用于微生物檢測的方法和系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】公開了用于從樣品分離和檢測微生物的方法和系統(tǒng)。描述了結(jié)合劑用于從樣品分離目標(biāo)微生物的用途。在某些實(shí)施方案中，所述方法在細(xì)菌和其它微生物的檢測中使用基于核糖體和/或基于噬菌體的信號(hào)放大。例如，本發(fā)明的實(shí)施方案可實(shí)現(xiàn)來自單個(gè)感染細(xì)胞的至少10,000倍的總放大。
【專利說明】用于微生物檢測的方法和系統(tǒng)
[0001] 本申請要求2012年2月21日提交的美國臨時(shí)專利申請61/601，231的優(yōu)先權(quán)。將 美國臨時(shí)專利申請61/601，231的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及用于微生物的檢測的方法和系統(tǒng)。
[0003] 背景
[0004] 在生物樣品和基于食品的樣品中細(xì)菌和其它微生物的檢測上存在強(qiáng)烈的興趣。細(xì) 菌病原體可在人和家養(yǎng)動(dòng)物中引起高發(fā)病率以及巨大經(jīng)濟(jì)損失。同樣地，鑒于因攝入被某 些微生物例如大腸桿菌（Escherichia coli)或沙門菌屬某些種（Salmonella spp.)污染 的食品而引起的威脅生命或致命的疾病的爆發(fā)，微生物的檢測在食品和藥物管理局（FDA) 內(nèi)具有高度優(yōu)先權(quán)。
[0005] 用于細(xì)菌檢測的常規(guī)微生物測試依賴于非選擇性和選擇性富集培養(yǎng)物，隨后將其 涂板在選擇性培養(yǎng)基上，進(jìn)一步測試以確認(rèn)懷疑的菌落。這樣的方法可能需要數(shù)天。多種快 速法已被研究，并被引入實(shí)踐來減少所需時(shí)間。然而，這些方法具有缺點(diǎn)。例如，牽涉直接免 疫測定或基因探針的技術(shù)通常需要富集步驟以獲得足夠的靈敏度。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 測試還包括擴(kuò)增步驟，從而能夠具有高度靈敏度和選擇性，然而，可經(jīng)濟(jì)地接受PCR測試的 樣品尺寸是有限的。對(duì)于稀釋的細(xì)菌懸浮液，大多數(shù)小的次級(jí)樣品不含細(xì)胞，從而仍然需 要富集步驟。生物富集所需時(shí)間取決于樣品中靶細(xì)菌群體的生長速率、樣品基質(zhì)的作用以 及需要的靈敏度。例如，用于產(chǎn)Vero毒素大腸桿菌（verotoxigenic E. coli)的磁性捕獲 PCR系統(tǒng)在模型系統(tǒng)中需要約5、7和10小時(shí)的富集培養(yǎng)以分別檢測1000、100和1個(gè)菌落 形成單位/毫升（cfu/ml)，以及在絞牛肉中需要15小時(shí)的富集培養(yǎng)來檢測lcfu/克（g)。 實(shí)際上，大多數(shù)高靈敏度方法使用過夜溫育，總共花費(fèi)約24小時(shí)。因培養(yǎng)所需時(shí)間，這些方 法可花費(fèi)達(dá)3天的時(shí)間，這取決于待鑒定的生物和樣品來源。該延滯時(shí)間通常是不適合的， 因?yàn)槲廴镜氖称?、水（或其它產(chǎn)品）可能已進(jìn)入家畜或人中。此外，耐抗生素菌的增加和生 物防御考慮使得水、食品和臨床樣品中的細(xì)菌病原體的快速鑒定在世界上成為關(guān)鍵的優(yōu)先 事項(xiàng)。
[0006] 因此，存在對(duì)微生物例如細(xì)菌和其它潛在病原性微生物的更快速的、簡單靈敏的 檢測和鑒定的需要。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 在一個(gè)方面，本發(fā)明利用用于檢測樣品中的微生物的微生物生物學(xué)。可使用本文 中描述的方法檢測多種微生物。
[0009] 例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括使用多個(gè)存在于單個(gè)微生物中的核糖體作 為檢測存在于樣品中的低水平微生物的工具的方法和系統(tǒng)。例如，所述方法可包括如下步 驟：將微生物與樣品中的其它組分分離，裂解微生物以釋放存在于微生物中的核糖體；和 檢測核糖體或核糖體的組分，其中核糖體或核糖體的組分的檢測表明微生物存在于樣品 中。在某些實(shí)施方案中，可使用基于珠粒的擴(kuò)增免疫測定法來測定從微生物釋放的核糖體 和/或核糖體蛋白。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括與炭黑納米條形碼（nanostring)組 合以檢測從微生物釋放的核糖體和/或核糖體蛋白的側(cè)流測定。
[0010] 在其它另外的和/或可選擇的方面，本發(fā)明利用可結(jié)合微生物或其組分的試劑的 高度特異性作為工具以檢測和分離存在于樣品中的低水平的微生物（例如，單個(gè)微生物）。 例如，在某些實(shí)施方案中，該方法可包括將至少一個(gè)細(xì)菌與樣品的其它組分分離和利用多 個(gè)親代噬菌體感染所述至少一個(gè)細(xì)菌的步驟。該方法還可包括裂解所述至少一個(gè)細(xì)菌以釋 放存在于細(xì)菌中的子代噬菌體。該方法還可包括檢測子代噬菌體或子代噬菌體的組分，其 中噬菌體或噬菌體的組分的檢測表明細(xì)菌存在于樣品中。
[0011] 本發(fā)明還包括利用特異性結(jié)合劑例如噬菌體和/或抗體的特異性來從樣品分離 微生物的方法和系統(tǒng)。
[0012] 本文中描述的其它實(shí)施方案使用利用可檢測部分標(biāo)記的子代噬菌體和/或細(xì)菌， 以幫助檢測感染的細(xì)菌。例如，子代噬菌體可包括可檢測的生物分子例如螢光素酶蛋白?；?者，子代噬菌體可通過包含標(biāo)志生物分子例如螢光素酶蛋白的細(xì)菌的感染來定量?；蛘?，子 代噬菌體可使用與炭黑納米條形碼結(jié)合的側(cè)流測定來定量。
[0013] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含用于進(jìn)行本文中公開的方法的組分的系統(tǒng) (例如,試劑盒）。
[0014] 因此，本發(fā)明的實(shí)施方案依賴于用于細(xì)菌檢測的放大的基于噬菌體和基于核糖體 的方法。本文中使用的原理可用于檢測其它微生物。由于存在于微生物中的核糖體的絕對(duì) 數(shù)量或放大后存在于細(xì)胞中的感染因子的數(shù)量的快速增加，因此可比檢測微生物本身更容 易地檢測核糖體和/或這樣的子代感染因子。這樣，本發(fā)明的實(shí)施方案可實(shí)現(xiàn)從單個(gè)感染 細(xì)胞的至少10, 〇〇〇倍的總體放大。
[0015] 附圖概述
[0016] 可通過參考下列非限定性附圖來更好地理解本發(fā)明。
[0017] 圖1，圖框A-E，描述了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的溶液中完整細(xì)菌細(xì)胞的基于抗 體的捕獲的示意圖。
[0018] 圖2顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，使用基于抗體的捕獲而捕獲的細(xì)菌的平板 測定。
[0019] 圖3,圖框A和B，顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，使用生物素化的抗核糖體IgG 和連接于鏈霉抗生物素蛋白的磁珠進(jìn)行的核糖體蛋白質(zhì)捕獲的western印跡。
[0020] 圖4,圖框A和B，分別顯示包含多個(gè)核糖體的細(xì)胞和純化的核糖體的電子顯 微照片，其中圖框A顯示了顯示大量核糖體（電子致密點(diǎn)）的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的薄切片的部分（約1/3)的電子顯微照片，圖框B顯示了純化的大腸桿菌核糖 體的負(fù)染色電子顯微照片。細(xì)胞直徑約為lym，核糖體直徑約為20nm。
[0021] 圖5舉例說明一個(gè)測定法，該測定法包括通過使用固定的結(jié)合劑從樣品分離細(xì) 菌，裂解細(xì)胞，導(dǎo)致多個(gè)核糖體的釋放，以及根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案進(jìn)行核糖體的免疫測 定。
[0022] 圖6舉例說明一個(gè)測定法，該測定法包括裂解樣品中的細(xì)菌細(xì)胞，通過使用固定 的結(jié)合劑分離從細(xì)胞釋放的核糖體，根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案進(jìn)行核糖體的夾心免疫測 定。
[0023] 圖7,圖框A和B，舉例說明用于使用標(biāo)準(zhǔn)免疫測定形式（圖框A)或根據(jù)本發(fā)明一 個(gè)實(shí)施方案的信號(hào)的珠粒放大（圖框B)檢測核糖體、噬菌體或它們的組成蛋白的夾心免疫 測定。
[0024] 圖8,圖框A-F，顯示根據(jù)本發(fā)明的可選擇實(shí)施方案的多種核糖體蛋白檢測法。
[0025] 圖9顯示根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的核糖體蛋白的檢測的結(jié)果，其中X軸表示細(xì) 菌細(xì)胞的數(shù)目，y軸表示相對(duì)于無細(xì)菌細(xì)胞的對(duì)照的信號(hào)。
[0026] 圖10,圖框A-D描述了用于根據(jù)本發(fā)明可選擇實(shí)施方案檢測核糖體的側(cè)流測定的 用途，其中圖框A顯示側(cè)流測試條檢測的示意圖和炭黑納米條形碼（CBNS)的描述；圖框B 顯示使用側(cè)流測定測量核糖體的示意圖；以及圖框C和D顯示使用側(cè)流測定和可選擇的顯 影方法進(jìn)行的核糖體的測量。
[0027] 圖11描述了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案使用指示菌檢測從細(xì)菌細(xì)胞分離的子代噬 菌體。
[0028] 圖12圖框A-C，顯示根據(jù)本發(fā)明可選擇實(shí)施方案的從目標(biāo)細(xì)菌樣品進(jìn)行子代噬菌 體檢測的用途，其中圖框A顯示相較于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌菌落形成單位（CFU)測定，使用子代噬菌體 進(jìn)行的一個(gè)或兩個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的檢測；圖框B顯示也相較于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌菌落形成（CFU)測定，對(duì) 于本發(fā)明噬菌體檢測（PFU)測定的劑量反應(yīng)作用；圖框C顯示來自作為單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞（即， 100個(gè)噬菌體）或27個(gè)細(xì)菌細(xì)胞（即，2700個(gè)噬體）的子代的等同物的噬菌體的裂解指示 菌的檢測；圖框D顯示使用利用指示菌細(xì)胞的噬菌體測定進(jìn)行的每樣品1、5和7個(gè)樣品細(xì) 菌細(xì)胞的檢測；以及圖框E顯示使用利用細(xì)菌指示細(xì)胞的噬菌體測定進(jìn)行的每樣品中大量 (達(dá)到10, 000個(gè)細(xì)胞）樣品細(xì)菌細(xì)胞的檢測。
[0029] 圖13描述了具有與螢光素酶融合的衣殼蛋白的指示噬菌體用于根據(jù)本發(fā)明一個(gè) 實(shí)施方案檢測從細(xì)菌細(xì)胞分離的子代噬菌體的用途。
[0030] 圖14描述了具有可溶性螢光素酶的指示噬菌體用于根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案檢 測從細(xì)菌細(xì)胞分離的子代噬菌體的用途。
[0031] 發(fā)明詳述
[0032] 定義
[0033] 除非在本文中另有定義，否則結(jié)合本發(fā)明使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語將具有本領(lǐng)域技 術(shù)人員通常理解的含義。此外，除非按上下文中另外要求，否則單數(shù)術(shù)語將包括復(fù)數(shù)并且復(fù) 數(shù)術(shù)語將包括單數(shù)。通常地，與細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)以 及蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)和本文中描述的雜交結(jié)合的命名法以及所述領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)是本領(lǐng)域 中公知的和通常使用的。除非另有所指，否則通常按照本領(lǐng)域中公知的和各種一般和更專 業(yè)的參考資料中描述的常規(guī)方法進(jìn)行已知的方法和技術(shù)，所述方法在本說明書全文中進(jìn)行 了論述。按照制造商的說明書進(jìn)行酶促反應(yīng)和純化技術(shù)，如本領(lǐng)域中通常實(shí)現(xiàn)的或如本文 中描述的。與本文中描述的實(shí)驗(yàn)室方法和技術(shù)結(jié)合使用的命名法是本領(lǐng)域中公知的和通常 使用的命名法。
[0034] 除非另有所指，否則下列術(shù)語將被理解為具有下列含義：
[0035] 如本文中所用，除非另有所指，否則術(shù)語〃一個(gè)/ 一種（a)"、〃一個(gè)/ 一種（an)" 和〃所指物（the)"可指一個(gè)或多個(gè)。
[0036] 除非另外明確地僅意指供選方案或供選方案是相互排斥的，否則術(shù)語"或"的使用 用于意指"和/或"，盡管本公開內(nèi)容支持僅意指供選方案和"和/或"。如本文中所用，"另 一個(gè)〃可意指至少兩個(gè)或更多個(gè)。
[0037] 在整個(gè)本申請中，術(shù)語〃約〃用于表示數(shù)值包括將用于測定數(shù)值的設(shè)備、方法的固 有誤差變化或樣品間存在的變化。
[0038] 術(shù)語〃固體載體〃或〃載體〃意指提供可將生物分子結(jié)合于其上的基底的結(jié)構(gòu)。 例如，固體載體可以是測定孔（即，例如微量滴定板），或固體載體可以是陣列上的特定區(qū) 域或可移動(dòng)載體例如珠粒。
[0039] 術(shù)語〃抗體〃包括單克隆抗體、多克隆抗體、合成抗體和嵌合抗體，例如，通過組合 誘變和噬菌體展示產(chǎn)生的。術(shù)語"抗體"還包括抗體的模擬物或肽模擬物。肽模擬物是基 于或來源于肽和蛋白質(zhì)的化合物。本發(fā)明的肽模擬物通常可通過使用非天然氨基酸、構(gòu)象 約束、電子等排取代等對(duì)已知肽序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾來獲得。
[0040] 術(shù)語〃結(jié)合劑〃是指可特異性和選擇性結(jié)合第二（即，不同的）目標(biāo)分子的分子。 相互作用可以是非共價(jià)的，例如因氫鍵合、范德瓦爾斯相互作用或靜電或疏水相互作用所 致，或其可以是共價(jià)的。術(shù)語"可溶性結(jié)合劑"是指不與固體載體結(jié)合（即，共價(jià)地或非共 價(jià)地結(jié)合的）的結(jié)合劑。
[0041] 如本文中所用，"分析物〃是指待測量的分子、化合物或細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中， 目標(biāo)分析物可與結(jié)合劑相互作用。如本文中所述，術(shù)語"分析物"可指目標(biāo)蛋白質(zhì)或肽。分 析物可以是激動(dòng)劑、拮抗劑或調(diào)節(jié)劑?；蛘撸治鑫锟梢圆痪哂猩镄?yīng)。分析物可包括小 分子、糖、寡糖、脂質(zhì)、肽、肽模擬物、有機(jī)化合物等。
[0042] 術(shù)語〃可檢測部分〃或〃可檢測的生物分子〃或〃報(bào)告子〃或〃指示劑部分〃是 指可在定量測定中測量的分子。例如，可檢測部分可包括可用于將底物轉(zhuǎn)化成可被測量的 產(chǎn)物（例如，可見產(chǎn)物）的酶?；蛘撸蓹z測部分可以是可定量的放射性同位素?；蛘撸?檢測的部分可以是熒光基團(tuán)。或者，可檢測部分可以是發(fā)光分子?；蛘?，可使用其它可檢測 分子。
[0043] 如本文中所用，術(shù)語"等價(jià)帶"包括其中抗原和抗體的濃度導(dǎo)致最大沉淀的沉淀 素反應(yīng)中的區(qū)域。因此，如果抗原或抗體過量，則沉淀不發(fā)生。
[0044] 如本文中所用，〃噬菌體〃或〃噬菌體（phage) 〃包括多個(gè)細(xì)菌病毒的一個(gè)或多個(gè)。 在本公開內(nèi)容中，術(shù)語〃噬菌體〃和〃噬菌體（Phage)"包括病毒例如分枝桿菌噬菌體（例 如對(duì)于TB和paraTB)、噬真菌體（例如對(duì)于真菌）、支原體噬菌體和意指可侵入活細(xì)菌、真 菌、支原體、原生動(dòng)物、酵母和其它微觀活生物體并使用它們復(fù)制其自身的病毒的任何其它 術(shù)語。此處，〃微觀的〃意指最大尺寸為1毫米或更小。噬菌體是在自然界中已進(jìn)化成使 用細(xì)菌作為復(fù)制它們自身的裝置的病毒。噬菌體通過將其自身附著至細(xì)菌并將其DNA (或 RNA)注射入該細(xì)菌，誘導(dǎo)其復(fù)制噬菌體數(shù)百或數(shù)千次來進(jìn)行該復(fù)制。這稱為噬菌體擴(kuò)增。
[0045] 如本文中所用，〃噬菌體標(biāo)志物〃是可與噬菌體的存在相關(guān)的任何生物或有機(jī)成 分。不受限制地，這可以是噬菌體本身、摻入噬菌體結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)或其它分子；與噬菌體 結(jié)合的蛋白質(zhì)或工程化入噬菌體的基因產(chǎn)物；與噬菌體結(jié)合的RNA或DNA ;或上述物質(zhì)的任 一種的任一部分。如本文中所用，〃細(xì)菌標(biāo)志物〃是可用于鑒定細(xì)菌的存在的生物或有機(jī) 成分，例如當(dāng)細(xì)菌被噬菌體裂解時(shí)釋放的組分，包括細(xì)胞壁組分、細(xì)菌核酸、蛋白質(zhì)、酶、小 分子或上述物質(zhì)的任何部分。例如，在某些實(shí)施方案中，通過基因工程摻入噬菌體的結(jié)構(gòu)組 分（例如，與衣殼蛋白的融合）或作為可溶性蛋白的螢光素酶蛋白是噬菌體標(biāo)志物。
[0046] 微生物的檢測
[0047] 本發(fā)明提供了用于檢測微生物的方法?？蓪⒚恳粋€(gè)本發(fā)明的方法和系統(tǒng)的實(shí)施方 案用于檢測和定量多種微生物，包括細(xì)菌細(xì)胞，以及包括來自食品、水、臨床和商業(yè)樣品的 病原體。本發(fā)明的方法在短時(shí)間內(nèi)提供了高度檢測靈敏度而無需常規(guī)生物富集。例如，本 發(fā)明的實(shí)施方案可提供樣品中單個(gè)微生物（例如，細(xì)菌細(xì)胞）的檢測和定量。
[0048] 例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于檢測目標(biāo)微生物的方法，其包括如下步 驟：將微生物與樣品中的其它組分分離；裂解微生物以釋放存在于微生物中的核糖體；和 檢測核糖體或核糖體的組分，其中核糖體或核糖體組分的檢測表明所述微生物存在于樣品 中。
[0049] 可使用本發(fā)明的方法檢測多種微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物包括細(xì)菌或真 菌或酵母的至少一種。
[0050] 多種方法可用于分離微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離微生物的步驟包括將微生 物結(jié)合于結(jié)合劑。例如，分離微生物的步驟可包括將微生物結(jié)合至結(jié)合于固體載體的結(jié)合 齊U。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合劑可以是抗體?；蛘?，當(dāng)微生物是細(xì)菌時(shí)，結(jié)合劑可以是噬菌 體并且分離細(xì)菌的步驟使用特異于所述細(xì)菌的噬菌體。
[0051] 多種方法可用于檢測來自微生物的核糖體。在一個(gè)實(shí)施方案中，核糖體的檢測包 括使用識(shí)別核糖體的一抗，和至少一種識(shí)別該一抗的二抗?；蛘撸颂求w的檢測可包括使用 識(shí)別核糖體的一抗，和至少一種識(shí)別核糖體的第二一抗。在某些實(shí)施方案中，第二一抗結(jié)合 于固體載體。在其它實(shí)施方案中，固體載體包括多種第二一抗。
[0052] 在其它實(shí)施方案中，核糖體可使用側(cè)流測定來檢測。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，將 核糖體暴露于（即，施加于）包含抗核糖體抗體的固體載體，隨后通過將核糖體流過載體的 表面來進(jìn)行檢測。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合于包含抗核糖體抗體的膜的核糖體可使用至少 一種炭黑納米條形碼（包括另外的抗核糖體抗體）來可視化。
[0053] 本發(fā)明的其它實(shí)施方案利用感染因子的特異性和多樣性（multiplicity)來檢測 目標(biāo)微生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于檢測目標(biāo)微生物的方法，其包括以下步 驟：將至少一個(gè)微生物與樣品中的其它組分分離；用多個(gè)親代感染因子感染所述至少一個(gè) 微生物；裂解該至少一個(gè)感染的微生物以釋放存在于微生物中的子代感染因子；和檢測子 代感染因子，或子代感染因子的組分，其中感染因子或感染因子組分的檢測表明所述微生 物存在于樣品中。在一個(gè)實(shí)施方案中，將親代感染因子與子代感染因子分離。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述微生物為細(xì)菌并且感染因子為噬菌體。
[0054] 例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括用于檢測目標(biāo)微生物的方法，其包括以下 步驟：將至少一個(gè)細(xì)菌與樣品中的其它組分分離；用多個(gè)親代噬菌體感染所述至少一個(gè)細(xì) 菌；裂解該至少一個(gè)感染的細(xì)菌以釋放存在于細(xì)菌中的子代噬菌體；和檢測子代噬菌體， 或子代噬菌體的組分，其中噬菌體或噬菌體組分的檢測表明所述細(xì)菌存在于樣品中。在一 個(gè)實(shí)施方案中，將親代噬菌體與子代噬菌體分離。
[0055] 該方法可包括多種用于檢測子代感染因子例如噬菌體的形式。例如，在一個(gè)實(shí)施 方案中，子代感染因子可包含指示部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，子代感染因子中的指示部分可 包括融合于結(jié)構(gòu)蛋白（例如，噬菌體衣殼蛋白）的螢光素酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，子代感染 因子中的指示部分可以是在感染因子（例如但不限于可溶性螢光素酶蛋白）的復(fù)制過程中 表達(dá)的可檢測部分，例如但不限于可溶性螢光素酶蛋白。在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，該方 法可包括用子代感染因子感染指示微生物的步驟，其中指示微生物可包含在指示微生物裂 解后釋放的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，從指示微生物釋放的蛋白質(zhì)包含可檢測部分。例 如，在一個(gè)實(shí)施方案中，釋放的蛋白質(zhì)是螢光素酶蛋白。在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，可利 用炭黑納米條形碼通過側(cè)流測定檢查來自感染的樣品細(xì)胞和/或指示細(xì)胞的子代感染因 子。
[0056] 或者，從指示微生物釋放的蛋白質(zhì)可包括核糖體。這樣，該方法組合了通過感染因 子（例如，噬菌體）感染提供的放大與通過核糖體檢測提供的放大。
[0057] 微生物的分離
[0058] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明利用可結(jié)合目標(biāo)微生物的試劑的高度特異性作為檢測 存在于樣品中的低水平微生物（例如，單個(gè)微生物）的工具。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明包括利用感染因子的特異性從樣品分離微生物的方法和系統(tǒng)。例如，在某些實(shí)施方案 中，噬菌體可用于分離細(xì)菌。
[0059] 或者，本發(fā)明可使用特異于所述微生物的抗體。一旦分離（例如，通過與抗體、感 染因子或其它結(jié)合劑相互作用）后，可裂解微生物以進(jìn)行本文中描述的核糖體和/或子代 感染因子的測定。
[0060] 因此，在某些實(shí)施方案中，分離微生物的步驟包括將微生物結(jié)合于結(jié)合劑，所述結(jié) 合劑識(shí)別微生物，從而用于將微生物與樣品的其余組分分離。本文中描述的方法可用作檢 測和分離存在于樣品中的低水平的微生物（例如，單個(gè)微生物）的工具。例如，可從具有 1〇 12立方微米體積的1毫升樣品分離具有小于1立方微米體積的單個(gè)細(xì)菌。
[0061] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括利用抗體的特異性從樣品快速且靈敏地分離單個(gè) 細(xì)菌細(xì)胞的方法和系統(tǒng)。該方法可包括將樣品與多種針對(duì)完整細(xì)胞產(chǎn)生的抗體接觸的步 驟?？捎H和純化所述抗體。
[0062] 另外地和/或可選擇地，可對(duì)抗體進(jìn)行生物素標(biāo)記。該方法還可包括使抗體結(jié)合 細(xì)菌。在其中用生物素標(biāo)記抗體的情況下，該方法還包括將樣品與多個(gè)磁性鏈霉抗生物素 蛋白涂覆的珠粒接觸，以結(jié)合細(xì)菌-抗體復(fù)合物，以及利用磁鐵捕獲珠粒-抗體-細(xì)菌復(fù)合 物?；蛘?，可使用純化生物素-抗體：細(xì)菌復(fù)合物的其它方法。通過使用這樣的方法，可將 1毫升樣品中的細(xì)菌濃縮至約1微升（?1000倍），從而有利于利用本文中描述的方法進(jìn) 一步檢測和/或定量。例如，分離后，可裂解細(xì)菌以進(jìn)行在本文中更詳細(xì)描述的核糖體的測 定。
[0063] 在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括利用感染因子（例如，特異于微生物的 病毒）的特異性從樣品快速、靈敏地分離單個(gè)微生物的方法和系統(tǒng)。因此，在另一個(gè)實(shí)施方 案中，該方法可包括將樣品與結(jié)合于固體載體（例如，磁珠）的多個(gè)特異性感染因子（例 如，細(xì)菌細(xì)胞分離中用噬菌體）接觸，從而使噬菌體-固體載體復(fù)合物能夠發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、結(jié)合 并感染細(xì)菌。隨后可捕獲固體載體-噬菌體-細(xì)菌復(fù)合物，然后裂解。
[0064] 因此，在某些實(shí)施方案中，可將生物素化的噬菌體用于感染樣品中的細(xì)菌?？蓪⑸?物素化的噬菌體固定于鏈霉抗生物素蛋白-涂覆的固體載體上。在其它實(shí)施方案中，可使 用特異性結(jié)合感染因子（例如，結(jié)合噬菌體或結(jié)合噬菌體亞結(jié)構(gòu)例如頭）的抗體將感染因 子（例如，噬菌體）固定于固體載體上。
[0065] 隨后，可通過固體載體的分離從樣品除去固定的輸入噬菌體（所述噬菌體中的一 些噬菌體在細(xì)胞裂解后結(jié)合于細(xì)菌細(xì)胞被膜）。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，固體載體是磁珠， 結(jié)合于珠粒的噬菌體可使用磁鐵進(jìn)行分離。
[0066] 或者，可通過隨后的純化將生物素化的輸入噬菌體與細(xì)菌和/或子代噬菌體分離 開。例如，可將來自感染的裂解物通過鏈霉抗生物素蛋白柱；親代（輸入）生物素化噬菌體 將結(jié)合柱子，而未被生物素化的子代噬菌體將存在于流通級(jí)分中。這樣，輸入噬菌體不干擾 在感染中產(chǎn)生的噬菌體子代的計(jì)數(shù)。
[0067] 例如，該方法可包括例如通過將樣品通過細(xì)菌過濾器（例如，0. 45um孔徑的旋轉(zhuǎn) 過濾器）過濾來收集微生物（例如，細(xì)菌）的步驟?；蛘撸墒褂梦锢矸蛛x樣品中的微生物 的其它方法。該方法還可包括利用噬菌體例如以高感染復(fù)數(shù)（Μ0Ι)感染分離的細(xì)菌，并且 其中噬菌體包含結(jié)合部分（例如，生物素或其它結(jié)合劑）。該方法還可包括例如通過洗滌 (通過用于捕獲細(xì)菌的過濾器）這樣的未吸附噬菌體來除去至少大部分過量的未吸附輸入 噬菌體。
[0068] 通過使用連接于結(jié)合劑/固體載體的噬菌體來分離細(xì)菌，本發(fā)明的方法可克服與 區(qū)分用于回收（分離）細(xì)菌的噬菌體（即，結(jié)合于結(jié)合劑或固體載體的輸入感染性噬菌體） 與子代噬菌體（其不連接于結(jié)合劑或固體載體）相關(guān)的問題。該問題的一個(gè)先前解決方 法是在靶細(xì)胞被感染后化學(xué)地破壞剩余的未被吸附的細(xì)胞外噬菌體。然而，化學(xué)處理可在 它們能夠產(chǎn)生新的噬菌體顆粒之前殺死病原體細(xì)胞。此外，每單位面積的固體載體結(jié)合高 密度的輸入感染性噬菌體消除了可裂解細(xì)菌而無子代顆粒產(chǎn)生（稱為"自外裂解（lysis from without)"的過程）的與極高感染復(fù)數(shù)（Μ0Ι)相關(guān)的潛在問題。
[0069] 可通過本領(lǐng)域已知的許多方法之一將噬菌體固定在基底上。例如，可將特異于噬 菌體的抗體用于將噬菌體連接于基底?；蛘撸墒褂门潴w例如抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素 蛋白和生物素。還可將共價(jià)連接法用于將噬菌體連接于基底。一般而言，不應(yīng)當(dāng)使用對(duì)噬 菌體尾部蛋白具有特異性的抗體，因?yàn)檫@樣的抗體對(duì)尾部蛋白的結(jié)合可干擾噬菌體顆粒結(jié) 合宿主細(xì)菌細(xì)胞的能力。
[0070] 描述微生物分離的一個(gè)實(shí)例提供于圖1，圖框A-E中。因此，如圖1中舉例說明的， 可將包含多個(gè)細(xì)菌例如細(xì)菌-X和細(xì)菌-γ(分別地22和24)的樣品暴露于特異于細(xì)菌-X 的抗體例如抗-細(xì)菌-X抗體20,如圖1Α中顯示的。在一個(gè)實(shí)施方案中，將抗體與結(jié)合劑例 如生物素21復(fù)合。在細(xì)菌-X 22結(jié)合抗體20后，可將復(fù)合物暴露于利用鏈霉抗生物素蛋 白26涂覆的磁珠（圖ΙΒ)?？贵w上的生物素可識(shí)別磁珠上的鏈霉抗生物素蛋白（圖1C)。 或者，當(dāng)一抗不被生物素化時(shí)，可將利用識(shí)別抗-細(xì)菌-X抗體的二抗涂覆的珠粒用于涂覆 磁珠?；蛘撸墒褂美米R(shí)別抗-細(xì)菌抗體的蛋白Α和/或蛋白G涂覆的珠粒。在這一點(diǎn) 上，可分離結(jié)合于珠粒的細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲效率可通過涂板結(jié)合于珠粒32的 細(xì)菌和未結(jié)合的上清液級(jí)分30 (圖1D)，隨后計(jì)數(shù)所得的菌落34 (圖1E)來定量。
[0071] 圖2描述了通過使用針對(duì)完整大腸桿菌產(chǎn)生的抗體從樣品特異性捕獲大腸桿菌 而非鼠傷寒沙門氏菌（S. typhimurim)的示例性實(shí)驗(yàn)；在每一塊的左下/右下方顯示了菌落 計(jì)數(shù)。在該實(shí)驗(yàn)中，利用鏈霉抗生物素蛋白涂覆的磁珠用于分離結(jié)合于生物素化的（兔） 多克隆抗體的復(fù)合大腸桿菌。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)特異性大腸桿菌抗體存在時(shí)大腸桿菌僅存在于珠粒 級(jí)分中，并且在上清液（未結(jié)合的）級(jí)分中沒有細(xì)菌被回收。相反地，當(dāng)使用大腸桿菌-特 異性抗體時(shí)，鼠傷寒沙門氏菌主要在上清液級(jí)分中被發(fā)現(xiàn)。在抗體不存在的情況下，兩種類 型的細(xì)菌都主要在上清液級(jí)分中被發(fā)現(xiàn)。
[0072] 圖3A和3B顯示了從包含利用6M硫氰酸胍解離并稀釋至0. 6M硫氰酸胍的核糖體 的細(xì)菌（大腸桿菌）裂解物進(jìn)行的核糖體蛋白捕獲的Western印跡數(shù)據(jù)。圖3A顯示利用 生物素標(biāo)記的抗核糖體抗體（IgG)和鏈霉抗生物素珠粒能夠從溶液捕獲核糖體蛋白?？煽?到當(dāng)不添加抗核糖體抗體（IgG = 0)時(shí)，未檢測到核糖體蛋白（"Ribo prot")。還可看到 5〇ng抗體能夠結(jié)合來自100, 000個(gè)細(xì)胞的全部核糖體蛋白。
[0073] 圖3B顯示生物素化的抗核糖體抗體和鏈霉抗生物素蛋白珠粒的添加足以定量捕 獲存在于溶液中的所有核糖體。在本實(shí)驗(yàn)中，利用或不利用200ng兔生物素化抗核糖體IgG 溫育0. 6M硫氰酸胍磷酸緩沖液中的來自大腸桿菌的裂解物。隨后，可添加鏈霉抗生物素蛋 白（SA)磁珠以捕獲Ab-核糖體蛋白復(fù)合物。從珠粒級(jí)分取出未結(jié)合的上清液，使用200ng 生物素化的抗體和SA磁珠對(duì)其進(jìn)行再捕獲（"recapt")。在利用其中核糖體蛋白先前已被 捕獲的裂解物的再捕獲實(shí)驗(yàn)中核糖體蛋白的不存在表明第一捕獲步驟足以捕獲全部核糖 體蛋白。
[0074] 基于核糖體的信號(hào)放大
[0075] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括利用存在于單個(gè)微生物中的多個(gè)核糖體作為檢測 存在于樣品中的低水平微生物的工具的方法和系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法用于測定 細(xì)菌細(xì)胞。然而，如本文中公開的，本發(fā)明的方法可用于測量其它類型的包含核糖體的微生 物，例如但不限于真菌、支原體、原生動(dòng)物、酵母和其它微觀活生物體。因此，在本發(fā)明的某 些實(shí)施方案中，核糖體釋放、鑒定和定量被用于放大天然、商業(yè)或臨床樣品中的病原體細(xì)胞 信號(hào)。
[0076] 核糖體是由兩個(gè)亞單位組成的致密核糖核蛋白顆粒，所述亞單位由包含所有氨基 酸和核糖體RNA(rRNA)的蛋白質(zhì)組成。來自細(xì)菌、古細(xì)菌和真核細(xì)胞的核糖體具有不同的 結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)和rRNA序列?？筛鶕?jù)它們的沉降速率描述核糖體。細(xì)菌核糖體通常以約70S 沉降，而真核細(xì)胞核糖體通常以約80S沉降。細(xì)菌70S核糖體具有兩個(gè)以約50S和30S沉 降的亞單位，而80S真核細(xì)胞核糖體亞單位以約60S和40S沉降。
[0077] 圖4A顯示枯草芽孢桿菌的薄切片的電子顯微照片，該照片顯示了大量核糖體（電 子致密點(diǎn)）。顯示的細(xì)胞直徑為約1 μ m,核糖體直徑為約-0. 02 μ m(20nm)。僅顯示了約1/3 的細(xì)胞長度。例如，細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌通常包含約20, 000個(gè)核糖體/細(xì)胞，這占據(jù)約 1/3至1/4的細(xì)菌蛋白質(zhì)質(zhì)量。因此，細(xì)胞裂解后釋放的細(xì)菌核糖體的檢測可提供約為單個(gè) 可培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞的信號(hào)約20, 000倍的天然放大。通過培養(yǎng)和標(biāo)準(zhǔn)富集法產(chǎn)生完整細(xì)菌細(xì) 胞的相同放大可能需要7小時(shí)或更長的溫育時(shí)間，這取決于具體細(xì)菌的生長速率。
[0078] 大腸桿菌的純化的核糖體的負(fù)染色電子顯微照片示于圖4B中。雖然細(xì)菌的核糖 體翻譯裝置是高度保守的，但在完整核糖體或分離的核糖體蛋白的表位中可存在足夠的差 異來區(qū)分革蘭氏陰性與革蘭氏陽性細(xì)菌，例如，大腸桿菌抗核糖體抗體不識(shí)別和捕獲表皮 葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis)核糖體蛋白。可以例如通過吸收血清來利用不 同物種的完整核糖體上的表位的微小差異。
[0079] 對(duì)于完整核糖體的測定，通?？捎妹?去垢劑混合物裂解濃縮的細(xì)胞來釋放核糖 體。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過添加核糖體特異性生物素化的抗體，隨后利用磁性鏈霉抗生 物素蛋白涂覆的珠粒（如本文中描述的）捕獲核糖體：抗體復(fù)合物來分離核糖體。核糖體 的存在表明特異于細(xì)胞濃縮中所用抗體的細(xì)菌的存在，核糖體的不存在表明特異于細(xì)胞濃 縮中所用抗體的細(xì)菌的不存在。
[0080] 例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于檢測目標(biāo)微生物的方法，其包括步驟： 將微生物與樣品中的其它組分分離；裂解微生物以釋放存在于微生物中的核糖體；和檢測 核糖體或核糖體組分，其中核糖體或核糖體組分的檢測表明所述微生物存在于樣品中。在 某些實(shí)施方案中，分離微生物的步驟可包括將微生物結(jié)合于結(jié)合劑，所述結(jié)合劑識(shí)別微生 物，這樣被用于從樣品的剩余物分離微生物。例如，在某些實(shí)施方案中，分離微生物的步驟 可包括將微生物結(jié)合于結(jié)合劑（例如，抗體或噬菌體），所述結(jié)合劑結(jié)合于固體載體或包含 識(shí)別結(jié)合于固體載體的第二試劑（例如，鏈霉抗生物素蛋白或第二抗體）的結(jié)合劑（例如， 生物素）。例如，可將識(shí)別來自目標(biāo)微生物的核糖體蛋白的親和純化多克隆或單克隆抗體用 于檢測核糖體和核糖體蛋白。
[0081] 在其它另外的和/或可選擇的實(shí)施方案中，通過完整核糖體的檢測提供的信號(hào)可 通過核糖體蛋白（通過完整核糖體的解離獲得的）的檢測來進(jìn)一步放大，例如，大腸桿菌的 每一個(gè)核糖體包含55種不同的蛋白，34種蛋白在50S亞單位中，21種蛋白在30S亞單位中。 例如，可裂解從本文中描述的樣品分離的細(xì)胞，隨后通過添加離液劑（例如，硫氰酸胍）在 單個(gè)步驟中將其中的核糖體解離成單個(gè)蛋白質(zhì)分子。約1/3的核糖體質(zhì)量為蛋白質(zhì)，約2/3 的核糖體質(zhì)量為核糖體RNA(rRNA)。因此，在單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中組成20, 000個(gè)核糖體中的每 一個(gè)核糖體的55種核糖體蛋白的檢測可提供單個(gè)可培養(yǎng)細(xì)胞的信號(hào)約100萬倍的假定信 號(hào)放大。此外，每一個(gè)核糖體的55種不同的蛋白質(zhì)分子具有多個(gè)可結(jié)合特異性抗體的表位 (有限長度的氨基酸序列和可變組成，數(shù)目依賴于蛋白質(zhì)質(zhì)量）。相反地，完整核糖體的表 面上展示更少的蛋白質(zhì)表位；大多數(shù)表位被包埋在內(nèi)部或特異性結(jié)合于rRNA，從而不能接 觸它們的特異性抗體。因此，特異于來自目標(biāo)微生物的核糖體蛋白的多克隆或單克隆抗體 可用于分離、檢測和定量核糖體或來自解離核糖體的核糖體蛋白。
[0082] 本發(fā)明的實(shí)施方案利用針對(duì)純化的核糖體（例如，大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌和表 皮葡萄球菌）產(chǎn)生的多克隆兔和豚鼠抗血清?；蛘?，可使用針對(duì)來自其它微生物的核糖體 蛋白的抗體。
[0083] 例如，如圖5中舉例說明的，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可包括通過使用具 有特異于微生物的結(jié)合劑或噬菌體108的基底106,從樣品104回收并濃縮微生物102 (例 如，細(xì)菌）的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合劑108被固定在固體載體106 (例如，聚苯乙烯、 二氧化硅或其它載體例如晶片、測試條（dipsticks)、濾器或珠粒）上，或是游離的，隨后被 固定在固體載體上。隨后可從樣品取出固定的微生物（例如，通過抽吸、傾析或磁力）。隨 后可在固體載體上原位裂解微生物和/或?qū)⑵溽尫湃胄〉捏w積（例如，微量滴定孔）112以 進(jìn)行進(jìn)一步分析。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過添加小體積的化學(xué)藥品與酶的混合物裂 解濃縮的微生物細(xì)胞，以將核糖體114直接釋放至固體載體上和/或釋放入更小的體積112 例如微量滴定孔。
[0084] 在一個(gè)另外和/或可選擇的實(shí)施方案中，核糖體蛋白可使用抗核糖體抗體116來 檢測（例如，圖5)。如在本領(lǐng)域中已知的，抗核糖體一抗可被直接標(biāo)記（例如，利用熒光生 物分子）118,或一抗對(duì)核糖體的結(jié)合可利用二抗來檢測。
[0085] 在本發(fā)明的方法和系統(tǒng)的其它一些實(shí)施方案中，以及圖6中舉例說明的，樣品104 中的微生物細(xì)胞102可通過添加化學(xué)品與酶的混合物來原位裂解（例如，在樣品中），以釋 放核糖體114。隨后可通過使用具有特異性結(jié)合核糖體的固定的結(jié)合劑122 (例如，抗體或 其它結(jié)合劑）的基底106而從樣品回收核糖體并濃縮其。隨后可利用離液劑將濃縮的核糖 體離解成亞單位126,稀釋試劑或除去其，例如使用利用可檢測部分119標(biāo)記的抗體117鑒 定單個(gè)蛋白質(zhì)126。例如，可通過方法例如但不限于旋轉(zhuǎn)濃縮器的使用或除去解離劑來回收 核糖體蛋白亞單位并濃縮其，和如本文中描述的鑒定蛋白質(zhì)亞單位。
[0086] 在可選擇的實(shí)施方案中，可通過標(biāo)準(zhǔn)免疫測定或通過珠粒-抗體免疫測定放大 法，例如本文中描述的所述方法，或通過在本領(lǐng)域中是已知的其它靈敏的生物化學(xué)、免疫化 學(xué)、免疫熒光或生物物理法來鑒定核糖體和/或核糖體蛋白。因此，ELISA、RIA或免疫熒光 測定可用于檢測和定量核糖體蛋白。
[0087] 或者，不除去解離劑，可在反相蛋白質(zhì)微陣列（RPPMA)法中將核糖體蛋白亞 單位沉積在適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合基底上。在一個(gè)實(shí)施方案中，可封閉基底以阻止其它大分子 的結(jié)合，通過連接至報(bào)道分子來鑒定蛋白質(zhì)亞單位。例如，在反相微陣列法中，可將 變性的蛋白質(zhì)直接排列在硝酸纖維素涂覆的載玻片上，利用一抗探測，隨后利用二 抗-報(bào)道分子復(fù)合物例如生物素化的二抗-Qdot復(fù)合物顯影（參見，例如，Geho等 人，2007,Fluorescence-based analysis of cellular protein lysate arrays using quantum dots,229-237,in^Quantum Dots,Applications in Biology"，Methods in Molecular Biology :374, Bruchez 和 Hotz, eds. , Humana Press)〇
[0088] 在另一個(gè)另外和/或可選擇的實(shí)施方案中，以及如本文中更詳細(xì)論述的，可通過 利用等價(jià)帶上的最佳濃度核糖體或核糖體蛋白凝集利用抗核糖體抗體涂覆的大珠粒（例 如，15 μ m的珠粒）來檢測（直接或在50-100X的放大倍數(shù)下）完整核糖體或核糖體蛋白分 子。完整核糖體表面上的rRNA序列可提供可排斥抗體的高度負(fù)變化的視野。在一個(gè)實(shí)施 方案中，這樣的電荷可利用小的堿性分子例如BAC(芐基二甲基烷基氯化銨）來中和。在本 實(shí)施方案中，可將核糖體分散于微量滴定孔中而非定位于固體載體。
[0089] 噬菌體蛋白和/或核糖體蛋白的放大免疫檢測
[0090] 在某些方面，本發(fā)明利用已被偶聯(lián)于固體載體以進(jìn)一步放大信號(hào)的生物分子的高 度特異性作為工具來檢測存在于樣品中的低水平的分析物（例如，目標(biāo)蛋白質(zhì)）。在某些實(shí) 施方案中，對(duì)于其中待鑒定的蛋白質(zhì)直接或通過捕獲抗體結(jié)合于鈍化表面的免疫化學(xué)（例 如，ELISA或RIA)或免疫熒光測定，可實(shí)現(xiàn)約10, 000倍的信號(hào)放大。
[0091] 因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于檢測目標(biāo)分析物的方法，所述方法包括 向目標(biāo)分析物中添加檢測載體，所述檢測載體包括包含識(shí)別目標(biāo)分析物并與其結(jié)合的多個(gè) 結(jié)合劑分子的固體載體；和檢測存在于檢測載體上的眾多結(jié)合劑分子的至少一些結(jié)合劑分 子。在某些實(shí)施方案中，該方法還可包括添加捕獲載體，所述捕獲載體包含至少一種識(shí)別目 標(biāo)分析物并與其結(jié)合的捕獲載體結(jié)合劑以將目標(biāo)分析物固定在捕獲載體上。在一個(gè)實(shí)施方 案中，在與檢測載體相互作用之前將目標(biāo)分析物結(jié)合于捕獲載體?；蛘?，可在與檢測載體相 互作用后，將目標(biāo)分析物結(jié)合于捕獲載體。在某些實(shí)施方案中，該方法還可包括添加可特異 性識(shí)別檢測載體上的眾多結(jié)合劑分子的至少一些并與其結(jié)合的結(jié)合劑。在一個(gè)實(shí)施方案 中，可特異性識(shí)別檢測載體上的眾多結(jié)合劑分子的至少一些并與其結(jié)合的結(jié)合劑是可溶性 結(jié)合劑。
[0092] 在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲固體載體可以是測定孔（S卩，例如微量滴定板）。或者，捕 獲固體載體可以是陣列上的位點(diǎn)，或可移動(dòng)載體，例如珠粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測載體 是移動(dòng)載體例如珠粒。在某些實(shí)施方案中，目標(biāo)分析物可以存在于溶液中?；蛘撸繕?biāo)分析 物可以是微生物和/或組織內(nèi)部的蛋白質(zhì)，從而在固定后，細(xì)胞中的大分子充當(dāng)捕獲載體。 例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫測定放大法可用于蛋白質(zhì)的原位檢測。
[0093] 在一個(gè)實(shí)施方案中，向包含目標(biāo)分析物的樣品中添加過量的包含特異性識(shí)別目標(biāo) 分析物的結(jié)合劑多個(gè)分子的檢測載體。同樣地，在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測載體包含多個(gè)分子 的可檢測部分?；蛘?，當(dāng)結(jié)合劑用于識(shí)別檢測載體上的眾多結(jié)合劑分子例如二抗時(shí)，可溶性 結(jié)合劑可包含可檢測部分。
[0094] 多種結(jié)合劑可用于本發(fā)明的方法。例如，連接于檢測載體的眾多結(jié)合劑分子可以 是識(shí)別目標(biāo)分析物的抗體或抗體片段。
[0095] 此外和/或可選擇地，連接捕獲載體的結(jié)合劑可以是識(shí)別目標(biāo)分析物的抗體或抗 體片段。此外和/或可選擇地，可特異性識(shí)別檢測載體上的眾多結(jié)合劑分子（例如，二抗） 的至少一些并與其結(jié)合的結(jié)合劑可以是抗體或抗體片段?；蛘?，捕獲或檢測載體的任一種 上的結(jié)合劑或可特異性識(shí)別檢測載體上的眾多結(jié)合劑分子的至少一些并與其結(jié)合的結(jié)合 劑可包含結(jié)合非蛋白質(zhì)靶的蛋白（即，例如特異性結(jié)合小分子目標(biāo)分析物的蛋白，或結(jié)合 蛋白的受體）。
[0096] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可特異性識(shí)別檢測載體上的眾多結(jié)合劑分子（例如，二抗）的 至少一些并與其結(jié)合的結(jié)合劑不識(shí)別用于將目標(biāo)分析物結(jié)合于捕獲固體載體的捕獲結(jié)合 劑。
[0097] 包含識(shí)別目標(biāo)分析物的許多結(jié)合劑的檢測載體的使用提供了信號(hào)的放大。在可選 擇的實(shí)施方案中，檢測載體包含超過1，〇〇〇個(gè)，或超過10, 〇〇〇個(gè)，或超過100, 〇〇〇個(gè)，或超 過500, 000個(gè)，或超過1，000, 000個(gè)特異于目標(biāo)分析物的結(jié)合劑分子。因此，在可選擇的實(shí) 施方案中，本發(fā)明的方法提供了為在標(biāo)準(zhǔn)非放大免疫測定（所述測定不包括包含眾多檢測 結(jié)合劑的檢測載體）中看到的信號(hào)的1，〇〇〇至1，〇〇〇, 〇〇〇, 〇〇〇倍，或1，〇〇〇至100, 〇〇〇, 〇〇〇 倍，或 5, 000 至 10, 000, 000 倍，或 10, 000 至 1，000, 000 倍，或 10, 000 倍變化至 500, 000 倍， 或50, 000至500, 000倍的放大?；蛘?，可實(shí)現(xiàn)在這些范圍內(nèi)的范圍。
[0098] 檢測載體和/或捕獲載體的使用可包括多種形式。
[0099] 例如，在一些實(shí)施方案中，可首先將目標(biāo)分析物結(jié)合于捕獲載體，隨后讓其與檢測 載體相互作用。因此，該方法可包括將眾多可特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白的結(jié)合劑連接于捕獲載 體的步驟。該方法還可包括將目標(biāo)分析物添加至捕獲載體。隨后，該方法可包括添加檢測 載體，所述檢測載體包含特異于結(jié)合于捕獲載體的目標(biāo)分析物的多個(gè)檢測結(jié)合劑，以便所 述多個(gè)檢測結(jié)合劑的檢測提供信號(hào)的放大。
[0100] 同樣地，在某些實(shí)施方案中，該方法可包括添加可特異性識(shí)別眾多檢測結(jié)合劑并 與其結(jié)合的結(jié)合劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，可特異性識(shí)別眾多檢測結(jié)合劑并與其結(jié)合的結(jié)合 劑是可溶性結(jié)合劑。第三結(jié)合劑可包含可檢測部分。因此，在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行所述方 法的步驟產(chǎn)生由捕獲載體：捕獲結(jié)合劑：目標(biāo)分析物：檢測結(jié)合劑：檢測載體：可溶性結(jié) 合劑：可檢測部分組成的復(fù)合物。
[0101] 例如，在幾個(gè)實(shí)施方案中，通過使用包括由本文中描述的檢測載體提供的基于珠 粒的放大的測定來測定來自微生物的核糖體蛋白和/或來自感染因子的蛋白（例如，噬菌 體蛋白）。
[0102] 因此，圖7A舉例說明非放大間接〃夾心〃免疫測定系統(tǒng)，其中核糖體、核糖體蛋白 或子代噬菌體（或來自待測定的微生物的其它目標(biāo)蛋白）被固定在固體載體上，隨后通過 抗體進(jìn)行檢測。例如，如圖7A中舉例說明的，可將通過細(xì)菌細(xì)胞（包括核糖體）的裂解和 解離，通過利用離液劑（例如，硫氰酸胍）的處理，或通過噬菌體子代的解離產(chǎn)生的核糖體 或子代噬菌體蛋白分子206固定在利用定向抗核糖體或抗噬菌體一抗208 (例如，兔）涂覆 的固體表面214上。在一個(gè)實(shí)施方案中，固體表面可用蛋白A/G涂覆，隨后進(jìn)行鈍化（即， 被涂覆以減少非特異性結(jié)合）?；蛘撸蓪⒖贵w共價(jià)結(jié)合于固體表面，隨后鈍化表面。如圖 7A中顯示的，固定的抗體208可特異性識(shí)別核糖體、核糖體蛋白或目標(biāo)噬菌體蛋白206,而 其它蛋白或生物分子202、204不被結(jié)合。目標(biāo)核糖體、核糖體蛋白或噬菌體蛋白206隨后 可通過添加也識(shí)別所述目標(biāo)核糖體、核糖體蛋白或噬菌體蛋白的第二一抗211來檢測。例 如，固定的抗體208可以是兔抗核糖體抗體，而第二一抗211可以是豚鼠抗核糖體抗體。隨 后可利用二抗（例如，抗-豚鼠抗體）212檢測第二一抗。在一個(gè)實(shí)施方案中，二抗212用 可檢測部分210標(biāo)記。例如，二抗可用熒光部分（例如,qD0TS?)或酶（例如，辣根過氧 化物酶）標(biāo)記。
[0103] 圖7B描述了可用于檢測核糖體、核糖體蛋白或子代噬菌體蛋白（或其它目標(biāo)蛋 白）的基于珠粒的"夾心"放大免疫測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，將核糖體、核糖體蛋白或子 代噬菌體蛋白或其它目的蛋白固定在固體載體上，隨后利用抗體進(jìn)行檢測。例如，可將通過 細(xì)菌細(xì)胞的裂解和解離產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白分子206固定在利用定向抗核糖體或抗噬菌體一 抗208(例如，兔）包被的固體表面214上。在某些實(shí)施方案中，固體表面可用蛋白A/G涂 覆，隨后進(jìn)行鈍化（即，被涂覆以減少非特異性結(jié)合）?；蛘?，可將抗體共價(jià)結(jié)合于固體表 面，隨后鈍化表面。與非放大測定類似，固定的抗體208可特異性識(shí)別目標(biāo)核糖體、核糖體 蛋白或噬菌體蛋白206，而其它蛋白或生物分子202、204不被結(jié)合。
[0104] 隨后可添加利用數(shù)百個(gè)或數(shù)千個(gè)或數(shù)萬個(gè)或數(shù)十萬個(gè)也識(shí)別目標(biāo)核糖、核糖體蛋 白或噬菌體蛋白206的第二一抗211涂覆的珠粒。例如，固定的抗體可以是兔抗核糖體抗 體，而第二一抗可以是豚鼠抗核糖體抗體。這樣，目標(biāo)分析物206將包含眾多識(shí)別目標(biāo)分析 物206的放大第二一抗211的珠粒連接于固體載體214。最后，添加識(shí)別第二一抗211的 二抗（例如，抗-豚鼠抗體）212。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用可檢測部分210標(biāo)記二抗212。 例如，利用熒光部分（例如，0DOTS?)或酶（例如，辣根過氧化物酶）標(biāo)記第三抗體。因 此，可以從單個(gè)蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生信號(hào)的極大放大。
[0105] 因此，在用于檢測樣品中微生物的可選擇的實(shí)施方案（其中核糖體或子代噬菌體 顆粒解離成它們的組成蛋白質(zhì)亞單位提供了額外放大（因?yàn)榇竽c桿菌的每一個(gè)核糖體包 含55個(gè)蛋白質(zhì)，并且噬菌體顆粒例如T4可包含數(shù)千個(gè)蛋白質(zhì)分子））中，高增益放大免疫 測定法可包括以下步驟：將微生物與樣品中的其它組分分離，和在單個(gè)步驟中通過使用離 液劑（例如，6M硫氰酸胍）解離微生物的大分子組分（包括其中的核糖體）（或?qū)⑹删w子 代解離成蛋白質(zhì)組分）。該方法還可包括去除或稀釋解離劑。該方法還可包括結(jié)合生物素 化的多克隆核糖體特異性（或噬菌體特異性）一抗（例如，兔中產(chǎn)生的）和通過磁性鏈霉 抗生物素蛋白涂覆的"捕獲"珠粒捕獲蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物。隨后，該方法可包括利用多個(gè) (例如數(shù)萬個(gè)）在另一個(gè)物種（例如，豚鼠）中產(chǎn)生的核糖體特異性（或噬菌體特異性）一 抗涂覆的"檢測"珠粒的結(jié)合。在這一點(diǎn)上，該方法可包括結(jié)合多個(gè)綴合于可檢測部分（報(bào) 道分子）例如辣根過氧化物酶、iJOTS⑩的二抗（例如，山羊抗-豚鼠）的步驟或炭黑納米 條形碼；和通過產(chǎn)生熒光或其它信號(hào)的測定。
[0106] 在一個(gè)實(shí)施方案中，高增益放大的決定因素是可容納特異于目標(biāo)分析物的大量抗 體（例如，核糖體特異性抗體）的結(jié)合的檢測珠粒的巨大表面積。被1〇 6個(gè)核糖體蛋白亞 單位（一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中核糖體的解離獲得的核糖體蛋白亞單位的近似數(shù)目）占據(jù)的面積很 小，該面積必須滿足對(duì)珠粒的可及性。在一個(gè)實(shí)施方案中，1〇 6個(gè)1 μ m珠粒的二維匯合陣列 將占據(jù)約1_2。對(duì)于可移動(dòng)捕獲載體（例如，珠粒），可結(jié)合的具有特定尺寸的檢測載體的 數(shù)目可受到位阻效應(yīng)限制?？赏ㄟ^ELISA、RIA或免疫熒光測定單個(gè)蛋白質(zhì)分子對(duì)被10 5個(gè) 一抗涂覆的珠粒的結(jié)合和隨后標(biāo)記二抗的結(jié)合，從而提供高增益放大。
[0107] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過離心至具有適當(dāng)孔徑（通常地，對(duì)于細(xì)菌為0. 45 μ m 以及對(duì)于核糖體為0.02μπι)的旋轉(zhuǎn)過濾器的表面上來濃縮樣品中的細(xì)胞（或通過本文中 描述的方法從樣品中的細(xì)胞釋放的核糖體）。隨后可在本文中描述的小體積緩沖液（例 如，?20μ 1)中裂解濃縮的細(xì)胞以釋放核糖體?？蓪⒑颂求w（例如，來自單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的約 20, 000個(gè)）從過濾器表面轉(zhuǎn)移至微量滴定板的孔。在這一點(diǎn)上，可通過添加?3, 000個(gè)大 的聚苯乙烯珠粒（通常地直徑為15至20μπι)后網(wǎng)格的形成來鑒定核糖體或核糖體蛋白， 所述珠粒被偶聯(lián)于可識(shí)別核糖體或核糖體蛋白上的多個(gè)表位的多克隆抗體。每一個(gè)大的珠 ?？山Y(jié)合?1〇 7個(gè)抗體，如果用蛋白G或另一種復(fù)合于抗體的蛋白預(yù)涂覆珠粒，則抗體被定 向用于最佳抗原結(jié)合。因核糖體或核糖體蛋白橋連固定在分開的珠粒上的抗核糖體抗體所 致的網(wǎng)格形成（珠粒凝集）可以很快，并且取決于使用的珠粒的尺寸和數(shù)目，其可直接看到 而無需放大，或可通過光學(xué)顯微鏡在50-100Χ的放大倍數(shù)下看到。核糖體蛋白的系列稀釋 物的使用可鑒定等價(jià)帶，在所述等價(jià)帶中珠粒結(jié)合的抗體和蛋白分子的濃度對(duì)于珠粒凝集 是最佳的。與已知數(shù)目的核糖體或核糖體蛋白聚集（凝集）的珠粒-蛋白G-抗體復(fù)合物 可用作陽性對(duì)照，無核糖體或核糖體蛋白的緩沖液中未聚集的珠粒-蛋白G-抗體復(fù)合物可 用作陰性對(duì)照。
[0108] 圖8舉例說明了可用于檢測來自微生物的目標(biāo)分析物的免疫測定的若干可選擇 實(shí)施方案。在某些實(shí)施方案中，所述測定提供了基于珠粒的放大。
[0109] 如圖8Α中顯示的，方法la和lb分別提供了針對(duì)核糖體和/或噬菌體蛋白的未放 大的和放大的免疫測定的示例性實(shí)施方案。在這些測定中，添加特異于目標(biāo)分析物206(例 如，核糖體或噬菌體蛋白）的游離生物素化一抗分子230(例如，兔）以結(jié)合溶液中的靶分 子。該生物素化的抗體分子230可特異性識(shí)別目標(biāo)分析物206,而其它蛋白質(zhì)或生物分子 202、204不被結(jié)合。在這一點(diǎn)上，可添加磁性鏈霉抗生物素蛋白涂覆的〃捕獲〃珠粒240 (例 如，直徑約1微米）以定量結(jié)合生物素化的抗體-蛋白質(zhì)復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方 法可包括通過添加生物素和牛血清白蛋白（BSA)來封閉珠粒-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
[0110] 在這一點(diǎn)上，在放大測定（方法lb)中，添加利用數(shù)百至數(shù)千、至數(shù)萬、至數(shù)十萬或 更多分子的在不同物種（例如豚鼠）中產(chǎn)生的第二抗核糖體一抗211涂覆的"檢測"珠粒 233,以結(jié)合核糖體蛋白分子上的開放的未被占據(jù)的表位?？墒褂米R(shí)別第二一抗211的二抗 分子（例如，抗豚鼠抗體）212檢測第二一抗分子211的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用可檢 測部分210標(biāo)記二抗分子212。例如，二抗可用熒光部分（例如，QDOTS收）或酶（例如， 辣根過氧化物酶）標(biāo)記。因此，歸因于檢測珠粒上大量第二一抗分子的存在，信號(hào)的極大放 大可源自單個(gè)蛋白質(zhì)分子。相反地和為了比較，在方法la中舉例說明了利用捕獲珠粒而非 放大檢測珠粒進(jìn)行的間接免疫熒光夾心測定。
[0111] 圖8B(方法2)舉例說明了方法la的未放大測定的可選擇形式，但其中在添加鏈 霉抗生物素珠粒240之前，同時(shí)添加第二一抗分子211和第 抗分子230。
[0112] 圖8C(方法3)舉例說明了方法lb的放大測定的可選擇形式，但其中在添加識(shí)別 第一一抗分子230的鏈霉抗生物素捕獲珠粒240之前，添加第一一抗分子230和利用在不 同物種（例如，豚鼠）中產(chǎn)生的第二抗核糖體一抗分子211涂覆的檢測珠粒233。在一個(gè)實(shí) 施方案中，這可促進(jìn)目標(biāo)分析物206與檢測載體珠粒233和第--抗分子230之間的復(fù)合 物形成。
[0113] 圖8D(方法4)舉例說明了方法lb的放大測定的可選擇形式，但其中利用眾多在 不同物種（例如，豚鼠）中產(chǎn)生的第二抗核糖體一抗分子211涂覆的檢測珠粒233包含眾多 分子的可檢測部分210作為檢測珠粒223的部分（例如，通過共價(jià)連接或涂覆在表面上）而 不是結(jié)合于第二抗核糖體一抗分子211?？蓹z測部分210可包含熒光部分（例如,(JD0TS? )或酶（例如，辣根過氧化物酶）。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果檢測載體包含眾多可檢測部分， 則該方法可允許使用更少的檢測結(jié)合劑（例如，第二抗核糖體一抗211)。例如檢測載體233 上可檢測部分210:檢測結(jié)合劑211的比率可以為1:1，或5:1，或10:1，或100:1，或500:1， 或ιοοο:ι，?ο, 〇〇〇:1或更大?？蓹z測部分可包含熒光部分（例如，<JD0TS?_)或酶（例如， 辣根過氧化物酶）。
[0114] 圖8E (方法5)舉例說明方法4的測定的可選擇形式，但其中在添加識(shí)別第一一抗 分子230的鏈霉抗生物素珠粒240之前，添加利用在不同物種（例如，豚鼠）中產(chǎn)生的第二 抗核糖體一抗分子211和可檢測部分210涂覆的檢測珠粒233。在一個(gè)實(shí)施方案中，這可促 進(jìn)目標(biāo)分析物206與檢測載體珠粒233和第--抗分子230之間的復(fù)合物形成。
[0115] 圖8F (方法6)舉例說明方法3的可選擇形式，但其中在添加第一一抗分子230和 識(shí)別第一一抗分子230的鏈霉抗生物素珠粒240之前，添加利用在不同物種（例如，豚鼠） 中產(chǎn)生的第二抗核糖體一抗分子211涂覆的檢測珠粒233。在一個(gè)實(shí)施方案中，這可促進(jìn)目 標(biāo)分析物206與檢測載體珠粒233之間的復(fù)合物形成。
[0116] 圖9顯示利用方法6的結(jié)果，所述結(jié)果顯示來自500或2, 000個(gè)大腸桿菌細(xì)胞的 等同物的核糖體的檢測。X軸表示細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)目，y軸表示相對(duì)于不具有細(xì)菌細(xì)胞的對(duì)照 的信號(hào)。
[0117] 重要的是二抗和/或第二檢測一抗不結(jié)合捕獲載體抗體，因?yàn)檫@樣的結(jié)合可導(dǎo)致 本底。因此，在某些實(shí)施方案中，檢測的步驟包括添加識(shí)別檢測珠粒上的檢測一抗試劑的二 抗，但其中二抗不識(shí)別用于將目標(biāo)蛋白結(jié)合于捕獲載體的捕獲結(jié)合劑（例如，第一一抗）。
[0118] 在某些實(shí)施方案中，捕獲和/或檢測固體載體可用鈍化劑處理。例如，在某些實(shí) 施方案中，可將目標(biāo)分析物捕獲在鈍化的表面（即，經(jīng)處理而減少了非特異性結(jié)合的表面） 上。一種這樣的鈍化劑是BSA。此外和/或可選擇地，當(dāng)使用的結(jié)合劑是抗體時(shí)，可用蛋白 A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或另一種以高親和力與結(jié)合劑抗體結(jié)合的試劑涂覆捕獲和/或 檢測固體載體。這些蛋白結(jié)合抗體的Fc結(jié)構(gòu)域，從而可定向識(shí)別目標(biāo)蛋白的抗體的結(jié)合。
[0119] 檢測和/或捕獲載體可以是聚苯乙烯珠?；蛴上嗨苹蚱渌牧现圃斓闹榱?，以便 珠粒可用蛋白質(zhì)涂覆，但不與測定中的其它組分反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，珠粒足夠大以便 眾多抗體分子可被連接于珠粒。例如，珠粒的尺寸范圍在直徑上可為〇. 1至50,或0. 2至 40,或0. 3至30,或1至20,或1至15或約1至3 μ m。珠粒的尺寸可取決于待進(jìn)行的測定 的尺寸。對(duì)于在微量滴定孔中進(jìn)行的測定，可使用約1微米（ym)的珠粒。
[0120] 在可選擇的實(shí)施方案中，檢測載體可包含眾多檢測結(jié)合劑。例如，在可選擇的實(shí)施 方案中，檢測載體上的結(jié)合劑數(shù)量可以是超過100個(gè)，或超過500個(gè),或超過1，000個(gè)，或超 過5, 000個(gè)，或超過10, 000個(gè)，或超過20, 000個(gè)，或超過50, 000個(gè)，或超過100, 000個(gè)，或 超過500, 000個(gè)，或超過1，000, 000個(gè)分子的檢測結(jié)合劑。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測 載體可包含利用數(shù)萬或數(shù)十萬個(gè)抗體分子涂覆的珠粒。在可選擇的實(shí)施方案中，對(duì)于直徑 約為15 μ m的檢測載體珠粒，可存在約10, 000至10, 000, 000個(gè)，或約50, 000至1，000, 000 個(gè)，或約100, 000至500, 000個(gè)結(jié)合劑分子（例如，一抗）。對(duì)于具有不同尺寸的檢測載體 珠粒，可使用對(duì)應(yīng)的表面覆蓋度。因此，在可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供了為在 標(biāo)準(zhǔn)非放大免疫測定中看到的信號(hào)的1，〇〇〇至1，〇〇〇, 〇〇〇, 〇〇〇倍，或1，〇〇〇至100, 〇〇〇, 〇〇〇 倍，或 5, 000 至 10, 000, 000 倍，或 10, 000 至 1，000, 000 倍，或 10, 000 至 500, 000 倍，或 50, 000至500, 000倍的放大，所述標(biāo)準(zhǔn)非放大免疫測定不包括包含眾多檢測結(jié)合劑的檢測 載體?；蛘?，可實(shí)現(xiàn)在這些范圍內(nèi)的范圍。
[0121] 在某些實(shí)施方案中，檢測載體珠粒足夠大從而眾多結(jié)合劑分子可連接于珠粒。例 如,珠粒的尺寸范圍在直徑上可以為約0. 1至50,或0. 2至40,或0. 5至30,或1至20,或1 至15或約1至3μπι。當(dāng)待連接于珠粒的結(jié)合劑是抗體時(shí)，可使用商購可得的利用蛋白G、 蛋白Α或蛋白A/G預(yù)涂覆的珠粒，因?yàn)檫@些蛋白結(jié)合抗體的Fc結(jié)構(gòu)域，確定抗體方向以便 Fab結(jié)構(gòu)域自由而結(jié)合抗原的表位。
[0122] 如上所述，可添加與酶或熒光物質(zhì)（QD0TS?或其它熒光標(biāo)記物）復(fù)合的結(jié)合劑 (例如，識(shí)別檢測載體上的第二一抗的二抗）以結(jié)合檢測載體上用作檢測結(jié)合劑的大量抗 體。免疫化學(xué)（例如，ELISA)測定或適當(dāng)?shù)陌l(fā)射成像系統(tǒng)中熒光物質(zhì)的激發(fā)和顯影可用于 定量蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，由該方法提供的大信號(hào)放大因子的關(guān)鍵因素是可容納檢 測結(jié)合劑結(jié)合的檢測載體的巨大表面積。例如，對(duì)于抗體，可將約>10, 〇〇〇個(gè)和>100, 〇〇〇 個(gè)分子分別用于涂覆1 μ m和2. 8 μ m的珠粒。
[0123] 通過測流測定（LFA)檢測核糖體
[0124] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用側(cè)流測定（LFA)或免疫層析測定來檢測核糖體。這樣 的測定可以是快速的并且易于進(jìn)行，可在1小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生可視結(jié)果。在一個(gè)實(shí)施方案中，測定 可包括使用炭黑納米條形碼（CBNS)的超靈敏側(cè)流測定，其用作抗體-載體和結(jié)果讀出器 (Lonnberg 等人·，J. Immunol. Methods, 339:236_244 (2〇〇8))。
[0125] 例如，在某些實(shí)施方案中，側(cè)流測定可包括允許分子以單一方向流動(dòng)的固體載體。 在一個(gè)實(shí)施方案中，固體載體可包含具有比寬度更長的長度的測試條（圖10A)。測試條可 由膜（例如，硝酸纖維素膜或其它類型的吸收基底）和與膜接觸的吸收墊組成（圖10A)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，膜可包含具有來自第一物種（例如，兔）的識(shí)別目標(biāo)分析物（例如，核 糖體、核糖體蛋白、噬菌體蛋白）的抗核糖體抗體的測試線，和具有識(shí)別來自第一物種的抗 體的二抗（例如，山羊抗-兔抗體）的對(duì)照線。圖10A中還顯示了利用抗核糖體抗體302 涂覆的炭黑納米條形碼300。
[0126] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過將樣品施用于膜的底部（〃點(diǎn)樣區(qū)〃）（圖10B)，使樣品 通過毛細(xì)管作用流動(dòng)穿過圖10A中顯示的膜的表面來進(jìn)行測定。因此，樣品中存在的目標(biāo) 分析物可與測試線上的固定抗體（例如，對(duì)于核糖體分析物為抗核糖體抗體）相互作用并 結(jié)合所述抗體，而樣品中的其余材料將繼續(xù)進(jìn)入吸收墊。隨后可用利用也識(shí)別目標(biāo)分析物 (例如，兔抗核糖體抗體）的抗體（CBNS-Ab)預(yù)涂覆的炭黑納米條形碼溫育測試條。在一個(gè) 實(shí)施方案中，LFA測試條具有來自全血清IgG的抗體，而CBNS-Ab上的IgG利用目標(biāo)抗原來 親和純化。使CBNS-Ab復(fù)合物流過硝酸纖維素表面。這樣，CBNS-Ab復(fù)合物可與結(jié)合于測 試線的核糖體相互作用。該相互作用可被可視化為灰色至黑色的線（圖10B)。任何未結(jié) 合的CBNS-Ab可沿測試條繼續(xù)向上并結(jié)合于抗-兔對(duì)照線，這也導(dǎo)致灰色/黑色的線（圖 10B)。如果樣品不包含核糖體蛋白，則在測試線的位置上無線形成，但在對(duì)照線的位置上將 形成線。
[0127] 圖10C和10D顯示使用這樣的測流測定，利用用兔抗核糖體抗體涂覆的炭黑納米 條形碼對(duì)來自大腸桿菌的核糖體進(jìn)行的檢測。因此，圖10C顯示使用利用兔抗核糖體抗體 涂覆的CBNS進(jìn)行的10ng核糖體的檢測，以及核糖體在樣品中的存在（在測試線位置上觀 察到一條線）。對(duì)照中的線表明CBNS-Ab沿著測試條向上遷移。
[0128] 在某些實(shí)施方案中，CBNS-LFA系統(tǒng)的靈敏度可通過減少測試線的面積以將CBNS 濃縮至更小的區(qū)域中以增加線的強(qiáng)度來增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將結(jié)合已定位在測試 線上的CBNS-Ab的CBNS二抗復(fù)合物可用于進(jìn)一步增強(qiáng)信號(hào)的強(qiáng)度。第三方法可將酶例如 辣根過氧化物酶（HRP)整合入一抗-CBNS復(fù)合物或二抗-CBNS復(fù)合物，以便可將HRP底物 直接添加至測試條，以通過將底物轉(zhuǎn)化成有色產(chǎn)物來增強(qiáng)線的強(qiáng)度。此外和/或可選擇地， 可將CBNS上生物素化的抗體與結(jié)合于CBNS的可溶性鏈霉抗生物素蛋白-HRP(SA-HRP)或 SA-HRP結(jié)合用作增強(qiáng)信號(hào)的工具。圖10D顯示了這樣的實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)使用CBNS-生物素化 的抗核糖體抗體，并且通過CBNS-生物素化的抗核糖體抗體（頂部圖框）的可視化以及通 過添加與綴合于辣根過氧化物酶的鏈霉抗生物素蛋白復(fù)合的CBNS (SA-HRP-CBNS)，隨后添 加比色辣根過氧化物酶底物（下圖框）發(fā)展而來?？煽吹酵ㄟ^使用該方法，有可能檢測到 少至5ng的核糖體。
[0129] 通過感染因子提供的放大
[0130] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測樣品中的微生物的快速靈敏的方法，所 述方法包括：將樣品與游離的或結(jié)合至結(jié)合于固體載體的結(jié)合劑的感染因子接觸，其中感 染因子對(duì)于所述微生物是特異性的，從而可從樣品分離所述微生物。例如，在某些實(shí)施方案 中，目標(biāo)微生物是細(xì)菌，感染因子是一種或多種噬菌體?；蛘?，對(duì)于其它類型的微生物，可使 用其它感染因子。
[0131] 如上文中所述，噬菌體是附著于特定細(xì)菌并注射它們的遺傳物質(zhì)的病毒。噬菌體 因而使用細(xì)菌的機(jī)器將它們自已在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制100或數(shù)百次。一些噬菌體是裂解的，意 指它們使宿主細(xì)菌破裂，復(fù)制的噬菌體（子代）被釋放至環(huán)境中以搜尋出其它細(xì)菌并感染 它們。
[0132] 此外，大多數(shù)噬菌體對(duì)于特定細(xì)菌是特異性的，因?yàn)樘囟ㄊ删w的復(fù)制僅在特定 細(xì)菌中發(fā)生。因此，擴(kuò)增的噬菌體的存在表明了所述噬菌體特異性的細(xì)菌的存在。此外，由 于噬菌體可感染細(xì)菌并在短至1小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生子代噬菌體，因此檢測時(shí)間相較于 可培養(yǎng)細(xì)胞的檢測被顯著縮短。
[0133] 噬菌體是否已感染細(xì)菌可通過測定來確定，所述測定可鑒定噬菌體子代或噬菌體 標(biāo)志物、或在被親代噬菌體或子代噬菌體感染后被檢測的細(xì)菌標(biāo)志物的存在。在一個(gè)實(shí)施 方案中，測定不僅可鑒定噬菌體、噬菌體標(biāo)志物和/或細(xì)菌標(biāo)志物，而且還可確定噬菌體、 噬菌體標(biāo)志物或細(xì)菌標(biāo)志物的量或濃度。
[0134] 例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于細(xì)菌病原體的快速檢測和定量的超 靈敏的基于噬菌體的測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括用于檢測細(xì)菌的方法，包括步 驟：將至少一個(gè)細(xì)菌與樣品中的其它組分分離，和利用噬菌體感染所述至少一個(gè)細(xì)菌。該 方法還可包括除去大部分未被吸附的輸入噬菌體的步驟。該方法還可包括步驟：溫育感染 的細(xì)胞以促進(jìn)噬菌體復(fù)制和細(xì)胞裂來釋放子代噬菌體，和檢測子代噬菌體，或解離的子代 噬菌體的組分，其中噬菌體或噬菌體組分（即，噬菌體標(biāo)志物）的檢測表明細(xì)菌存在于樣品 中。該方法還可包括在檢測子代噬菌體之前除去剩余的輸入噬菌體。
[0135] 本文中描述的其它實(shí)施方案利用用可檢測部分標(biāo)記的子代噬菌體和/或細(xì)菌來 幫助檢測感染的細(xì)菌。例如，子代噬菌體可包含編碼可檢測生物分子例如螢光素酶蛋白的 基因。在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，子代噬菌體可通過感染包含標(biāo)志生物分子例如螢光素 酶蛋白的指示菌（例如，可使用包含編碼這樣的標(biāo)志生物分子的質(zhì)粒的細(xì)菌）來定量。
[0136] 指示菌用于測定（通過檢測裂解的指示細(xì)胞的子代噬菌體）樣品細(xì)胞的用途描述 于圖11中。因此，在該測定中，將用于感染目標(biāo)細(xì)菌樣品的親代噬菌體與子代噬菌體分離， 隨后將子代噬菌體用于感染經(jīng)工程化表達(dá)生物分子的指示菌，所述生物分子在細(xì)菌裂解后 提供可檢測信號(hào)。例如，可通過用編碼螢光素酶蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染來工程化細(xì)菌。
[0137] 例如，在這些實(shí)驗(yàn)中，生長指示細(xì)胞401(例如，表達(dá)螢光素酶蛋白的細(xì)菌）的培養(yǎng) 物。同時(shí)，將至少部分的包含待定量細(xì)菌的樣品400進(jìn)行旋轉(zhuǎn)過濾，以除去培養(yǎng)基，添加適 當(dāng)復(fù)數(shù)的生物素化噬菌體406 (例如，T4噬菌體）（可通過離心洗滌除去過量噬菌體406)， 使其溫育足夠長的時(shí)間以感染細(xì)菌和隨后裂解細(xì)菌以釋放子代噬菌體。隨后可例如通過離 心收集所得的裂解物411，將包含子代噬菌體和生物素化的親代噬菌體的濾液410轉(zhuǎn)移至 包含鏈霉抗生物素蛋白414的載體412 (例如，鏈霉抗生物素蛋白柱）以將剩余的生物素化 親代噬菌體與未被生物素化的子代噬菌體416分離。隨后，將產(chǎn)生可檢測部分403的指示細(xì) 胞401 (即，表達(dá)螢光素酶蛋白的細(xì)菌）添加至子代噬菌體416,使子代噬菌體感染細(xì)菌?？?將感染的指示細(xì)胞溫育足以產(chǎn)生另外的噬菌體和裂解發(fā)生的時(shí)間。隨后可使用照度計(jì)418 或其它適當(dāng)?shù)臋z測法（例如，對(duì)于熒光蛋白為熒光計(jì)）定量從感染的指示菌釋放的可檢測 部分403 (例如，螢光素酶）的水平。
[0138] 來自使用該測定的示例性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)示于圖12A-E中。
[0139] 圖12A-C顯示來自圖11中描述的方法的第一和第二半部分的單獨(dú)數(shù)據(jù)。圖12D 和12E顯示來自完整測定的數(shù)據(jù)。
[0140] 圖12A顯示少至1-2個(gè)大腸桿菌細(xì)胞可通過噬斑測定提供可測量的子代噬菌體的 噬斑形成單位（PFU)濃度（即，約300-460PFU)。y軸上靠近0PFU的點(diǎn)（達(dá)到約60PFU)可 能歸因于按隨機(jī)機(jī)率無細(xì)胞沉積在過濾器上，因?yàn)槊繕悠菲骄幸粋€(gè)細(xì)胞可能實(shí)際上具有 〇個(gè)細(xì)胞。
[0141] 圖12B顯示：噬菌體測試顯示對(duì)輸入樣品細(xì)胞的劑量依賴性反應(yīng)，子代噬菌體產(chǎn) 量增加，樣品中的細(xì)胞越多。圖12A和12B是針對(duì)從標(biāo)準(zhǔn)過夜集落形成單位（CFU)測定的 細(xì)胞濃度繪制的曲線，從而以可在8小時(shí)內(nèi)可視化的噬斑測定的固有更快速度顯示相似的 靈敏度。
[0142] 圖12C顯示通過使用該方法的第二半部分，使用圖11中概述的指數(shù)細(xì)胞的裂解進(jìn) 行的作為單個(gè)細(xì)胞（即，1〇〇個(gè)噬菌體）或27個(gè)細(xì)胞（S卩，2700個(gè)噬菌體）的等同物的噬 菌體檢測。這顯示，當(dāng)組合時(shí)，完全噬菌體測定應(yīng)當(dāng)能夠檢測每樣品少至1個(gè)細(xì)胞。
[0143] 圖12D顯示相較于標(biāo)準(zhǔn)CFU測定（虛線表示本底水平），對(duì)于1、5和7個(gè)樣品細(xì) 胞（例如，大腸桿菌）的檢測。圖12E顯示使用完全噬菌體測定（線表示本底水平）進(jìn)行 的每樣品100至10, 〇〇〇個(gè)細(xì)菌細(xì)胞（用顯微鏡測定的）的成功檢測。因此，對(duì)于無樣品稀 釋物，顯示了從1至10, 〇〇〇個(gè)細(xì)胞的靈敏度。除了這是一種快得多的測定（在大致3小時(shí) 內(nèi)進(jìn)行的）以外，這還比標(biāo)準(zhǔn)過夜CFU測定更靈敏1或2個(gè)數(shù)量級(jí)，其中在Petri培養(yǎng)皿上 超過500-700CFU不能被可靠地計(jì)數(shù)。
[0144] 同樣地，在一些實(shí)施方案中，測定可包括檢測從指示菌釋放的核糖體。在該形式 中，該測定從而可利用由子代噬菌體提供的放大，以及由存在于單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中的大量核 糖體提供的放大。
[0145] 使用指示噬菌體的策略示于圖13中。在該方法中，通過轉(zhuǎn)基因?qū)⑹删w衣殼蛋白 與螢光素酶融合，以便鏈霉抗生物素蛋白柱上的與生物素化的親代輸入噬菌體分離的子代 顆粒包含螢光素酶（或其它檢測部分）并且可被直接定量。
[0146] 如圖13中舉例說明的，在該方法中，將至少部分包含待定量的細(xì)菌502的樣品500 旋轉(zhuǎn)過濾以除去培養(yǎng)基，添加適當(dāng)量的具有與螢光素酶融合的衣殼蛋白（指示噬菌體）的 生物素化噬菌體504 (例如，T4噬菌體）（可通過離心洗滌除去過量噬菌體504)，使其余親 代噬菌體溫育足夠長的時(shí)間以感染細(xì)菌511和裂解所述細(xì)菌以釋放子代噬菌體。隨后可 例如通過離心收集所得的裂解物510,將包含子代噬菌體和親代噬菌體的濾液轉(zhuǎn)移至包含 鏈霉抗生物素蛋白414(例如，鏈霉抗生物素蛋白柱）的載體412以將生物素化的親代噬 菌體與未被生物素化的子代噬菌體516分離。隨后可使用照度計(jì)418定量在指示子代噬菌 體516上作為與Soc衣殼蛋白的融合蛋白存在和起作用的螢光素酶的水平。例如，每細(xì)胞 約100-200個(gè)子代噬菌體（每一個(gè)噬菌體包含約900個(gè)螢光素酶-衣殼蛋白拷貝）產(chǎn)生約 200, 000個(gè)螢光素酶拷貝。
[0147] 使用產(chǎn)生可溶性螢光素酶的指示噬菌體的策略示于圖14中。在該方法中，噬菌體 (例如，T4噬菌體）經(jīng)工程化在復(fù)制期間表達(dá)可溶性螢光素酶而不是衣殼蛋白-螢光素酶 融合蛋白。螢光素酶的表達(dá)由病毒衣殼蛋白啟動(dòng)子（例如，T4噬菌體中的Soc啟動(dòng)子）驅(qū) 動(dòng)，產(chǎn)生高表達(dá)。親代噬菌體將不含螢光素酶，這樣在測定中檢測到的任何螢光素酶必須來 自從細(xì)菌細(xì)胞釋放的子代噬菌體的復(fù)制。因此，不需要分離出親代噬菌體和子代噬菌體。
[0148] 在這些實(shí)驗(yàn)中，將至少部分的包含待定量細(xì)菌602的樣品600進(jìn)行旋轉(zhuǎn)過濾以除 去培養(yǎng)基，添加適當(dāng)量的表達(dá)螢光素酶而非Soc衣殼蛋白604的生物素化T4噬菌體。隨后 可以例如通過離心收集來自感染細(xì)菌611的濾液中的親代604和子代噬菌體616,使用照度 計(jì)418定量螢光素酶的水平。
[0149] 因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明利用由感染因子提供的高度特異性和由感染因 子的復(fù)制提供的放大作為工具來檢測存在于樣品中的低水平的微生物。例如，在一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明包括利用噬菌體的特異性從樣品分離細(xì)菌和/或利用由子代噬菌體提供的 放大來檢測樣品中的細(xì)菌的方法和系統(tǒng)。例如，對(duì)來自每一個(gè)感染細(xì)胞的200個(gè)子代噬菌 體的蛋白質(zhì)組分（例如，大腸桿菌的裂解噬菌體Τ4具有約2500個(gè)蛋白質(zhì)亞單位）的鑒定 可實(shí)現(xiàn)比依賴于單個(gè)可培養(yǎng)細(xì)胞的分離和鑒定的方法更大的放大。
[0150] 因此，本發(fā)明的實(shí)施方案包括使用超靈敏的基于噬菌體的測定快速檢測和定量細(xì) 菌病原體。例如，該方法可包括如下步驟：在細(xì)菌過濾器（例如，0.45 μ m的孔徑）上從樣 品濃縮細(xì)菌；用生物素化的噬菌體感染細(xì)菌；通過過濾器洗滌未被吸附的輸入噬菌體；溫 育感染的細(xì)胞以進(jìn)行噬菌體復(fù)制和細(xì)胞裂解；和通過使用鏈霉抗生物素蛋白純化（例如， 旋轉(zhuǎn)柱或其它固體載體）從裂解物除出剩余的輸入生物素化噬菌體。
[0151] 未被吸附的輸入噬菌體的高效取出對(duì)于定量噬菌體子代可以是不可或缺的。不能 除去或選擇性滅活未被吸附的輸入噬菌體可妨礙子代顆粒的定量，這在基于噬菌體的細(xì)菌 檢測法中一直是個(gè)主要障礙。樣品中的子代噬菌體可通過涂板和噬菌體計(jì)數(shù)（PFU測定）， 或通過使用指示細(xì)菌或指示噬菌體或本文中描述的高增益放大免疫測定來定量。子代噬菌 體的存在表明特異于噬菌體的細(xì)菌細(xì)胞存在于樣品中，子代噬菌體的不存在表明特異于噬 菌體的細(xì)菌細(xì)胞不存在于樣品中。
[0152] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法可包括將樣品與結(jié)合于固體載體的感染因子或其它 結(jié)合劑接觸（例如，結(jié)合于鏈霉抗生物素蛋白涂覆的磁珠的生物素化噬菌體），其中噬菌 體特異于細(xì)菌細(xì)胞；在對(duì)于固定在固體載體上的噬菌體感染細(xì)菌細(xì)胞有效的條件下溫育樣 品；分離感染的細(xì)胞-噬菌體-固體載體復(fù)合物；溫育以進(jìn)行噬菌體復(fù)制和細(xì)胞裂解，這導(dǎo) 致不結(jié)合于固體載體的子代噬菌體的釋放，從而可與用于感染細(xì)菌的輸入固定化噬菌體相 區(qū)別；除去附著了過量輸入噬菌體的固體載體和噬菌體-細(xì)胞包膜復(fù)合物；將裂解物通過 鏈霉抗生物素蛋白旋轉(zhuǎn)柱以消除任何剩余的輸入生物素化噬菌體；和通過本文中描述的方 法定量子代噬菌體。再次地，子代噬菌體的存在表明特異于噬菌體的細(xì)菌細(xì)胞存在于樣品 中，子代噬菌體的不存在表明特異于噬菌體的細(xì)菌細(xì)胞不存在于樣品中。
[0153] 為了檢測給定的細(xì)菌細(xì)胞，可選擇能夠感染細(xì)菌細(xì)胞，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并裂解 細(xì)菌細(xì)胞的噬菌體。對(duì)于任何給定的細(xì)菌細(xì)胞，可以例如從ATCC (約500種噬菌體）獲得 或通過從具有宿主細(xì)胞的天然來源分離來獲得眾多種噬菌體。噬菌體還應(yīng)當(dāng)顯示對(duì)于細(xì)菌 細(xì)胞的特異性。當(dāng)噬菌體感染給定的細(xì)菌細(xì)胞并且不感染其它種或株的細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，其對(duì) 于該細(xì)菌細(xì)胞是特異性的。為了檢測特定細(xì)菌細(xì)胞，還可優(yōu)選地選擇提供最佳或最大裂解 量的噬菌體。
[0154] 當(dāng)噬菌體用于分離細(xì)菌和/或放大細(xì)菌的檢測時(shí)，可由本發(fā)明檢測的細(xì)菌細(xì)胞的 范圍僅受限于特異于該細(xì)菌細(xì)胞的噬菌體的可獲得性，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來實(shí)現(xiàn)變 大。例如，可從ATCC獲得的噬菌體類型列表由它們以細(xì)菌和噬菌體的目錄公布，并且可在 地址為atcc. org的萬維網(wǎng)上獲得。其它這樣的保藏庫也在它們的的目錄中公布了等同物 的資料，這可用于鑒定用于本發(fā)明方法的可能的噬菌體試劑。
[0155] 細(xì)菌的噬菌體感染、噬菌體在細(xì)菌中的繁殖或擴(kuò)增以及細(xì)菌裂解的整個(gè)過程的總 反應(yīng)時(shí)間可花費(fèi)數(shù)十分鐘至數(shù)小時(shí)之間的任何時(shí)間，這取決于所述噬菌體和細(xì)菌以及環(huán)境 條件。一旦細(xì)菌被裂解，子代噬菌體以及細(xì)菌的所有內(nèi)容物被釋放入環(huán)境。子代噬菌體可 感染存在的的其它細(xì)菌，重復(fù)周期以產(chǎn)生更多噬菌體和更多細(xì)菌碎片。這樣，噬菌體的數(shù)目 將指數(shù)增加直至基本上不再有細(xì)菌被感染。
[0156] 噬菌體除了能夠在短時(shí)期內(nèi)產(chǎn)生大量子代外，還具有顯示特異性的能力。此外，噬 菌體復(fù)制意味著活的宿主細(xì)胞。在最佳感染和宿主生長培養(yǎng)基條件下，給定的噬菌體/細(xì) 菌組合產(chǎn)生恒定數(shù)目的噬菌體子代。一般而言，裂解性感染周期在約半小時(shí)至1小時(shí)內(nèi)從 單個(gè)感染的細(xì)胞產(chǎn)生100或更多個(gè)子代噬菌體顆粒。在測定內(nèi)，可能必需包括在相同培養(yǎng) 基中，利用已知數(shù)目的噬菌體感染已知數(shù)目的結(jié)合于基底的靶細(xì)胞進(jìn)行的對(duì)照比較標(biāo)準(zhǔn)。
[0157] 其它檢測測定
[0158] 從微生物分離的子代噬菌體和/或核糖體的存在還可通過本領(lǐng)域公知的其它方 法來測定。例如，子代噬菌體可通過常規(guī)噬斑測定法或通過自動(dòng)化技術(shù)，包括例如細(xì)胞分選 術(shù)例如熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS)來檢測。
[0159] 子代噬菌體還可通過直接可視化來檢測（Anderson等人，US2004/0137430,將其 公開內(nèi)容通過引用并入本文）。這樣的直接可視化可利用光學(xué)或熒光顯微鏡檢查。可使用 的染色或酶包括但不限于突光探針Alexa Fluor(可獲自Life Technologies/Molecular Probes, Grand Island, NY)、Cy3、異硫氰酸突光素、四甲基羅丹明、辣根過氧化物酶、堿 性磷酸酶、葡糖氧化酶或本領(lǐng)域已知的任何其它標(biāo)記物?；蛘?，可使用激光系統(tǒng)來檢測 標(biāo)記的噬菌體。其它檢測法包括腺苷酸激酶的檢測，參見Murphy等人.，pp. 320-322of Bioluminescence and Chemiluminesence in Medicine and Disease, Clinical Chemistry and Microbiology，和使用基于二項(xiàng)式的細(xì)菌冰核化檢測方法的檢測，參見Irwin等 人·，Journal of A0AC International 83:1087-95 (2000)。或者，對(duì)于一些實(shí)施方案，子 代噬菌體還可通過利用生物發(fā)光，檢測克隆入噬菌體基組（如圖12和13中概述的）的或 整合在指示菌中（如圖11中指示的）的螢光素酶基因的表達(dá)的方法來檢測。參見，例如， Loessner 等人，Applied and Environmental Microbiology 62 (4) : 1133-1140 (1996) 〇
[0160] 同樣地，由Life Technologies/Molecular Probes制造的量子點(diǎn)（在本文中也稱 為〃 QDOTS? )納米晶體可在本發(fā)明的方法中用于檢測免疫復(fù)合物，例如用于檢測從細(xì)菌 細(xì)胞釋放的核糖體蛋白或噬菌體蛋白。QD0TS?是顯示許多優(yōu)于常規(guī)熒光染料的有利特征 的納米級(jí)晶體。與熒光染料不同，QD0TS?納米晶體光漂白慢得多并且熒光亮得多。由于 不同尺寸的陣列是可獲得的，因此(JD0TS?納米晶體覆蓋更廣的光譜（即，不同尺寸發(fā)射 不同顏色），從而允許用于檢測相同樣品中不同的生物體。QD0TS?納米晶體是利用相同 的均一綴合化學(xué)法（uniform conjugational chemistry)制造的，從而在多種測定環(huán)境下 提供一致行為。目前，CP0TS⑩納米晶體可以以若干種不同的綴合物形式獲得，包括鏈霉 抗生物素蛋白、蛋白A和生物素。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，鏈霉抗生物素蛋白綴合物可 用于通過qD〇TS? -鏈霉抗生物素蛋白-生物素-抗體復(fù)合物使子代噬菌體或核糖體或它 們的組成蛋白發(fā)熒光，或可將qDOTS?直接綴合于抗體。鏈霉抗生物素蛋白綴合物極其明 亮，提供了優(yōu)良的光穩(wěn)定性，并且具有單個(gè)激發(fā)源。
[0161] 樣品
[0162] 本發(fā)明的方法和系統(tǒng)的每一個(gè)實(shí)施方案可允許快速檢測和定量樣品中的微生物。 例如，最優(yōu)選地可在約2小時(shí)或更短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的某些方法。
[0163] 通過本發(fā)明的方法和系統(tǒng)檢測的微生物包括在商業(yè)、醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上受到關(guān)注的 病原體。這樣的病原體包括革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌、支原體和病毒（僅病毒的蛋 白質(zhì)，因?yàn)椴《静痪哂泻颂求w）?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法檢測已鑒定到特異于特定微生物的結(jié) 合劑的任何微生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，除必需的特異性結(jié)合劑/微生物對(duì)的可獲得 性外，對(duì)于本方法的應(yīng)用沒有限制。
[0164] 可通過本發(fā)明檢測的細(xì)菌細(xì)胞包括但不限于為食品或水傳播的病原體的細(xì)菌細(xì) 胞。可通過本發(fā)明檢測的細(xì)菌細(xì)胞包括但不限于沙門菌屬的所有種、大腸桿菌的所有種，包 括但不限于大腸桿菌0157/H7,李斯特菌屬（Listeria)的所有種，包括但不限于單核細(xì)胞 增生李斯特菌（L. monocytogenes)以及彎曲桿菌屬（Campylobacter)的所有種：可通過本 發(fā)明檢測的細(xì)菌細(xì)胞包括但不限于為具有醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)重要性的病原體的細(xì)菌細(xì)胞。這樣 的病原體包括但不限于芽孢桿菌屬某些種（Bacillus spp.)、百日咳博特氏菌（Bordetella pertussis)、空腸彎曲菌（Camplyobacter jejuni)、肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae)、 產(chǎn)氣莢膜桿菌（Clostridium perfringens)、腸桿菌屬某些種（Enterobacter spp·)、肺炎 克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae)、肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae)、傷寒沙門菌 (Salmonella typhi)、宋氏志賀菌（Shigella sonnei)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)和鏈球菌屬某些種（Streptococcus spp)。
[0165] 樣品可以是環(huán)境或食品或水樣品以及醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)樣品。樣品可以是液體、固體 或半固體。樣品可以是固體表面的拭子。樣品可包括環(huán)境材料，例如水樣品，或來自空氣樣 品的過濾器或來自旋風(fēng)集成器的氣溶膠樣品。樣品可以是肉、家禽、加工食品、奶、乳酪或其 它乳制品。醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)樣品包括但不限于血液、痰、腦脊髓液以及糞便樣品和不同類型的 拭子。
[0166] 樣品可直接用于本發(fā)明的檢測方法，無需制備或稀釋。例如，可直接測定液體樣 品，包括但不限于奶和果汁?？蓪悠废♂層诨驊腋∮谌芤褐?，所述溶液可包括但不限于緩 沖溶液或細(xì)菌培養(yǎng)基?？赏ㄟ^在液體中切碎、混合或浸離固體而將作為固體或半固體的樣 品懸浮于液體中。應(yīng)當(dāng)將樣品保持在促進(jìn)噬菌體附著于宿主細(xì)菌細(xì)胞的pH范圍內(nèi)。樣品 還應(yīng)當(dāng)包含適當(dāng)濃度的二價(jià)和單價(jià)陽離子，包括但不限于Na+、Mg2+和K+。優(yōu)選地，在維持 樣品中包含的任何病原體細(xì)胞的活力的溫度下維持樣品。
[0167] 優(yōu)選地在整個(gè)檢測測定中，將樣品維持在保持存在于樣品中的任何病原體細(xì)胞的 活力的溫度下。在其中噬菌體附著于細(xì)菌細(xì)胞的步驟中，優(yōu)選在促進(jìn)噬菌體附著的溫度下 維持樣品。在其中噬菌體在感染的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制或裂解這樣的感染細(xì)胞的步驟中，優(yōu)選 在促進(jìn)噬菌體復(fù)制和宿主裂解的溫度下維持樣品。這樣的溫度為至少約25攝氏度（°C)， 更優(yōu)選不超過約45攝氏度，最優(yōu)選約37攝氏度。還優(yōu)選地，在噬菌體附著、復(fù)制和細(xì)胞裂 解過程中，將樣品經(jīng)歷溫和混合或搖動(dòng)。在其它實(shí)施方案中，可在感染后抑制噬菌體裝配， 以便噬菌體蛋白的亞單位積累而不被裝配，從而可提供子代噬菌體的額外放大。
[0168] 測定可包括各種適當(dāng)?shù)膶?duì)照樣品。例如，可將不包含噬菌體的對(duì)照樣品或包含噬 菌體但無細(xì)菌的對(duì)照樣品作為本底水平的對(duì)照來測定。
[0169] 基底
[0170] 待用于本方法的基底包括但不限于平面聚苯乙烯或磁珠 (Spherotech, Libertyville, IL ；Life Technologies/Invitrogen, Grand Island,NY ；Polyscience, Niles, FL；Thermo Scientific Pierce, Waltham MA ；EMD Millipore, Billerica, MA ;New England Biolabs, Ipswich, MA)，和平面或磁性二氧化娃珠 粒（AmsBio, Lake Forest, CA)、膠乳涂層、膜濾器、纖維濾器、不溶解纖維（free fiber)或多 孔固體基底。使用磁珠的方法可見于例如Dynabeads Protein G Prod. No. 10003D的包裝 說明書中，Kala 等人，Analytical Biochemistry 254:263-266(1997)和 Dutton, Genetic Engineering News,第 22 卷（13)，July 2002 中。
[0171] 一系列各種尺寸的顆粒，特別地磁性和聚苯乙烯珠粒是商購可得的。對(duì)于某些實(shí) 施方案，優(yōu)選的一組顆粒具有約1微米（即，1微米）的平均粒徑。對(duì)于某些實(shí)施方案，特別 地在凝集測定中，優(yōu)選的一組顆粒具有不超過20微米（即，微米）的平均粒徑（即，顆粒的 最大尺度）。
[0172] 對(duì)于某些實(shí)施方案，例如微生物、核糖體、噬菌體或它們的組分的回收，顆粒（例 如，珠粒）濃度優(yōu)選為至少i〇7毫升。對(duì)于某些實(shí)施方案，顆粒（例如，珠粒）濃度優(yōu)選不 大于10 9/暈升。
[0173] 對(duì)于某些實(shí)施方案，例如由核糖體、噬菌體或它們的組分進(jìn)行的顆粒凝集，顆粒 (例如，珠粒）的數(shù)目優(yōu)選為10至20 μ 1中至少300個(gè)顆粒和不超過3, 000個(gè)顆粒（例如， 珠粒）。在牽涉附著于珠粒的微生物或病毒的可視化的實(shí)施方案中，該顆粒數(shù)目（例如，珠 粒）允許在二維陣列中進(jìn)行光學(xué)顯微鏡評(píng)價(jià)而無堆疊。
[0174] 示例性商購可得的平面或磁珠包括利用蛋白G、蛋白Α、蛋白A/G、環(huán) 氧樹脂或鏈霉抗生物素蛋白（全都可從Invitrogen, Grand Island, ΝΥ或從 Spherotech, Libertyville, 111獲得）涂覆的聚苯乙烯珠粒。MagSi，具有相同涂層的磁性 二氧化娃珠粒，可獲自AmsBio, Lake Forest, CA。
[0175] 用于微生物檢測的系統(tǒng)
[0176] 本發(fā)明的實(shí)施方案還包括用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的系統(tǒng)（例如，試劑盒）。
[0177] 例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含用于檢測目標(biāo)微生物的組分的試劑盒， 所述組分包括：用于將微生物與樣品中的其它組分分離的組分；用于裂解微生物以釋放存 在于微生物中的核糖體的組分；和用于檢測核糖體或核糖體的組分的組分，其中核糖體或 核糖體的組分的檢測表明所述微生物存在于樣品中。
[0178] 可使用本發(fā)明的試劑盒檢測多種微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物包括細(xì)菌或 真菌或酵母中的至少一種。
[0179] 在一個(gè)實(shí)施方案中，分離微生物的組分包含識(shí)別微生物并與其結(jié)合的結(jié)合劑。可 將結(jié)合劑結(jié)合于固體載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合劑可以是抗體?；蛘?，當(dāng)微生物為細(xì)菌 時(shí)，結(jié)合劑可以為特異于所述細(xì)菌的噬菌體。
[0180] 在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可包含識(shí)別核糖體的一抗，和至少一種識(shí)別一抗的二 抗?；蛘?，試劑盒可包含識(shí)別核糖體的一抗，和至少一種識(shí)別核糖體的第二一抗。在某些實(shí) 施方案中，將第二一抗結(jié)合于固體載體。在其它實(shí)施方案中，固體載體包含多種第二一抗。
[0181] 在其它實(shí)施方案中，可使用側(cè)流測定檢測核糖體。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑 盒可包含含有抗核糖體抗體的固體載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可包含至少一種含有 另外的抗核糖體抗體的炭黑納米條形碼。
[0182] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括試劑盒，所述試劑盒包含用于檢測目標(biāo)微生物 的組分，其包括：用于將至少一種微生物與樣品中的其它組分分離的組分；用于利用多種 親代感染因子感染所述至少一種微生物的組分；用于裂解所述至少一種感染的微生物以釋 放存在于該微生物中的子代感染因子的組分；和用于檢測子代感染因子或子代感染因子的 組分的組分，其中感染因子或感染因子的組分的檢測表明所述微生物存在于樣品中。在一 個(gè)實(shí)施方案中，微生物是細(xì)菌，并且感染因子是噬菌體。
[0183] 試劑盒可包含多種用于檢測子代感染因子的組分。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，子代 感染因子（例如，噬菌體）可包含指示部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，子代感染因子中的指示部 分可包含融合于結(jié)構(gòu)蛋白（例如，噬菌體衣殼蛋白）的螢光素酶。在實(shí)施方案中，子代感染 因子（例如，噬菌體）中的指示部分可以是在復(fù)制過程中表達(dá)的可檢測部分，例如可溶性螢 光素酶蛋白。在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，試劑盒可包括指示微生物（例如細(xì)菌），其包含 當(dāng)被子代感染因子感染時(shí)在指示微生物裂解后釋放的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，從指示 微生物釋放的蛋白質(zhì)可包含可檢測部分。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，釋放的蛋白質(zhì)是螢光素 酶蛋白。在一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，試劑盒可包含組分，以便來自感染的樣品細(xì)胞和/或 指示細(xì)胞的子代感染因子可利用炭黑納米條形碼通過側(cè)流測定來檢測?；蛘撸瑥闹甘疚⑸?物釋放的蛋白可包括核糖體。這樣，試劑盒組合了通過噬菌體感染提供的放大與通過核糖 體檢測提供的放大。
[0184] 用于從樣品分離微生物的試劑盒
[0185] 本發(fā)明的試劑盒可包含用于從樣品分離細(xì)菌的試劑。
[0186] 例如，在某些實(shí)施方案中，試劑盒可包含特異于目標(biāo)微生物的抗體。在某些實(shí)施方 案中，抗體可包括可被第二結(jié)合劑識(shí)別的第一結(jié)合劑，以便可通過結(jié)合劑的相互作用分離 微生物。例如，在某些實(shí)施方案中，試劑盒可包括識(shí)別目標(biāo)微生物的生物素化抗體和鏈霉抗 生物素蛋白涂覆的珠粒。
[0187] 在可選擇的實(shí)施方案中，試劑盒可包含可連接于固定的結(jié)合劑（例如但不限于鏈 霉抗生物素蛋白、生物素、特異性結(jié)合噬菌體特或噬菌體亞結(jié)構(gòu)例如頭部的抗體）的特定 噬菌體。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接于噬菌體的試劑用于將噬菌體連接于固體載體。例如，在 一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可包含特異于目標(biāo)細(xì)菌的生物素化噬菌體。這樣，生物素化的噬菌 體可結(jié)合于鏈霉抗生物素蛋白磁性珠粒。在可選擇的實(shí)施方案中，可將噬菌體、噬菌體、分 枝桿菌噬菌體（例如對(duì)于TB和paraTB)、噬真菌體（例如對(duì)于真菌）、支原體噬菌體以及可 侵入活細(xì)菌、真菌、支原體、原生動(dòng)物、酵母和其它微觀活生物體的任何其它病毒偶聯(lián)于固 體載體，以用于分離目標(biāo)微生物。作為實(shí)例，詳盡研究的大腸桿菌的噬菌體包括T1、T2、T3、 Τ4、Τ5、Τ7和λ ;可在ATCC保藏庫中獲得的其它大腸桿菌噬菌體包括phiX174、S 13、0χ6、 MS2、phiVl、fd、PR772 和 ΖΙΚ1。
[0188] 用于微生物的基于核糖體的檢測的試劑盒
[0189] 在某些實(shí)施方案中，試劑盒可包含用于檢測來自目標(biāo)微生物的核糖體和/或核糖 體蛋白的試劑。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可包含在兔、小鼠、豚鼠等中例如針對(duì)大腸 桿菌或沙門菌屬某些種或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的純化核糖體產(chǎn)生的多克隆抗血清。
[0190] 用于檢測核糖體蛋白的LFA試劑盒可包括在測試線和對(duì)照線上含有適當(dāng)抗體的 樣品測試條。這樣的試劑盒還可包含結(jié)合于特異于目標(biāo)分析物的抗體的炭黑納米條形碼。 試劑盒還可包括電泳緩沖液和/或稀釋樣品所需的任何試劑或其它試劑。另外的試劑可包 括用作對(duì)照的材料和用于進(jìn)一步信號(hào)放大的試劑。例如，試劑盒可包括第二CBNS-Ab(即， 識(shí)別針對(duì)目標(biāo)分析物的一抗的二抗）。試劑盒還包括酶促檢測試劑例如辣根過氧化物酶 (HRP)和/或HRP底物。本發(fā)明的試劑盒中還可包括用于運(yùn)行測定的適當(dāng)尺寸的貯液池。
[0191] 用于微生物的基于噬菌體的檢測的試劑盒
[0192] 對(duì)于基于噬菌體的檢測技術(shù)，任何商購可得的噬菌體可用于產(chǎn)生用于本發(fā)明的試 劑盒的試劑。例如，ATCC在其細(xì)菌和噬菌體目錄中公布了一系列可從ATCC獲得的噬菌體 類型，并且可在地址為atcc. org的萬維網(wǎng)上或其它已知的保藏庫獲得。
[0193] 可通過許多本領(lǐng)域已知的方法之一將噬菌體固定在基底上。例如，特異于噬菌體 的抗體可用于將噬菌體連接于基底。蛋白A、蛋白G或配體例如抗生物素蛋白、鏈霉抗生物 素蛋白和生物素可用于將抗體連接于基底。共價(jià)連接法還可用于將噬菌體連接于基底。一 般而言，不應(yīng)當(dāng)使用對(duì)噬菌體尾部蛋白質(zhì)具有特異性的抗體，因?yàn)檫@樣的抗體對(duì)尾部蛋白 質(zhì)的結(jié)合會(huì)干擾噬菌體顆粒結(jié)合宿主細(xì)菌細(xì)胞的能力。
[0194] 本發(fā)明的試劑盒可包含含有檢測部分的細(xì)菌。這樣的細(xì)菌稱為"指示細(xì)菌"，其可 由也對(duì)與待檢測樣品細(xì)菌相同的噬菌體易感的細(xì)菌菌株組成。例如，野生型大腸桿菌菌株 B (ATCC)可被修飾來從DNA質(zhì)粒表達(dá)螢光素酶，或一些其它檢測部分。質(zhì)?？杀粡念^構(gòu)建或 基于商購可得的構(gòu)建體例如螢光素酶質(zhì)粒pGL. 4. 10 (螢火蟲螢光素酶）（Promega, Madison WI)和pGL. 4.70(海腎螢光素酶）來構(gòu)建?？砂?qū)動(dòng)檢測部分（例如螢光素酶）的表達(dá) 的組成型或病毒啟動(dòng)子的添加，連同本領(lǐng)域已知的其它共同DNA序列（抗生素抗性基因和 復(fù)制起點(diǎn)）。
[0195] 此外和/或可選擇地，本發(fā)明的試劑盒可包含〃指示噬菌體〃。指示噬菌體可由噬 菌體組成，它們的基因組經(jīng)修飾而包含用于表達(dá)共同檢測部分例如螢光素酶、綠色熒光蛋 白或辣根過氧化物酶的基因。這些基因可被整合入融合蛋白中的高拷貝數(shù)蛋白，例如T4中 的Soc-螢光素酶融合蛋白，或作為未被整合入噬菌體結(jié)構(gòu)、但在噬菌體感染細(xì)菌后表達(dá)的 可溶性蛋白。
[0196] 試劑盒還可包含用于濃縮待被噬菌體感染的細(xì)菌和/或?yàn)榧?xì)菌提供底物、隨 后洗漆的過濾器，例如〇.45μηι旋轉(zhuǎn)過濾器（Millipore, Billerica, MA)。試劑盒還可 包含鏈霉抗生物素蛋白親和柱，以用于分離生物素化的親代噬菌體與子代噬菌體（GE Healthcare, Little Chalfont，UK)。試劑盒還可包含與檢測部分例如D-螢光素或螢光素 酶測定基底（Promega，Madison，WI)(對(duì)于螢火蟲螢光素酶）或腔腸熒光素（對(duì)于海腎螢光 素酶）一起使用的底物。
[0197] 同樣地，用于檢測噬菌體蛋白的LFA試劑盒可包括在測試和對(duì)照線上包含適當(dāng) 抗體的樣品測試條。這樣的試劑盒還可包含結(jié)合于特異于目標(biāo)分析物的抗體的炭黑納米 條形碼。試劑盒還可包含電泳緩沖液和/或稀釋樣品所需的任何試劑或其它試劑。另外 的試劑可包括用作對(duì)照的材料和用于進(jìn)一步信號(hào)放大的試劑。例如，試劑盒可包括第二 CBNS-Ab (即，識(shí)別針對(duì)目標(biāo)分析物的一抗的二抗）。試劑盒還可包括酶促檢測試劑例如辣 根過氧化物酶（HRP)和/或HRP底物。用于運(yùn)行測定的適當(dāng)尺寸的貯液池也可被包含在本 發(fā)明的試劑盒中。
[0198] 免疫測定試劑盒
[0199] 在可選擇的實(shí)施方案中，試劑盒可包含用于基于珠粒的免疫測定的試劑。
[0200] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括用于測定目標(biāo)分析物的試劑盒，其包含檢測載 體，所述檢測載體包含含有眾多可識(shí)別目標(biāo)分析物并與其結(jié)合的結(jié)合劑分子的固體載體。 在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可包含捕獲載體，所述捕獲載體包含至少一種識(shí)別目標(biāo)分析物 并與其結(jié)合的捕獲載體結(jié)合劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還可包含可特異性識(shí)別檢測載 體上的眾多結(jié)合劑分子并與其結(jié)合的結(jié)合劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，可特異性識(shí)別檢測載體 上的眾多結(jié)合劑分子并與其結(jié)合的結(jié)合劑是可溶性結(jié)合劑。
[0201] 檢測和/或捕獲載體可包括多種形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲固體載體可以是 測定孔（即，例如微量滴定板）?；蛘?，捕獲固體載體可以是陣列上的位點(diǎn)，或可移動(dòng)載體例 如珠粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測載體是可移動(dòng)載體例如珠粒。
[0202] 眾多種結(jié)合劑可用于本發(fā)明的試劑盒。例如，眾多種連接于檢測載體的結(jié)合劑可 以是識(shí)別目標(biāo)分析物的抗體或抗體片段。此外和/或可選擇地，連接于捕獲載體的結(jié)合劑 可以是識(shí)別目標(biāo)分析物的抗體或抗體片段。此外和/或另外地，可特異性識(shí)別檢測載體上 的眾多結(jié)合劑分子并與其結(jié)合的結(jié)合劑可以是抗體或抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，可特 異性識(shí)別檢測載體上的眾多結(jié)合劑分子并與其結(jié)合的結(jié)合劑可以是不識(shí)別用于將目標(biāo)分 析物結(jié)合于捕獲固體載體的捕獲結(jié)合劑?；蛘?，捕獲或檢測載體的任一種上的結(jié)合劑或可 特異性識(shí)別檢測載體上的眾多結(jié)合劑分子并與其結(jié)合的結(jié)合劑可包括結(jié)合非蛋白質(zhì)靶的 蛋白（即，例如特異性結(jié)合目標(biāo)小分子分析物的蛋白，或結(jié)合蛋白的受體）。
[0203] 檢測載體可包含眾多可檢測部分。此外和/或可選擇地，可特異性識(shí)別檢測載體 上的眾多結(jié)合劑分子并與其結(jié)合的結(jié)合劑可包含可檢測部分。
[0204] 包含眾多識(shí)別目標(biāo)分析物的結(jié)合劑的檢測載體的使用提供了信號(hào)的放大。在可選 擇的實(shí)施方案中，檢測載體包含超過1，〇〇〇個(gè)，或超過10, 〇〇〇個(gè)，或超過100, 〇〇〇個(gè)，或超 過500, 000個(gè)，或超過1，000, 000個(gè)特異于目標(biāo)分析物的結(jié)合劑。因此，在可選擇的實(shí)施方 案中，本發(fā)明的試劑盒提供了為在標(biāo)準(zhǔn)非放大免疫測定（所述測定不包括包含眾多檢測結(jié) 合劑的檢測載體）中看到的信號(hào)的1，〇〇〇至1，〇〇〇, 〇〇〇, 〇〇〇倍，或1，〇〇〇至100, 〇〇〇, 〇〇〇 倍，或 5, 000 至 10, 000, 000 倍，或 10, 000 至 1，000, 000 倍，或 10, 000 倍變化至 500, 000 倍， 或50, 000至500, 000倍的放大?；蛘呖蓪?shí)現(xiàn)這些范圍內(nèi)的范圍。
[0205] 因此，在某些實(shí)施方案中，試劑盒可包含用于基于珠粒的免疫測定的試劑。因此， 在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測載體可包含利用識(shí)別目標(biāo)蛋白的抗體涂覆的珠粒。在某些實(shí)施方 案中，珠?？梢允抢玫鞍譍、蛋白A或蛋白A/G涂覆的聚苯乙烯珠粒，具有各種尺寸的所述 珠粒是商購可得的（例如，Invitrogen, Carlsbad CA)。可以是有用的其它珠粒包括利用這 些相同蛋白涂覆的磁性二氧化娃珠粒（來自AmsBio, Lake Forest, CA的MagSi珠粒）。
[0206] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可包含利用識(shí)別核糖體蛋白的抗體涂覆的珠粒。 或者，試劑盒可包含利用識(shí)別噬菌體蛋白的抗體涂覆的珠粒。珠粒可以是聚苯乙烯、二氧化 硅、玻璃或其它材料、平面或經(jīng)衍生用于連接特定化學(xué)基團(tuán)。
[0207] 用于本發(fā)明的試劑盒的基底包括但不限于聚苯乙烯珠粒 (Spherotech, Libertyville, 111.)、磁珠 （Invitrogen ;AmsBio)、膠乳涂層、膜濾器、纖維 濾器、不溶解纖維或多孔固體載體。
[0208] 使用磁珠的方法可見于例如Dynabeads Protein G Prod. No. 10003D的包裝說 明書中，Kala 等人，Analytical Biochemistry254:263-266 (1997)和 Dutton, Genetic Engineering News,第 22 卷，Number 13, July 2002 中。
[0209] 寬范圍尺寸的顆粒，特別地磁性和聚苯乙烯珠粒是商購可得的。對(duì)于某些實(shí)施 方案，優(yōu)選的一組顆粒具有約1微米（即，微米）的平均粒徑（即，顆粒的最大尺度）。對(duì) 于某些實(shí)施方案，優(yōu)選的一組顆粒具有不超過10微米（即，微米）的平均粒徑（即，顆 粒的最大尺度）。示例性商購可得的珠粒是蛋白G-、蛋白A-和蛋白A/G-涂覆的聚苯乙 烯珠粒和鏈霉抗生物素蛋白涂覆的聚苯乙烯珠粒，其可從Invitrogen, Carlsbad, CA或 Spherotech, Libertyville, 111獲得。聚苯乙烯和磁性珠粒的其它提供商包括Thermo Scientific Pierce, Millipore, Polyscience 和 New England Biolabs。AmsBio, Lake Forest, IL是磁性二氧化硅珠粒的提供商，具有所有上文中給定的蛋白質(zhì)涂層的所述磁性 二氧化娃珠粒都是可獲得的。Life Technologies/Invitrogen還提供共價(jià)地結(jié)合抗體的環(huán) 氧樹脂表面磁珠。
[0210] 珠粒上抗體分子的數(shù)目可變化。在可選擇的實(shí)施方案中，對(duì)于直徑約15 μ m的珠 ?？纱嬖诩s 10, 〇〇〇 至 10, 〇〇〇, 〇〇〇 個(gè)或約 50, 000 至 1，000, 000 個(gè)，或約 100, 000 至 500, 000 個(gè)抗體。對(duì)于不同尺寸的珠粒，可使用對(duì)應(yīng)的表面覆蓋度。
[0211] 在某些實(shí)施方案中，珠粒足夠大從而可將眾多抗核糖體抗體連接于珠粒。例如，珠 粒的尺寸范圍在直徑上可為約0. 1至50,或0. 2至40,或0. 5至30,或1至20,或1至15 或約1至3 μ m。為了將目標(biāo)抗體復(fù)合于珠粒，可用蛋白G、蛋白A、蛋白A/G或復(fù)合于目標(biāo)抗 體的另一種蛋白預(yù)涂覆珠粒。這樣的珠粒通常是商購可得的。用于基于珠粒的免疫測定的 試劑盒還可包含用于目標(biāo)蛋白的另外的一抗，其中這樣的抗體來自第二物種。這些抗體用 于本文中描述的夾心測定中，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合二抗-報(bào)道分子復(fù)合物，并且第二復(fù)合物不結(jié) 合固體表面上的第一物種抗體（這可導(dǎo)致假陽性反應(yīng)）。然而，第二物種抗體還可用于涂覆 固體表面和/或微量滴定孔，如本文中描述的。
[0212] 試劑盒還可包含可用于檢測一抗的二抗，其中這樣的抗體可以是來自第二物種的 抗球蛋白抗體。這些抗體可用可檢測標(biāo)志物或可與可檢測標(biāo)志物復(fù)合的結(jié)合劑來標(biāo)記。例 如，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒可包含結(jié)合于熒光基團(tuán)的二抗。在一個(gè)實(shí)施方案 中，突光基團(tuán)可包含QD0T?。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可將鏈霉抗生物素蛋白-QD0TS? 結(jié)合于識(shí)別例如抗核糖體一抗的生物素化二抗。 實(shí)施例
[0213] 本發(fā)明的實(shí)施方案還可通過下列非限定性實(shí)例來表征。
[0214] 實(shí)施例1 :純化的核糖體分離
[0215] 大腸桿菌獲自ATCC(#11303)并于37°C在LB培養(yǎng)基（Difco:10g胰蛋白胨、5g 酵母提取物、l〇g NaCl/L)中培養(yǎng)過夜。將菌落置于5mL LB培養(yǎng)基中，于37°C溫育過夜。 第二天，將培養(yǎng)物以1:100稀釋于新鮮LB中，使細(xì)胞生長至Klett 68的濃度（600nm處 的OD = 0· 8) (Summerson光電比色計(jì)上的20個(gè)Klett單位=分光光度計(jì)上540nm處的 〇. 10D)，所述濃度對(duì)應(yīng)于生長約3. 5小時(shí)后約4x 108個(gè)細(xì)胞/mL。隨后將細(xì)胞在Beckman Coulter XL 80K Type 19 轉(zhuǎn)子（Cat. No. 325632)中以 5, OOOrpm 沉淀 15 分鐘。將沉淀 重懸浮于 1 mL TMS(50mM Tris-HCl，pH 7.8，10mMMgCl2，100mM NaCl)和 1/10 體積的 10X Bugbuster (Novagen, PN70921-3)、0· 5mg/ml 溶菌酶（Sigma L6876)和 10 μ g/mL 高質(zhì)量 DNA 酶 I(不含 RNA 酶）（USB 14365)中。將裂解物在 Beckman Coulter Allegra64R F2402 轉(zhuǎn) 子中于1. 5mL微量離心管中以16, OOOrpm澄清lOmin。將上清液轉(zhuǎn)移至新微量離心管，重復(fù) 澄清步驟。在Beckman Coulter SW40Ti轉(zhuǎn)子中，將核糖體于TMS中在4°C以35, OOOrpm離 心3小時(shí)進(jìn)行沉淀，將沉淀重懸浮于0. 5ml TMS。將懸浮液澄清，隨后加載至TMS (BioComp GradientMaster，BioComp, New Brunswick, CA)中的 10-30% (w/v)鹿糖梯度上，在Beckman Coulter SW40Ti轉(zhuǎn)子中于4°C以35, OOOrpm離心3小時(shí)。通過在3mL注射器上使用21G x Γ針取出所得的核糖體條帶。如上所述，將核糖體再次沉淀，隨后將沉淀重懸浮于PBS或 TMS中。通過SDS-PAGE表征核糖體蛋白，利用EM負(fù)染色確認(rèn)顆粒的純度。
[0216] 實(shí)施例2 :在兔中進(jìn)行多克隆抗體的產(chǎn)生
[0217] 將如實(shí)施例1中所述分離的純化的核糖體與適當(dāng)?shù)淖魟┙M合。在幼兔 (2. 5-3. 0kg ;10-16周齡）的皮膚下注射核糖體和佐劑。利用19規(guī)針從兔耳中央動(dòng)脈收集 血液，讓血液凝固并在37°C收縮過夜。隨后將凝固的血液冷藏24小時(shí)，然后傾倒出血清，通 過以2500rpm離心20分鐘澄清血清。按照下列方案注射兔子和放血：
[0218] 第-4天：放血前
[0219] 第0天：使用CFA(完全弗氏佐劑）通過真皮內(nèi)（ID)途徑免疫
[0220] 第7天：使用IFA(不完全弗氏佐劑）通過真皮內(nèi)（ID)途徑加強(qiáng)注射
[0221] 第14天：使用IFA通過皮下（SC)途徑加強(qiáng)注射
[0222] 第28天：使用IFA通過皮下（SC)途徑加強(qiáng)注射
[0223] 第38天：測試放血
[0224] 第40天：將免疫前放血和測試放血運(yùn)至NGI
[0225] 第45天：最終放血（批準(zhǔn)的）
[0226] 第47天：將最終放血運(yùn)至NGI
[0227] 第49天：項(xiàng)目結(jié)束（批準(zhǔn)的）
[0228] 實(shí)施例3 :使用細(xì)胞特異性抗體和磁性微粒從溶液捕獲細(xì)菌
[0229] 為了證明從溶液中捕獲完整的活細(xì)菌細(xì)胞，產(chǎn)生針對(duì)不同細(xì)菌種（例如，大腸桿 菌和鼠傷寒沙門氏菌）的表面表位的兔多克隆抗體。
[0230] 將大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的培養(yǎng)物生長在液體培養(yǎng)基中，隨后收獲，用磷酸 鹽緩沖液（1. ImM KH2P04, 5. 6mM Na2HP04, 154mM NaCl，pH 7. 4)洗滌。隨后將洗滌的細(xì)胞稀 釋至 5-20 個(gè)細(xì)胞/ml 的濃度。將由 Rockland Immunochemicals Inc. , Gilbertsville, PA 產(chǎn)生的約250ng生物素化多克隆抗大腸桿菌抗體（等同于約lx 1012個(gè)抗體分子）添加至 細(xì)胞懸浮液，使其溫育45min。還進(jìn)行其中不將抗體添加至細(xì)胞懸浮液的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
[0231] 抗體溫育后，將4x 108個(gè)鏈霉抗生物素蛋白涂覆的磁性微粒（Solulink, Inc.，San Diego, CA)添加至混合物，并再溫育15min。隨后使用磁力座收集細(xì)胞-抗體-珠粒復(fù)合 物，除去未結(jié)合的級(jí)分（上清液），用磷酸鹽緩沖液（1. ImM KH2P04, 5. 6mM Na2HP04, 154mM NaCl，pH7.4)輕輕地洗滌珠粒。隨后將上清液（〃sup〃）和珠粒（〃bead〃）級(jí)分涂布在 Luria-Bertani(LB)瓊脂板上，在37°C溫育過夜。在過夜培養(yǎng)后，觀察板的菌落形成。圖2 描述了示例性實(shí)驗(yàn)；菌落計(jì)數(shù)示于每塊板的左/右下方。
[0232] 圖3A和3B顯示使用生物素化的抗核糖體IgG和連接于鏈霉抗生物素蛋白的磁 珠進(jìn)行的核糖體蛋白捕獲。圖3A顯示抗核糖體抗體和鏈霉抗生物素蛋白珠粒是必需的， 并且能夠定量地從溶液捕獲核糖體。在圖3A顯示的實(shí)驗(yàn)中，用不同量的生物素化兔抗核 糖體 IgG(由 Rockland Immunochemicals Inc.，Gilbertsville, PA 產(chǎn)生的）溫育 0·浦硫 氰酸胍 / 磷酸鹽緩沖鹽水和 Tween-20 (1. ImM KH2P04, 5. 6mM Na2HP04, 154mM NaCl, 0· 01 % 1'肌^11-20，？!17.4)中的來自100,000個(gè)細(xì)胞的裂解物1小時(shí)。還包括一個(gè)無裂解物 的對(duì)照。隨后，將3. 3x 107至lx 108個(gè)鏈霉抗生物素蛋白（SA)磁性Dynabead(Life Technologies, Carlsbad CA)添加至每一個(gè)反應(yīng)，以便抗體對(duì)珠粒的比率是恒定的，為6000 個(gè)抗體分子/珠粒顆粒。將約5x 107個(gè)SA珠粒添加至〃無抗體〃對(duì)照。
[0233] 使用磁力座收集珠粒，隨后通過添加含有β _疏基乙醇的十-燒基硫酸納樣品緩 沖液并且煮沸來使其變性。隨后使用磁力座收集洗脫液，在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，隨后 經(jīng)歷使用兔抗核糖體抗體和抗-兔辣根過氧化物酶（HRP)二抗的Western印跡分析?？?看到當(dāng)未添加抗核糖體抗體時(shí)，未檢測到核糖體蛋白。還可看到，50ng抗體能夠結(jié)合來自 100, 000個(gè)細(xì)胞的所有核糖體蛋白。
[0234] 在圖3A中，Ponceau行提供內(nèi)部對(duì)照以顯示樣品被加載在所有孔中，因?yàn)镻onceau 是用于顯現(xiàn)存在于Western印跡膜上的蛋白質(zhì)的總蛋白染色。SA行顯示在變性/煮沸步驟 中從SA Dynabead取出的鏈霉抗生物素蛋白?？煽吹酱笾碌攘康闹榱１挥糜诿恳粋€(gè)核糖體 捕獲步驟中。
[0235] 圖3B顯示生物素、抗核糖體抗體和鏈霉抗生物素蛋白珠粒的添加足以捕獲存在 于溶液中的所有核糖體蛋白。在本實(shí)驗(yàn)中，用或不用200ng生物素化的兔抗核糖體IgG溫 育0. 6M硫氰酸胍/磷酸鹽緩沖鹽水和Tween-20中的來自270, 000個(gè)細(xì)胞的裂解物。隨 后，添加 lx 108個(gè)SA磁珠以捕獲Ab-核糖體蛋白復(fù)合物（每珠粒8000個(gè)抗體分子）。從 珠粒級(jí)分取出未結(jié)合的上清液，使用200ng生物素、抗體和lx 108個(gè)SA磁性珠粒進(jìn)行再捕 獲（"recapt")。使收集的珠粒變性，隨后經(jīng)歷使用兔抗核糖體抗體和抗-兔辣根過氧化物 酶（HRP)二抗的Western印跡分析。在利用其中核糖體蛋白先前已被捕獲的裂解物的再捕 獲實(shí)驗(yàn)中核糖體蛋白的不存在表明第一捕獲步驟足以捕獲所有核糖體蛋白。
[0236] 實(shí)施例4 :使用珠粒放大的不同形式捕獲核糖體
[0237] 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以比較圖8、圖框A-C和F(S卩，方法la、lb、2、3和6)中描述的各種測定 形式?；旧?，通過在6M(10, 000個(gè)細(xì)胞/μ 1)硫氰酸胍中裂解細(xì)菌細(xì)胞來制備大腸桿菌 裂解物（500, 000個(gè)細(xì)胞）。隨后通過稀釋入磷酸鹽緩沖液（例如，90, 000個(gè)細(xì)胞至450 μ 1 中的稀釋）將硫氰酸胍濃度降至〇. 12或0. 6Μ。隨后使用圖8中顯示的核糖體捕獲方法之 一捕獲核糖體（表1)。
[0238]
【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測目標(biāo)微生物的方法，所述方法包括如下步驟： 將所述微生物與樣品中的其它組分分離； 裂解所述微生物以釋放存在于所述微生物中的核糖體；和 檢測核糖體或核糖體的組分，其中所述核糖體或核糖體的組分的檢測表明所述微生物 存在于所述樣品中。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物包含細(xì)菌或真菌或酵母中的至少一種。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中分離所述微生物的步驟包括將所述微生物結(jié)合于結(jié)合劑。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中分離所述微生物的步驟包括將所述微生物結(jié)合至結(jié)合于固 體載體的結(jié)合劑。
5. 權(quán)利要求4的方法，所述結(jié)合劑是特異于所述微生物的抗體。
6. 權(quán)利要求4的方法，其中所述微生物是細(xì)菌，并且所述結(jié)合劑是特異于所述細(xì)菌的 噬菌體。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述核糖體的檢測包括使用識(shí)別所述核糖體的一抗和也識(shí) 別所述核糖體的至少一種第二一抗。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述第二一抗結(jié)合于固體載體。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述固體載體包含眾多第二一抗。
10. 權(quán)利要求1的方法，其中將所述核糖體施用于包含抗核糖體抗體的固體載體，和通 過將所述核糖體流過載體的表面來進(jìn)行檢測。
11. 權(quán)利要求9的方法，其中使用包含第二組抗核糖體抗體的至少一種炭黑納米條形 碼顯現(xiàn)結(jié)合于包含抗核糖體抗體的固體載體的核糖體。
12. -種用于檢測目標(biāo)細(xì)菌的方法，其包括步驟： 將至少一個(gè)細(xì)菌與樣品中的其它組分分離； 用眾多親代噬菌體感染所述至少一個(gè)細(xì)菌； 裂解所述至少一個(gè)感染的細(xì)菌以釋放存在于所述細(xì)菌中的子代噬菌體；和 檢測所述子代噬菌體，或子代噬菌體的組分，其中所述噬菌體或噬菌體的組分的檢測 表明所述細(xì)菌存在于所述樣品中。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中將所述親代噬菌體與子代噬菌體分離。
14. 權(quán)利要求12的方法，其中所述子代噬菌體包含指示劑部分。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述指不劑部分包括融合于噬菌體衣殼蛋白的螢光素 酶。
16. 權(quán)利要求14的方法，其中所述指示劑部分包含可溶性螢光素酶蛋白。
17. 權(quán)利要求12的方法，還包括用子代噬菌體感染指示劑細(xì)菌的步驟，其中所述指示 劑細(xì)菌包含在所述指示劑細(xì)菌裂解后釋放的蛋白質(zhì)。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含可檢測部分。
19. 權(quán)利要求17的方法，其中所述蛋白質(zhì)包含核糖體亞單位。
20. -種包含用于檢測目標(biāo)微生物的組分的試劑盒，其包含：用于將所述微生物與樣 品中的其它組分分離的組分；用于裂解所述微生物以釋放存在于所述微生物中的核糖體的 組分；和 用于檢測核糖體或核糖體的組分的組分，其中所述核糖體或核糖體的組分的檢測表明 所述微生物存在于樣品中。
21. -種包含用于檢測目標(biāo)微生物的組分的試劑盒，其包含：用于將至少一個(gè)目標(biāo)微 生物與樣品中的其它組分分離的組分； 用于利用眾多親代感染因子感染所述至少一個(gè)目標(biāo)微生物的組分； 用于裂解所述至少一個(gè)感染的微生物以釋放存在于所述微生物中的子代感染因子的 組分；和用于檢測所述子代感染因子或子代感染因子的組分的組分，其中所述感染因子或 所述感染因子的組分的檢測表明所述微生物存在于樣品中。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104245961SQ201380019483
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月21日
【發(fā)明者】D·L·安德森, A·J·肯拉德, S·E·埃里克森, J·S·吉爾, B·B·霍普金斯 申請人:美國控股實(shí)驗(yàn)室公司