhì)花費(fèi)在納米孔中的持續(xù)時間指示 物質(zhì)的特性。
[0003] 通過使聚合物通過納米孔來分析聚合物的原始概念由Branton等人 (US-5, 795, 782)在1996年提出。在這種情況下，DNA分子通過嵌入在脂膜中的納米孔。將 電極放置在膜的每一側(cè)上，并且施加的電壓用于驅(qū)動DNA分子從膜的一側(cè)至另一側(cè)。在DNA 分子的易位過程中，測量通過孔的跨膜電流。示出的是：當(dāng)DNA通過納米孔時，DNA的不同 序列將引起不同的觀察電流。使用核苷酸的均聚物進(jìn)行這些早期實(shí)驗(yàn)，其中，聚合物自由地 易位納米孔。在這些實(shí)驗(yàn)中，聚合物易位的速率非常快（?5 ii s/堿基），造成聚合物中的 單個核苷酸的特性難以確定。
[0004] 為了克服快速DNA易位的限制，Branton等人公開了使用聚合酶以控制DNA通過 納米孔易位的速度。該優(yōu)雅方案已經(jīng)被本領(lǐng)域中的許多研究者采用并修改，其已經(jīng)導(dǎo)致了 許多出版物?；靖拍钍墙o聚合物的運(yùn)動提供棘輪，這可以包括分子發(fā)動機(jī)或分子制動。
[0005] 早期研究集中在使用聚合酶來控制DNA的運(yùn)動。使用Klenow片段進(jìn)行了許多研 究，但這些實(shí)驗(yàn)受限于納米孔頂部上的DNA-酶復(fù)合物的短持續(xù)時間。研發(fā)了許多方案以補(bǔ) 償這種弱結(jié)合（例如，參見 Olasagasti 等，Nat Nanotechnol. 2010 Nov ;5 (11) : 798-806， Ashkenasy 等，Angew Chem Int Ed Engl. 2005 Feb 18 ;44 (9): 1401-4)。
[0006] 在2010, Akeson等人公開了 Phi29 DNA聚合酶（DNAP)可以在納米 孔的頂部上起作用（例如，參見Lieberman等，J Am Chem Soc. 2010 Dec22 ; 132 (50) : 17961-72, 61/402, 903)。Phi29 DNAP粘合至模板DNA的強(qiáng)度足以允許在納米孔的 頂部上進(jìn)行多重酶循環(huán)，從而，允許以棘輪方式拉動DNA通過納米孔。文章還披露了在其中 抑制酶運(yùn)動的條件下，Phi29 DNAP可以用于控制DNA運(yùn)動通過納米孔。在這些條件下，對 于酶促作用而言必不可少的Mg2+有效地通過加入金屬螯合劑乙二胺四乙酸（EDTA)去除。 施加的電壓提供了 DNA鏈上的力，并且Phi29 DNAP通過孔限制鏈的"拉開（unzipping)"。 該研究表明納米孔系統(tǒng)中的酶可以起分子發(fā)動機(jī)的作用或起分子制動的作用。
[0007] 除了使用聚合酶作為分子棘輪之外，已經(jīng)證明的是：一些解旋酶家族可以 用于提供控制多核苷酸運(yùn)動通過納米孔（例如，參見US 61/549,998(N115020)、US 61/581，332(N115505)、US 61/581，340(N115506))。解旋酶（helicase)具有許多使得它們 適合用于納米孔系統(tǒng)的性能。
[0008] 減緩靶單鏈DNA易位的替代方法是沿著靶鏈的長度雜交ssDNA(hyb-DNA)的附加 部分。在施加的電壓下，DNA的靶鏈迅速穿過孔。一旦鏈的雙鏈部分到達(dá)納米孔的收縮處， 鏈的易位停止，允許在固定位置處讀取聚合物的電流。通過外加場的力，hyb-DNA部分未雜 交，并且靶DNA鏈繼續(xù)易位納米孔直至遇到另一個hyb-DNA。以這種方式，獲得了在多個固 定位置處針對DNA鏈的電流標(biāo)記。通過使用復(fù)雜樣品制備技術(shù)，Derrington等人提出使用 該方法測序DNA鏈的方法。
[0009] 從這些方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)共享主要特征；DNA的易位發(fā)生在謹(jǐn)慎的階段，其中，每一 個階段代表納米孔中的聚合物的位置并且每一個聚合物位置具有特征電流水平。有時，電 流水平可以表現(xiàn)出波動，稱為偏差。這些特征導(dǎo)致了采用"嘈雜階梯波（noisy st印wave)" 形式的信號。
[0010] 更通常地，系統(tǒng)的一些性能取決于納米孔中的聚合物單元，并且采用了該性能的 測試。例如，可以通過將納米孔放置在絕緣膜中，并且在分析物分子的存在下測量通過納米 孔的電壓驅(qū)動的離子轉(zhuǎn)運(yùn)來產(chǎn)生測量系統(tǒng)。通過納米孔控制聚合物的運(yùn)動導(dǎo)致許多表明聚 合物序列的測量的不同水平。
[0011] 在之前的研究中，焦點(diǎn)已經(jīng)在于測定聚合物的基礎(chǔ)序列。通常，在這些方法中，通 過比較這些狀態(tài)的電流水平與來自參考數(shù)據(jù)的已知電流水平，已經(jīng)單獨(dú)地分析了信號中的 每一狀態(tài)。該方法將電流信號轉(zhuǎn)化成評價聚合物序列。對此進(jìn)行說明的另一種方式是該方 法將來自信號空間的信息轉(zhuǎn)化成序列空間。然而，在研發(fā)可以可靠地確定序列的測量系統(tǒng) 中存在實(shí)際困難。
[0012] 對于依賴于k個聚合物單元的組的每一測量值，典型的是許多類型的測量系統(tǒng)， 包括大多數(shù)的目前已知的納米孔，其中，k是復(fù)數(shù)的整數(shù)，以下稱為'k鏈節(jié)'。這是由于多于 一個聚合物單元有助于觀察到的離子電流，并且可以被概念性地認(rèn)為具有比被測量的聚合 物單元更大的"鈍讀取頭（bluntreader head)"的測量系統(tǒng)。在這種情形下，待解決的不 同k鏈節(jié)的數(shù)目增加了 k的乘冪。例如，如果存在n個可能的聚合物單元，待解決的不同k 鏈節(jié)的數(shù)目是nk。盡管可期望的是具有對于不同k鏈節(jié)測量之間的清楚分離，對于這些測 量中的一些，常見的是重疊。特別地，具有高數(shù)目的k鏈節(jié)，可能難以解析由不同k鏈節(jié)產(chǎn) 生的測量，難以解析關(guān)于聚合物的衍生信息的損害，例如，評價聚合物單元的基礎(chǔ)序列。 [0013]許多研究已經(jīng)旨在設(shè)計提供依賴于單個聚合物單元的可解析測量的測量系統(tǒng)。然 而，例如，由于可以產(chǎn)生基礎(chǔ)物理或生物系統(tǒng)中固有變化的改變程度的測量中的變化，和/ 或由于被測量的小幅度性能而不可避免的測量噪音，這已經(jīng)在實(shí)踐中被證明困難。其他工 作已經(jīng)接受依賴于k鏈節(jié)的測量，但已經(jīng)旨在設(shè)計其中來自不同k鏈節(jié)的測量可彼此解析 的測量系統(tǒng)。然而，實(shí)際限制再次意味著這非常困難。由一些不同k鏈節(jié)產(chǎn)生的信號分布 通?？梢灾丿B。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 根據(jù)本發(fā)明，提供了分析聚合物通過納米孔的易位過程中進(jìn)行的聚合物時序系列 測量（聚合物的時序測量結(jié)果，time-ordered series of measurements of a polymer) 的方法，其中，測量（測量結(jié)果，measurement)取決于納米孔中的k鏈節(jié)（k-mers)的特性(identity), k鏈節(jié)是聚合物的k個聚合物單元,其中，k是正整數(shù),所述方法包括：
[0015] 從測量系列中得出代表測量的特性的時序特征的特征向量；以及
[0016] 測定得出的特征向量和至少一種其他特征向量之間的相似性。
[0017] 盡管之前的研究已經(jīng)嘗試得出來自測量的精確序列，本發(fā)明利用許多應(yīng)用不需要 待指定的精確的聚合物序列的優(yōu)點(diǎn)。這些包括顯著量的診斷、臨床、科學(xué)、基因應(yīng)用，其中， 可以廉價地、迅速地獲得期望結(jié)果，并且在沒有依賴于序列信息的情況下達(dá)到更高的精確 度。特別地，本發(fā)明涉及代表測量特性的時序特征的特征向量的得出。然后，測定提供可用 于許多應(yīng)用中的信息的得出的特征向量和至少一種其他特征向量之間的相似性。
[0018] 因此，本發(fā)明不需要指定聚合物序列，即，測量信號轉(zhuǎn)化成序列空間不是必須的。 這在許多應(yīng)用中提供了聚合物的有用分析，但由于沒有必要解析序列中的每一個單個的聚 合物單元，減少了測量系統(tǒng)操作上的負(fù)擔(dān)。測量系統(tǒng)限制的這種減少還增加了測量系統(tǒng)的 范圍。這可以允許使用更容易設(shè)計或操作的測量系統(tǒng)，或可以允許使用具體地適合于分析 聚合物的特定特性的測量系統(tǒng)，甚至在不能夠提供完全的序列信息的情況下。
[0019] 本發(fā)明的基礎(chǔ)特征是將為測量的時序系列的原始信號轉(zhuǎn)化成時序特征的特征向 量。當(dāng)聚合物通過納米孔易位時，得出測量的系列，并且由此提供整個序列上的信息，即使 這是不完全的。特征向量的得出提供了也是時序性的但具有減少的數(shù)據(jù)集的表示。該特征 向量可以被認(rèn)為聚合物的"標(biāo)記"。然后，將特征向量與至少一種其他特征向量相比較以測 定相似性。至少一種其他特征向量可以是例如儲存在存儲器中的特征向量或以相同方式得 出的另一個特征向量。根據(jù)相似性，可以得出聚合物的特性。
[0020] 在一些信號下，存在連續(xù)測量的組依賴于對于每一個組不同的各個k鏈節(jié)的每一 個k鏈節(jié)的足夠的分辨率。在這種情況下，得出特征向量的步驟可以包括識別連續(xù)測量的 組，并且，相對于各個組，得出代表組的測量特性的一種或更多種特征的值。例如，特征可以 包括：測量組的平均值；測量組的周期；測量組的偏差（方差，variance);測量組的分布； 或它們的任何組合。
[0021] 本發(fā)明還可適用于具有較小分辨率的信號，使得一些k鏈節(jié)可以提供僅單個測量 或根本沒有測量。
[0022] 如以上所提及的，在一些情況下，相對于至少一個類別，得出的特征向量可以與儲 存在存儲器中的至少一種其他特征向量相比較。在這種情況下，可以在全部或部分得出的 特征向量和儲存在存儲器中的至少一種其他特征向量整體之間，或可替換地，在全部或部 分得出的特征向量和儲存在存儲器中的至少一種其他特征向量的部分之間測定相似性。
[0023] 該方法可以進(jìn)一步包括：根據(jù)測定的相似性，將從其中得到得出的特征向量的聚 合物分類為屬于所述類別。這提供了研究的聚合物的特性。
[0024] 可以根據(jù)待測定的聚合物選擇儲存在存儲器中的至少一種其他特征向量，或可替 換地，可以使用儲存在存儲器中的多個其他特征向量的庫。
[0025] 在一些應(yīng)用中，可以從具有重疊區(qū)域的兩種或更多種特征向量獲得結(jié)合的特征向 量，其中，在結(jié)合的特征向量之間測定得出的特征向量的相似性。結(jié)合的特征向量的非重疊 區(qū)域可以用于測定得出的特征向量之間的相似性，例如，以識別得出的特征向量的特定的 局部區(qū)域。
[0026] 因此，所述方法可以用于測定得出的特征向量和一種或更多種特征向量的連續(xù)或 非連續(xù)區(qū)域之間的相似性。
[0027] 在一些應(yīng)用中，得出的特征向量的多個部分可以與儲存的特征向量的全部、部分 或多個部分相比較。
[0028] 如以上所提及的，在其他情況下，得出的特征向量可以與作為使用相同方法得出 的特征向量的至少一種其他特征向量相比較。相對于彼此，這提供了研究的多種聚合物的 特性識別。在這種情況下，所述方法可以進(jìn)一步包括將相似特征向量的簇識別為一類，并且 將由其得出特征向量的聚合物分類為屬于識別的類。
[0029] 在一個實(shí)例中，其中，存在使用相同方法得出的多個其他特征向量，該方法可以進(jìn) 一步包括根據(jù)特征向量的重疊部分的相似性，識別從作為共同聚合物的片段的聚合物得出 的特征向量。
[0030] 當(dāng)將聚合物分類時，該方法可以進(jìn)一步包括計數(shù)屬于不同類別的特征向量的數(shù) 目。這提供了研究的聚合物的群體分析。
[0031] 當(dāng)將聚合物分類時，該方法可以進(jìn)一步包括識別局部區(qū)域，其中，得出的特征向量 不同于相對于其中聚合物被分類為屬于其的類別的特征向量。
[0032] 在相似的技術(shù)中，其中，聚合物具有期望的特性，得出的特征向量可以與儲存在存 儲器中的特征向量相比較，并且相似性的測定包括測定其中得出的特征向量不同于儲存在 存儲器中的至少一種其他特征向量的局部區(qū)域。
[0033] 其中得出的特征向量不同于所期望的局部區(qū)域的這種識別提供了在許多應(yīng)用中 非常有力的分析技術(shù)，其中聚合物的長序列的相對小的區(qū)域中的變化顯著。這種技術(shù)的一 個實(shí)例是識別作為多核苷酸的聚合物中的突變。
[0034] 該方法可以在之前已經(jīng)做出的一系列測量上進(jìn)行?？商鎿Q地，該方法可以進(jìn)一步 包括：通過納米孔易位聚合物，以及形成聚合物的測量的連續(xù)系列。
[0035] 分析測量系列的方法可以用于根據(jù)分析來評價目標(biāo)聚合物的存在、不存在或量的 方法中。
[0036] 在這種情況下，聚合物可以包括兩種或更多種聚合物的混合物，并且可以測定一 種或更多種聚合物的相對量。
[0037] 評價靶聚合物的存在、不存在或量的方法可以應(yīng)用至包括以下的方法中的聚合物 分析物：將聚合物分析物破碎成聚合物；以及執(zhí)行評價破碎的聚合物的方法。當(dāng)聚合物是 多核苷酸并且聚合物單元是核苷酸時，可以通過限制性酶破碎聚合物分析物。
[0038] 分析測量的系列的方法可以應(yīng)用在包括以下的測定聚合物中的改變的方法中：在 一段時期內(nèi)，通過納米孔反復(fù)易位聚合物；在每一次易位過程中，形成聚合物的測量的連續(xù) 系列；分析測量的每一系列。在這種情況下，測定得出的特征向量和至少一種其他特征向量 之間的相似性的步驟可以包括：(a)測定從測量的各個系列得出的得出特征向量和相同的 至少一種其他特征向量之間的相似性，或（b)測定從測量的系列得出的所有得出特征向量 之間的相似性。
[0039] 當(dāng)聚合物是多核苷酸并且聚合物單元是核苷酸時，該方法可以用于測定修飾堿基 或點(diǎn)突變的存在。
[0040] 通常，這些方法可以用于引導(dǎo)治療或診斷或用于識別個體。
[0041] 本發(fā)明具有許多應(yīng)用。一些非限制性實(shí)例或應(yīng)用如下。
[0042] 本發(fā)明可以應(yīng)用至用于聚合物的分析的單分子標(biāo)簽自由檢測系統(tǒng)，例如，納米孔 系統(tǒng)。對于這種系統(tǒng)，通常包括在給出的聚合物位置處被多于一種單體單元影響的識別元 件。在這些系統(tǒng)中，提取測量和聚合物序列之間的關(guān)系可以具有挑戰(zhàn)性或資源需求。
[0043] 本發(fā)明可以應(yīng)用至任何聚合物分析系統(tǒng)，其中，聚合物標(biāo)記指明聚合物的特性，并 且其中，確切的聚合物序列對于測定所述特性不是必須知曉的。實(shí)例包括但不限于：檢測單 核苷酸多態(tài)性（SNP)、存在或不存在特定序列、分組和計數(shù)聚合物序列、設(shè)計標(biāo)簽和生物標(biāo) 記、以及識別修飾或損壞的DNA。
[0044] 例如，該方法可以用于測定樣品中的靶聚合物分析物的存在、不存在或量。該方法 可以用于測量相對于閾值的量。該方法可以用于測定聚合物的混合物中的一種或更多種靶 聚合物的相對量。
[0045] 根據(jù)單個樣品的分析，該方法可以用于引導(dǎo)治療或診斷?？商鎿Q地，例如，在一段 時期內(nèi)所述方法可以進(jìn)行多次以監(jiān)視個體的疾病或改善的進(jìn)展。例如，在用作治療診斷時， 該方法可以用于監(jiān)視治療效能。
[0046] 例如，所述方法可以用在法醫(yī)應(yīng)用中以例如通過測定短串聯(lián)重復(fù)、可變串聯(lián)重復(fù) 等的存在來檢測線粒體DNA中的SNP用于個體DNA圖譜、用于個體的遺傳指紋。
[0047] 在沒有評價聚合物的聚合物單元序列的情況下，可以執(zhí)行所有方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0048] 為了能夠更好的理解，現(xiàn)在將通過非限制性實(shí)施例，參照附圖，來描述本發(fā)明的實(shí) 施方式，其中：
[0049] 圖1是包括納米孔的測量系統(tǒng)的示意圖；
[0050] 圖2是通過測量系統(tǒng)，隨著時間測定的事件的信號的繪圖；
[0051] 圖3是在包括納米孔的測量系統(tǒng)中的兩種不同多核苷酸的測量的頻率分布的圖；
[0052] 圖4和圖5分別是643鏈節(jié)系數(shù)和10245鏈節(jié)系數(shù)相對于來自應(yīng)用至實(shí)驗(yàn)得出的 電流測量的集合的一階線性模型的預(yù)測值的繪圖；
[0053] 圖6是分析包括聚合物測量的輸入信號的方法的流程圖；
[0054] 圖7是圖6的狀態(tài)檢測步驟的流程圖；
[0055] 圖8和圖9分別是經(jīng)歷狀態(tài)檢測步驟的輸入信號和得到的測量系列的繪圖；
[0056] 圖10和圖11是圖6的相似性測定步驟的實(shí)施例的流程圖；
[0057] 圖12是針對該方法的實(shí)施例2,針對由它們的重疊識別的序列的三個片段的特征 向量的繪圖；
[0058] 圖13是與實(shí)施例2中的所有庫序列相比較，候選分子的相似性得分的繪圖；
[0059] 圖14是與實(shí)施例2中的最佳匹配庫分子比對的候選分子的繪圖；
[0060] 圖15是針對實(shí)施例2中的176候選分子的分類的直方圖；
[0061] 圖16是該方法的實(shí)施例3中的特征向量的曲線圖，說明了 SNP對于分子13的影 響；
[0062]圖17是針對具有實(shí)施例3中的分子13中的三個SNP的176候選分子的分類的直 方圖；
[0063] 圖18是測定的分子與實(shí)施例3中的庫特征向量比對的曲線圖；
[0064] 圖19是測量值和庫特征向量之間的位置解析差異的繪圖，說明了實(shí)施例3中SNP 的位置；
[0065] 圖20是測量值和沒有實(shí)施例3中SNP的庫特征向量之間的位置解析差異的繪圖；
[0066] 圖21是數(shù)據(jù)與該方法的實(shí)施例4中一致的標(biāo)記的最終比對的繪圖；
[0067] 圖22是在實(shí)施例4中的近似位置337處的候選分子51-60中的位置解析差異的 繪圖；
[0068] 圖23和圖24是通過該方法的實(shí)施例5中分別針對兩簇和三簇數(shù)據(jù)集的比對相似 性得分上的鄰近連接形成的樹圖；
[0069] 圖25至圖27是與針對實(shí)施例5中的每一個識別簇的最終比對數(shù)據(jù)一致的標(biāo)記的 曲線圖；
[0070] 圖28和圖29是實(shí)施例5中分別針對兩簇和三簇實(shí)驗(yàn)分類的直方圖；
[0071] 圖30是通過該方法的實(shí)施例6中的比對相似性得分上的鄰近連接形成的樹圖；以 及
[0072]圖31是與針對實(shí)施例6中的三個片段的每一個的數(shù)據(jù)最終比對一致的標(biāo)記的曲 線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0073] 可以應(yīng)用的聚合物如下。
[0074] 聚合物可以是生物聚合物。聚合物可以是天然的或合成的。聚合物可以是多核苷 酸（或核酸）、多肽如蛋白質(zhì)、多糖、或任何其他聚合物。在多肽的情況下，聚合物單元可以 是天然存在或合成的氨基酸。在多糖的情況下，聚合物單元可以是單糖。
[0075] 可以應(yīng)用的多核苷酸如下。
[0076] 多核苷酸如核酸是包含兩種或更多種核苷酸的大分子。多核苷酸或核酸可以包括 任何核苷酸的任何組合。核苷酸可以是天然存在的或人造的。靶多核苷酸中的一種或更多 種核苷酸可以被氧化或甲基化。靶多核苷酸中的一種或更多種核苷酸可以被損壞。靶多核 苷酸中的一種或更多種核苷酸可以例如用標(biāo)簽或標(biāo)記修飾。靶多核苷酸可以包括一個或更 多個間隔。
[0077] 核苷酸通常包含核堿基、糖和至少一個磷酸根基團(tuán)。核堿基通常是雜環(huán)的。核堿基 包括但不限于，嘌呤和嘧啶，并且更具體的是腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶。 糖通常是戊糖。核苷酸糖包括但不限于，核糖和脫氧核糖。核苷酸通常是核糖核苷酸或脫 氧核糖核苷酸。核苷酸通常包括單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。磷酸酯可以連接在核苷 酸的5'或3'側(cè)上。
[0078]核苷酸包括但不限于，腺苷一磷酸（AMP)、腺苷二磷酸（ADP)、腺苷三磷酸（ATP)、 鳥苷一磷酸（GMP)、鳥苷二磷酸（⑶P)、鳥苷三磷酸（GTP)、胸苷一磷酸（TMP)、胸苷二磷酸 (TDP)、胸苷三磷酸（TTP)、尿苷一磷酸（UMP)、尿苷二磷酸（UDP)、尿苷三磷酸（UTP)、胞苷 一磷酸（CMP)、胞苷二磷酸（⑶P)、胞苷三磷酸（CTP)、5_甲基胞苷一磷酸、5-甲基胞苷二磷 酸、5-甲基胞苷三磷酸、5-羥甲基胞苷一磷酸、5-羥甲基胞苷二磷酸、5-羥甲基胞苷三磷 酸、環(huán)腺苷一磷酸（cAMP)、環(huán)鳥苷一磷酸（cGMP)、脫氧腺苷一磷酸（dAMP)、脫氧腺苷二磷 酸（dADP)、脫氧腺苷三磷酸（dATP)、脫氧鳥苷一磷酸（dGMP)、脫氧鳥苷二磷酸（dGDP)、脫 氧鳥苷三磷酸（dGTP)、脫氧胸苷一磷酸（dTMP)、脫氧胸苷二磷酸（dTDP)、脫氧胸苷三磷酸 (dTTP)、脫氧尿苷一磷酸（dUMP)、脫氧尿苷二磷酸（dUDP)、脫氧尿苷三磷酸（dUTP)、脫氧胞 苷一磷酸（dCMP)、脫氧胞苷二磷酸（d⑶P)以及脫氧胞苷三磷酸（dCTP)、5_甲基-2'-脫 氧胞苷一磷酸、5-甲基-2'-脫氧胞苷二磷酸、5-甲基-2'-脫氧胞苷三磷酸、5-羥甲 基-2'-脫氧胞苷一磷酸、5-羥甲基-2'-脫氧胞苷二磷酸以及5-羥甲基-2'-脫氧 胞苷三磷酸。核苷酸優(yōu)選選自AMP、TMP、GMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP、或dCMP。核苷酸可以 是無堿基的（即，缺乏核堿基）。核苷酸可以包括其他修飾。特別地，合適的修飾的核苷 酸包括但不限于，2'-氨基嘧啶（如，2'-氨基胞苷和2'-氨基尿苷）、2'-羥基嘌呤 (如，2'-氟嘧啶（如，2'-氟胞苷和2'-氟尿苷）、羥基嘧啶（如，5' -a-P-borano 尿苷）、2' -0-甲基核苷酸（如，2' -0-甲基腺苷、2' -0-甲基鳥苷、2' -0-甲基胞苷和 2' -0-甲基尿苷）、4'-硫代嘧啶（如，4'-硫代尿苷和4'-硫代胞苷）以及核苷酸具 有核堿基的修飾（如，5-戊炔基-2脫氧尿苷、5-(3-氨基丙基）-尿苷和1，6-二氨基己 基-N-5-氨基甲?；谆蜍眨?。
[0079] 核苷酸可以是無堿基的（S卩，缺乏核堿基）。
[0080]多核苷酸可以是單鏈或雙鏈。多核苷酸可以包括一種或更多種雙鏈區(qū)域以及一種 或更多種單鏈區(qū)域。多核苷酸可以是核酸，如脫氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸（RNA)。靶多 核苷酸可以包括雜交至DNA的一條鏈的RNA的一條鏈。多核苷酸可以是本領(lǐng)域中已知的任 何合成核酸，如肽核酸（PNA)、甘油核酸（GNA)、蘇糖核酸（TNA)、鎖定的核酸（LNA)或具有核 苷酸側(cè)鏈的其他合成聚合物。
[0081]使用該方法可以表征全部或僅部分的靶多核苷酸。靶多核苷酸可以是任何長度。 例如，多核苷酸的長度可以是至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少 300、至少400、或至少500個核苷酸對。多核苷酸的長度可以是1000或更多個核苷酸對、 5000或更多個核苷酸對，或長度是100000或更多個核苷酸對。
[0082]靶多核苷酸存在于任何合適的樣品中。本發(fā)明通常在已知包括或疑似包括靶多核 苷酸的樣品上進(jìn)行。可替換地，本發(fā)明可以在樣品上進(jìn)行以確認(rèn)它們在樣品中的存在是已 知或期望的一種或更多種靶多核苷酸的特性。
[0083]可以研究的樣品如下。
[0084]樣品可以是生物樣品。本發(fā)明可以在從任何生物或微生物獲得或提取的樣品上體 外進(jìn)行。生物或微生物通常是古生物、原核生物或真核生物，并且通常屬于五界之一：植物 界、動物界、真菌界、原核生物界和原生生物界。本發(fā)明可以在從任何病毒獲得或提取的樣 品上體外進(jìn)行。樣品優(yōu)選是流體樣品。樣品的原始狀態(tài)可以是固體或半固體，其隨后被處理 以提供流體樣品。這種的實(shí)例是排泄物、皮膚、組織、毛發(fā)、骨和肌肉。樣品通常包括患者的 體液。樣品可以選自例如尿、血液、血漿、血清、淋巴液、唾液、間隙液、淚液、粘液或羊水。通 常，樣品是人源的，但可替換地，其可以來自其他哺乳動物，如來自商業(yè)農(nóng)場動物，如馬、牛、 綿羊或豬，或可以可替換地是寵物，如貓或狗。可替換地，植物來源的樣品通常從以下獲得： 經(jīng)濟(jì)作物，如谷類、豆類、水果或蔬菜，例如，小麥、大麥、燕麥、蕓苔、玉米、大豆、水稻、香蕉、 蘋果、西紅柿、土豆、葡萄、煙草、黃豆、扁豆、甘蔗、可可、棉花。
[0085]樣品可以是非生物樣品。非生物樣品優(yōu)選是流體樣品。非生物樣品的實(shí)例包括手 術(shù)流體，水如飲用水、海水或河水，以及工業(yè)樣品，如用于實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的試劑、從聚合物試劑 的合成獲得的樣品。
[0086] 通常在測定之前處理樣品，例如，通過離心法或通過經(jīng)過過濾掉不想要的分子或 細(xì)胞如紅血細(xì)胞的膜。樣品可以在被取出時立即測量。在測定之前，樣品通常還可以被儲 存，優(yōu)選地，在-70°C以下。
[0087] 還可以對樣品進(jìn)行在US 61/490860中提出的任何處理、設(shè)計或修飾。
[0088] 可以用在測量系統(tǒng)中的膜如下。
[0089] 根據(jù)本發(fā)明，可以使用任何膜。合適的膜在本領(lǐng)域中眾所周知。膜優(yōu)選是兩親性 層。兩親性層是由兩親性分子如磷脂形成的層，其具有親水性和親油性。兩親性層可以是 單層或雙層。膜可以是共嵌段聚合物如由（Gonzalez-Perez et al.，Langmuir, 2009, 25,1 0447-10450)所公開的。
[0090] 膜可以是脂雙層。脂雙層是細(xì)胞膜的模型，并且對于一系列實(shí)驗(yàn)研究起優(yōu)異平臺 的作用。例如，通過單通道記錄，脂雙層可以用于膜蛋白的體外研究。可替換地，脂雙層可 以用作生物傳感器以檢測一系列物質(zhì)的存在。合適的兩親性層包括但不限于，平面脂雙 層、支撐雙層或脂質(zhì)體。脂雙層優(yōu)選是平面脂雙層。國際申請?zhí)朠CT/GB08/000563(以WO 2008/102121公開）、國際申請?zhí)朠CT/GB08/004127(以WO 2009/077734公開）以及國際申 請?zhí)朠CT/GB2006/001057(以2006/100484公開）中公開了合適的脂雙層。
[0091] 用于形成脂雙層的方法在本領(lǐng)域中是已知的。實(shí)施例中公開了合適的方法。通常 通過 Montal 和 Mueller 的方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，1972 ;69:3561-3566)形成脂 雙層，其中，在穿過垂直于界面的孔的任一側(cè)的水溶液/空氣界面上形成脂單層。
[0092] Montal和Mueller的方法普遍使用，因?yàn)樵摲椒ㄊ切纬蛇m合蛋白孔插入的良好質(zhì) 量的脂雙層的具有成本效益并且相對直接的方法。雙層形成的其他常見方法包括尖部浸 漬、涂漆雙層以及脂質(zhì)體雙層的膜片夾緊。
[0093] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，如在國際申請?zhí)朠CT/GB08/004127 (以WO 2009/077734公布）中所描述的形成兩親性層。
[0094]在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，膜是固態(tài)層。固態(tài)層不是生物起源。換句話說，固 態(tài)層不是獲得自或分離自生物環(huán)境，如生物或細(xì)胞，或生物可獲得結(jié)構(gòu)的合成制造版本。 可以從包括但不限于以下的有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)形成固態(tài)層：微電子材料，絕緣材料如Si 3N4、 Al2O3以及SiO,有機(jī)和無機(jī)聚合物如聚酰胺，塑料如Teflon?或彈性體如雙組分加成固化 硅橡膠，以及玻璃。固態(tài)層可以由單原子層如石墨、或僅幾個原子厚度的層形成。國際申請 號PCT/US2008/010637(以WO 2009/035647公開）中公開了合適的石墨層。固態(tài)膜還可 以支撐由生物材料獲得的納米孔，Hall等（Nat Nanotechnol. 2010 Dec ;5 (12) : 874-7)和 Bell 等（Nano Lett.2012 Janll;12(l):512-7)以及國際申請?zhí)?PCT/US2011/039621(以 W0/2012/005857公開）已經(jīng)公開了非限制性實(shí)例。
[0095]該方法通常使用（i)包括孔的人造兩親性層，（ii)包括孔的分離的、天然存在的 兩親性層；或（iii)具有插入在其中的孔的單元來進(jìn)行。該方法優(yōu)選使用人造兩親性層來 進(jìn)行。雙層可以包括除了孔之外的其他跨膜和/或膜內(nèi)蛋白以及其他分子。以下討論了合 適的裝置和條件。本發(fā)明的方法通常在體外進(jìn)行。
[0096] 可以應(yīng)用的納米孔如下。
[0097] 測量系統(tǒng)包括納米孔。在聚合物通過納米孔的易位過程中進(jìn)行測量。聚合物通過 納米孔的易位產(chǎn)生可以觀察到的測量性能中的特性信號，并且可以整體被稱為"事件"。[0098] 納米孔是通常具有廣泛地說納米級的尺寸的孔，其允許聚合物通過其中。在此，提 及"孔"是指該意義上的納米孔。
[0099] 納米孔可以是生物孔或固態(tài)孔。
[0100] 固態(tài)孔通常是固態(tài)層中的孔。固態(tài)孔可以與提供聚合物的替換或附加測量的其他 組件如隧道電極（Ivanov AP et al.，Nano Lett. 2011 Janl2;ll(l):279-85)，或場效應(yīng)晶 體管（FET)器件（國際申請WO 2005/124888)結(jié)合使用?？梢酝ㄟ^包括例如WO 00/79257 中描述的那些的已知方法形成固態(tài)孔。
[0101] 納米孔優(yōu)選是跨膜蛋白孔。跨膜蛋白孔是允許水合離子從膜的一側(cè)流向膜的另一 側(cè)的多肽或多肽集合。在本發(fā)明中，跨膜蛋白孔能夠形成允許通過施加的電壓驅(qū)動的水合 離子從膜的一側(cè)流向另一側(cè)的孔。跨膜蛋白孔允許聚合物如DNA或RNA通過孔移動。
[0102]跨膜蛋白孔可以是單體或低聚物?？變?yōu)選由幾個重復(fù)亞基如6、7或8個亞基組成。 孔更優(yōu)選是七聚體或八聚體孔。
[0103] 跨膜蛋白孔通常包括通過其離子可以流動的桶或通道?？椎膩喕ǔ@中心軸 并且有助于與跨膜0桶或通道或跨膜a螺旋束或通道成鏈。
[0104] 跨膜蛋白孔的桶或通道通常包括促進(jìn)與分析物如聚合物、核苷酸、多核苷酸或核 酸的相互作用的氨基酸。這些氨基酸優(yōu)選位于桶或通道的收縮部附近?？缒さ鞍卓淄ǔ０?括一種或更多種帶正電荷的氨基酸，如精氨酸、賴氨酸或組氨酸，或芳香族氨基酸，如酪氨 酸或色氨酸。這些氨基酸通常促進(jìn)孔和聚合物、核苷酸、多核苷酸或核酸之間的相互作用。
[0105] 根據(jù)本發(fā)明使用的跨膜蛋白孔可以獲得自P桶孔或a螺旋束孔。0桶孔包括桶 或由P鏈形成的通道。合適的P桶孔包括但不限于，a-毒素，如a-溶血素、炭疽毒素和 殺白細(xì)胞素，以及細(xì)菌的外膜蛋白/孔蛋白，如恥垢分枝桿菌孔蛋白（Msp)，例如，MspAJF 膜孔蛋白F(OmpF)、外膜孔蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A以及奈瑟球菌屬（Neisseria)自轉(zhuǎn) 運(yùn)脂蛋白脂蛋白（NalP)。a-螺旋束孔包含由a-螺旋形成的桶或通道。合適的a-螺旋 束孔包括但不限于，內(nèi)膜蛋白和外膜蛋白，如WZA和ClyA毒素。跨膜孔可以獲得自Msp或 獲得自a _溶血素（a -HL)。
[0106] 跨膜蛋白孔優(yōu)選獲得自Msp，優(yōu)選地，獲得自MspA。這種孔將是低聚物并且通常包 括獲得自Msp的7、8、9或10個單體?？卓梢允谦@得自包括相同單體的Msp的同源低聚孔。 可替換地，孔可以是獲得自包括不同于其他的至少一種單體的Msp的雜低聚孔。優(yōu)選地，孔 獲得自MspA或其同系物或橫向同源物（paralog)。
[0107] 獲得自Msp的單體包括SEQ ID NO: 2中示出的序列或其變體。SEQ ID NO: 2是MspA 單體的MS-(B1)8突變體。它包括以下突變：090隊09謂、093隊01181?、01341?和￡1391(。5￡〇 ID N0:2的變體是具有不同于SEQ ID N0:2并且保留其形成孔的能力的氨基酸序列的多肽。 可以使用本領(lǐng)域中已知的任何方法測定變體形成孔的能力。例如，可以隨同其他適當(dāng)?shù)膩?基一起將變體插入脂雙層中，并且可以測定其寡聚化以形成孔的能力。用于將亞基插入膜 如脂雙層中的方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如，亞基可以以純化形式懸浮在包含脂雙層的 溶液中，使得其擴(kuò)散至脂雙層并且通過結(jié)合至脂雙層并且組裝成功能狀態(tài)而插入?？商鎿Q 地，可以使用 M. A. Holden, H. Bayley. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6502-6503 和國際申請?zhí)?PCT/GB2006/001057(以 TO 2006/100484 公開）中描述的"拾取放置（pick and place)" 方法將亞基直接插入膜中。
[0108]在SEQ ID NO: 2的整個氨基酸序列長度上，基于氨基酸一致性，變體將優(yōu)選與該序 列至少50%同源。更優(yōu)選地，基于氨基酸一致性，變體可以與SEQ ID NO: 2的氨基酸序列在 整個序列上至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至 少90%，并且更優(yōu)選至少95%、97%或99%同源。在100或更多，例如125、150、175或200 或更多個連續(xù)氨基酸的延伸中，可以存在至少80 %，例如至少85 %、90 %或95 %的氨基酸 一致性（"硬同源性"）。
[0109] 本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法可以用于確定同源性。例如，UWGCG軟件包提供了可以用于 計算同源性的BESTFIT程序（例如，使用它的默認(rèn)設(shè)置）（Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12，p387-395)。例如，如 Altschul S.F. (1993)J Mol Evol 36:290-300; Altschul，S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10 中描述的，PILEUP 和 BLAST 算法可以 用于計算同源性或?qū)π蛄羞M(jìn)行比對（如，識別等價殘基或相應(yīng)的序列（通常，使用它們的默 認(rèn)設(shè)置））。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件公眾可以從美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)獲得。
[0110] SEQ ID NO: 2是MspA單體的MS-(BI) 8突變體。變體可以包括與MspA相比較的 1^8、(：或0單體中的任何突變。]\^8、(：和0的成熟形式示出在5￡〇10勵 :15至17中。特 別地，變體可以包括存在于MspB中的以下取代：A138P。變體可以包括存在于MspC中的一 種或更多種以下取代：A96G、N102E和A138P。變體可以包括存在于MspD中的一種或更多種 以下突變：缺失 Gl、L2V、E5Q、L8V、D13G、W21A、D22E、K47T、I49H、I68V、D91G、A96Q、N102D、 S103T、V104I、S136K和G141A。變體可以包括一種或更多種突變和來自Msp B、C以及D的 取代的組合。變體可以包括突變L88N。除了 MS-Bl的所有突變之外，SEQ IDN0:2的變體具 有突變L88N，并且被稱為MS-B2。用于本發(fā)明中的孔可以是MS- (B2) 8或MS- (B2C) 8。
[0111] 除了以上所討論的那些，可以對SEQ ID N0:2的氨基酸序列進(jìn)行氨基酸取代，例如 最高達(dá)1、2、3、4、5、10、20或30個取代。保守取代用相似化學(xué)結(jié)構(gòu)、相似化學(xué)性能或相似側(cè) 鏈體積的其他氨基酸代替氨基酸。引入的氨基酸可以與它們替換的氨基酸具有相似的極 性、親水性、疏水性、堿性、酸性、中性或電荷?？商鎿Q地，保守取代可以引入芳香族或脂肪族 的其他氨基酸以替代之前存在的芳香族或脂肪族氨基酸。保守氨基酸變化在本領(lǐng)域中眾所 周知并且可以根據(jù)以下表2中限定的20種主要氨基酸的性能進(jìn)行選擇。在氨基酸具有相 似的極性時，這還可以通過參考表3中的氨基酸側(cè)鏈的疏水尺度來確定。
[0112] 表2-氨基酸的化學(xué)性能：
[0113]

【權(quán)利要求】
1. 一種分析聚合物通過納米孔的易位過程中進(jìn)行的聚合物的時序系列測量的方法，其 中，所述測量取決于所述納米孔中的k鏈節(jié)的特性，k鏈節(jié)是所述聚合物的k個聚合物單元， 其中，k是正整數(shù)，所述方法包括： 從所述系列測量得出代表所述測量的特性的時序特征的特征向量；以及 測定所述得出的特征向量和至少一種其他特征向量之間的相似性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述至少一種其他特征向量是在至少一個類別 方面儲存在存儲器中的至少一種其他特征向量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，根據(jù)待測量的聚合物，選擇儲存在所述存儲器中 的所述至少一種其他特征向量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，儲存在所述存儲器中的所述至少一種其他特 征向量包括由片段的所述特征向量構(gòu)成的共同聚合物的總體特征向量。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項所述的方法，其中，所述測定相似性的步驟包括測定全 部或部分所述得出的特征向量和儲存在所述存儲器中的全部所述至少一種其他特征向量 之間的相似性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項所述的方法，其中，所述測定相似性的步驟包括測定全 部或部分所述得出的特征向量所述得出的特征向量和儲存在所述存儲器中的部分的所述 至少一種其他特征向量之間的相似性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項所述的方法，進(jìn)一步包括根據(jù)所測定的相似性，將所述 得出的特征向量由其得出的所述聚合物分類為屬于所述類別。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述至少一種其他特征向量是使用相同方法得 出的特征向量。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述至少一種其他特征向量是使用相同方法得 出的多個其他特征向量，并且所述方法進(jìn)一步包括根據(jù)所述特征向量的重疊部分的相似 性，識別從作為共同聚合物的片段的聚合物得出的特征向量。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括從所識別片段的所述特征向量構(gòu)成所述 共同聚合物的總體特征向量。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述至少一種其他特征向量是使用相同方法得 出的多個其他特征向量，并且所述方法進(jìn)一步包括將相似特征向量的簇識別為一類以及將 所述特征向量由其得出的所述聚合物分類為屬于識別類。
12. 根據(jù)權(quán)利要求7或11所述的方法，進(jìn)一步包括計數(shù)屬于不同類別的特征向量的數(shù) 目。
13. 根據(jù)權(quán)利要求7、11或12所述的方法，進(jìn)一步包括識別局部區(qū)域，其中，所述得出的 特征向量不同于在所述聚合物被分類為屬于其的所述類別的特征向量。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述至少一種其他特征向量包括儲存在存儲器 中的特征向量，并且所述測定相似性的步驟包括測定其中所述得出的特征向量不同于儲存 在所述存儲器中的所述至少一種其他特征向量的局部區(qū)域。
15. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中： 連續(xù)測量組取決于對于每個組不同的各個k鏈節(jié)，以及 所述得出特征向量的步驟包括識別連續(xù)測量組，并且，對于每個組，得出代表所述組的 所述測量的特性的一種或多種特征的值。
16. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述特征包括： 所述測量組的平均值； 所述測量組的周期； 所述測量組的偏差； 不對稱信息； 所述測量的可靠性信息； 所述測量組的分布；或 它們的任何組合。
17. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述測量是電氣測量。
18. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述測量包括測量通過所述納米孔 的離子電流。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述測量進(jìn)一步包括測量除了離子電流之外 的至少一種其他性能。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述至少一種其他性能的測量包括FET測量、 光學(xué)測量、或兩者。
21. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述聚合物是生物聚合物。
22. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述聚合物是多核苷酸，并且所述 聚合物單元是核苷酸。
23. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述納米孔是生物孔。
24. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述聚合物通過所述納米孔的所述 易位以其中用所述納米孔記錄連續(xù)的k鏈節(jié)的棘輪方式進(jìn)行。
25. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，通過分子棘輪控制所述聚合物的所 述易位。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述分子棘輪是聚合物結(jié)合蛋白。
27. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，進(jìn)一步包括： 使所述聚合物易位通過納米孔；以及 進(jìn)行所述聚合物的連續(xù)系列測量。
28. -種評價靶聚合物的存在、不存在或量的方法，所述方法包括： 使聚合物易位通過納米孔； 進(jìn)行所述聚合物的連續(xù)系列測量； 使用根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項所述的方法分析所述系列測量；以及 根據(jù)所述分析，評價靶聚合物的存在、不存在或量。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述聚合物包括兩種或更多種聚合物的混合 物，并且測定一種或多種聚合物的相對量。
30. -種評價聚合物分析物中靶聚合物的存在、不存在或量的方法，所述方法包括： 將所述聚合物分析物破碎成多個聚合物；以及 在所述破碎的聚合物上進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的方法。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述聚合物是多核苷酸，并且所述聚合物單元 是核苷酸，并且其中，通過限制性酶破碎所述聚合物分析物。
32. 根據(jù)權(quán)利要求28至31中任一項所述的方法，其中，在沒有評價所述聚合物的聚合 物單元的整個序列的情況下測定聚合物的存在、不存在或量。
33. -種測定聚合物中的改變的方法，包括： 在一段時期內(nèi)，使聚合物反復(fù)地易位通過納米孔； 在每一次易位過程中，進(jìn)行所述聚合物的連續(xù)系列測量；以及 使用根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項所述的方法，分析每個系列測量，其中，所述測定所 述得出的特征向量和至少一種其他特征向量之間的相似性的步驟包括：(a)測定從每個系 列測量得出的所述得出的特征向量和相同的至少一種其他特征向量之間的相似性，或（b) 測定從所述系列測量得出的所有所述得出的特征向量之間的相似性。
34. 根據(jù)權(quán)利要求28至33中任一項所述的方法，其中，所述聚合物是多核苷酸，并且所 述聚合物單元是核苷酸，并且所述方法用于測定修飾堿基或點(diǎn)突變的存在。
35. 根據(jù)權(quán)利要求28至34中任一項所述的方法，用于指導(dǎo)治療或診斷。
36. -種能夠由計算機(jī)裝置執(zhí)行并且配置執(zhí)行以進(jìn)行根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述 的方法的計算機(jī)程序。
37. -種配置以進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求1至35中任一項所述方法的分析裝置。
38. -種診斷裝置，包括： 根據(jù)權(quán)利要求37的分析裝置；以及 包括聚合物能夠通過其易位的納米孔的測量系統(tǒng)，所述測量系統(tǒng)被布置為在易位過程 中進(jìn)行所述聚合物的連續(xù)系列測量。
【文檔編號】C12Q1/68GK104321441SQ201380020403
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年2月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月16日
【發(fā)明者】斯圖爾特·威廉·里德, 詹姆斯·安東尼·克拉克, 詹姆斯·懷特, 加文·哈珀 申請人:牛津楠路珀爾科技有限公司