能夠產(chǎn)生l-氨基酸的微生物及使用其產(chǎn)生l-氨基酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的微生物，并且涉及通過使用其產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的方法。更具體地，本發(fā)明涉及：重組大腸桿菌(Escherichia?coli)，其通過提高產(chǎn)生ATP的能力更加有效地產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸，所述ATP在產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸時(shí)用作細(xì)胞中最豐富的能量來源；以及通過使用所述重組大腸桿菌產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的方法。
【專利說明】能夠產(chǎn)生L-氨基酸的微生物及使用其產(chǎn)生L-氨基酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的微生物以及使用其產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]已知通過發(fā)酵產(chǎn)生有用產(chǎn)物的微生物在增強(qiáng)生物合成途徑時(shí)需要非常大量的能量，例如ATP。
[0003]如本領(lǐng)域中已知的，在微生物代謝過程中，通過分解代謝反應(yīng)產(chǎn)生的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD(H))與用于合成代謝反應(yīng)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP(H)之間的細(xì)胞內(nèi)平衡是非常重要的。NAD(H)是通過食物氧化產(chǎn)生ATP的分解代謝反應(yīng)的中間體并作為能量來源起作用。并且NADP(H)在提供體內(nèi)代謝過程中的還原力中發(fā)揮作用，即通過與通常催化合成代謝反應(yīng)的酶進(jìn)行反應(yīng)來提供合成分子所需的高能電子。其之間的平衡通過如以下反應(yīng)式I)所示的NAD磷酸化或者通過如以下反應(yīng)式2)所示的NADP去磷酸化來調(diào)節(jié)。
[0004]反應(yīng)式I)
[0005]NAD++ATP O* NADP++ADP
[0006]反應(yīng)式2)
[0007]NADP+ O NAD++ 磷酸
[0008]因此，為了有效地產(chǎn)生還原力(例如NADPH)，應(yīng)一同增加磷酸源，例如ATP。
[0009]ATP (腺苷- 5’ -三磷酸)具有高能磷酸鍵，并且當(dāng)其水解為ADP和磷酸時(shí)產(chǎn)生能量。ATP主要通過經(jīng)由微生物的電子傳遞系統(tǒng)進(jìn)行的化學(xué)滲透磷酸化或者通過底物水平磷酸化產(chǎn)生。所產(chǎn)生的ATP降解以提供細(xì)胞所需的能量并且通過糖酵解途徑或氧化磷酸化再生而被重復(fù)使用。
[0010]基于該事實(shí)，已經(jīng)進(jìn)行了研究以將細(xì)菌的ATP能量再生過程用于大量產(chǎn)生有用產(chǎn)物，從而有助于能量供應(yīng)(B1sci B1technol B1chem.，(1997)61:840-845)。在關(guān)于大腸桿菌(E.coli)中ATP再生的研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)少數(shù)基因，包括ysaA(NCBI Gene ID:948085)、ydaS(NCBI Gene ID:945923)和 ybiX(NCBI Gene ID:947502)基因分別缺陷時(shí)，微生物中的ATP水平比親本菌株中的ATP水平高約150%，并且將該發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于產(chǎn)生谷胱甘肽(FEMSMicrob1l Lett., (2009)297:217-224)。然而，沒有直接的報(bào)道直接地解釋由通過所述基因所編碼的蛋白質(zhì)活性弱化引起的氨基酸產(chǎn)量增加。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]技術(shù)問題
[0012]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，提高ATP (其用作產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)胞中最豐富的能量來源)的細(xì)胞內(nèi)水平有效地增加了 L-蘇氨酸或L-色氨酸的產(chǎn)量,從而完成本發(fā)明。
[0013]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組大腸桿菌菌株，其通過提高ATP的生產(chǎn)力而具有提高的L-蘇氨酸或L-色氨酸生產(chǎn)力。
[0014]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供使用所述重組大腸桿菌菌株來產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的方法。
[0015]技術(shù)方案
[0016]為了完成上述目的，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的重組大腸桿菌菌株，其中所述菌株被修飾以弱化(使其變?nèi)?選自以下的至少一種蛋白質(zhì)的活性:具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)YsaA、具有由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)YdaS和具有由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)YbiX。
[0017]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案還提供了用于產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的方法，其包括培養(yǎng)所述重組大腸桿菌菌株。
[0018]有利效果
[0019]本發(fā)明提供了一種重組微生物，其L-蘇氨酸或L-色氨酸生產(chǎn)力通過提高具有L-蘇氨酸或L-色氨酸生產(chǎn)力的微生物中的細(xì)胞內(nèi)ATP水平來提高。根據(jù)本發(fā)明，其提供了通過恢復(fù)能量代謝平衡以提高細(xì)胞活性并減少培養(yǎng)時(shí)間來提高L-蘇氨酸或L-色氨酸的產(chǎn)量的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1示出了產(chǎn)生L-蘇氨酸的菌株相對(duì)于其親本菌株的相對(duì)ATP水平(％ )。
[0021]圖2示出了產(chǎn)生L-色氨酸的菌株相對(duì)于其親本菌株的相對(duì)ATP水平(％)。
[0022]最佳模式
[0023]在下文中，將詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0024]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的重組大腸桿菌菌株，其中所述菌株被修飾以弱化選自以下的至少一種蛋白質(zhì)的活性:具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)YsaA、具有由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)YdaS和具有由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)YbiX。
[0025]可用于本發(fā)明的產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的微生物可以是能夠產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的任何微生物,例如埃希氏菌屬細(xì)菌(Escherichia sp.Bacterium)、大腸桿菌、棒狀桿菌細(xì)菌(Coryneform bacterium)、沙雷菌氏屬細(xì)菌(Serratia sp.bacterium)、普羅威登斯菌屬細(xì)菌(Providencia sp.Bacterium)等。特別地,可使用屬于埃希氏菌屬的微生物。
[0026]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用具有L-色氨酸生產(chǎn)力的重組大腸桿菌菌株CJ600(KCCM 10812P)(韓國專利注冊號(hào)10-0792095)，其通過基因工程改造具有L-苯丙氨酸生產(chǎn)力的重組大腸桿菌菌株(KFCC10066)從而使色氨酸營養(yǎng)缺陷型脫敏，阻斷L-苯丙氨酸生物合成并增強(qiáng)色氨酸生物合成相關(guān)基因來獲得。
[0027]在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用具有L-蘇氨酸生產(chǎn)力的重組大腸桿菌菌株FTR2533(KCCM-10541)(韓國專利注冊號(hào)10-0576342)，其通過基因工程改造具有L-蘇氨酸生產(chǎn)力的大腸桿菌突變菌株(KFCC10718)從而使野生型galR基因失活來獲得。
[0028]YsaA(具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì))被預(yù)測為具有4Fe_4S鐵氧化還原蛋白型組分的氫化酶，但是尚未發(fā)現(xiàn)其確切功能。
[0029]YdaS (具有由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì))被預(yù)測為DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，但是尚未發(fā)現(xiàn)其確切功能。
[0030]YbiX(具有由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì))是Fe (II)依賴性加氧酶超家族的一種，其作為使用氧來氧化其底物的氧化還原酶起作用。
[0031]本發(fā)明的多肽YsaA、YdaS和YbiX分別具有由SEQ ID NO:2、4和6表示的氨基酸序列，但不限于此，因?yàn)樗龅鞍踪|(zhì)的氨基酸序列可取決于微生物的物種或菌株。
[0032]換言之，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是編碼具有以下氨基酸序列的蛋白質(zhì)的突變體或人工變體，所述氨基酸序列包括由SEQ ID NO:2、4和6表示的氨基酸序列的一個(gè)或更多個(gè)位置中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的替換、缺失、插入、添加或倒位，只要所述突變體或人工變體可通過弱化本發(fā)明中所描述的活性而有助于增加氨基酸的產(chǎn)量。本文中，“幾個(gè)”氨基酸的數(shù)量根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或類型而不同，但特別地為2至20個(gè)，特別地為2至10個(gè)，并且更特別地為2至5個(gè)。此外，氨基酸的這種替換、缺失、插入、添加或倒位還包括由基于具有多肽活性的微生物個(gè)體或物種差異的天然存在突變或人工改變所引起的那些變化。
[0033]本文所使用的術(shù)語“弱化”是指通過使編碼蛋白質(zhì)的基因部分或全部缺失，或者通過修飾表達(dá)調(diào)控序列以減少基因的表達(dá)，或者通過修飾染色體基因序列以使蛋白質(zhì)的活性變?nèi)?，或者通過其組合來使蛋白質(zhì)的活性變?nèi)酢?br> [0034]在本發(fā)明中，可通過選自以下的方法來實(shí)現(xiàn)活性的弱化:1)使編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸部分或全部缺失；2)修飾表達(dá)調(diào)控序列以減少多核苷酸的表達(dá)；3)修飾染色體多核苷酸序列以使蛋白質(zhì)的活性變?nèi)酰灰约?)其組合。
[0035]可通過用核酸序列部分缺失的多核苷酸或通過染色體插入載體的標(biāo)記基因來替換染色體中編碼內(nèi)源靶蛋白的多核苷酸來進(jìn)行用于使編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸部分或全部缺失的方法。
[0036]在本文中，術(shù)語核酸序列的“部分”根據(jù)基因的種類而不同，但是與其位置無關(guān)，并且其特別地為I至200，更特別地為I至100，甚至更特別地為I至50。
[0037]此外，可通過由一個(gè)或更多個(gè)核苷酸的缺失、插入、非保守或保守替換或者其組合在表達(dá)調(diào)控序列中誘導(dǎo)突變以弱化所述表達(dá)調(diào)控序列的活性，或者通過用較弱活性的序列替換所述表達(dá)調(diào)控序列來進(jìn)行修飾表達(dá)調(diào)控序列以減少多核苷酸表達(dá)的方法。所述表達(dá)調(diào)控序列包括啟動(dòng)子、操縱子序列、編碼核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。
[0038]此外，可通過由一個(gè)或更多個(gè)核苷酸的缺失、插入、非保守或保守替換或者其組合在序列中誘導(dǎo)突變以弱化所述序列的活性，或者通過用具有較弱活性的經(jīng)修飾的核苷酸序列替換所述序列來進(jìn)行本發(fā)明的修飾編碼蛋白質(zhì)的染色體多核苷酸序列的方法。
[0039]可將本發(fā)明的編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸引入宿主細(xì)胞中并且可用難以在宿主中表達(dá)的密碼子來替換。此外，可延長其N-端或C-端或使其缺失，并且可修飾起始密碼子以調(diào)控表達(dá)水平。
[0040] 本發(fā)明多核苷酸中的每一個(gè)都可具有編碼以下蛋白質(zhì)的多核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)與由SEQ ID NO:2、4和6表示的各個(gè)氨基酸序列具有至少80%，特別地至少90%，更特別地至少95%，并且甚至更特別地至少97%的同源性，只要所述多核苷酸可弱化變體的蛋白質(zhì)活性。更特別地，所述多核苷酸具有分別由SEQ ID NO:1、3和5表示的多核苷酸序列。[0041 ] 如本文所使用的術(shù)語“同源性”是指兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性。可使用公知的方法來測定同源性，例如計(jì)算諸如分?jǐn)?shù)、同一性和相似性的參數(shù)的計(jì)算機(jī)程序BLAST 2.0。
[0042]此外，可將本發(fā)明的多核苷酸序列與由SEQ ID NO:1、3和5表示的多核苷酸序列以及在嚴(yán)格條件下由上述核苷酸序列產(chǎn)生的探針雜交，并且可以是編碼正常功能蛋白質(zhì)的經(jīng)修飾的序列。
[0043]如本文所使用的術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指允許多核苷酸之間特異性雜交的條件?；蛘?，所述術(shù)語涉及多核苷酸或蛋白質(zhì)，包括其衍生物(Molecular Cloning, A LaboratoryManual, J.Sambrook 等編，第二版， Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold SpringHarbor ;New York, 1989 ;或者 Current Protocols in Molecular B1logy, F.M.Ausubel等編，John Wiley &Sons, Inc.，New York)。
[0044]具體地，“嚴(yán)格條件”是指在65°C下在雜交緩沖液(3.5XSSC,0.02% Ficoll,0.02%聚乙烯吡咯烷酮，0.02%牛血清白蛋白，2.5mM NaH2PO4(pH 7) ,0.5% SDS,2mM EDTA)中雜交。SSC是pH 7的0.15M氯化鈉/0.15M檸檬酸鈉。在雜交之后，在室溫下在2 X SSC中，然后在68 °C下在0.1至0.5XSSC/0.1XSDS中洗滌DNA轉(zhuǎn)移到其上的膜。
[0045]如本文所使用的術(shù)語“載體”是指這樣的DNA構(gòu)建體，其包含與合適的調(diào)控序列可操作地連接的靶蛋白編碼基因的核苷酸序列，以便能夠在合適宿主細(xì)胞中表達(dá)靶基因。調(diào)控序列包括能夠起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、用于調(diào)控該轉(zhuǎn)錄的任何操縱子、編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列以及用于調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。一旦轉(zhuǎn)化到合適的宿主中，載體可復(fù)制或獨(dú)立在宿主基因組起作用，或者在一些情況下可整合到基因組本身中。
[0046]用于本發(fā)明的載體沒有特別限制并且可以是本領(lǐng)域已知的任何載體，只要其可在宿主中復(fù)制。常用載體的實(shí)例可包括天然質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒、粘粒、病毒和細(xì)菌噬菌體。例如，噬菌體載體或粘粒載體包括 pWE15、M13、ABL3, λ BL4、λ XI1、λ SHII, λ PU、λ 10、λ 11、Charon4A 和 Charon21A,并且質(zhì)粒載體包括 pBR、pUC、pBluescriptll、pGEM、pTZ、pCL 和PET-型質(zhì)粒?？墒褂玫妮d體沒有特別限制，并且可使用任何已知的表達(dá)載體。具體地，可使用 pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118 或 pCClBAC 載體。最具體地，可使用pACYC177、pCL和pCClBAC載體。
[0047]此外，用于本發(fā)明的載體是能夠轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，從而將編碼靶蛋白的多核苷酸插入所述宿主細(xì)胞染色體中的載體。載體的具體實(shí)例包括但不限于:在大腸桿菌和棍棒型細(xì)菌(Coryne-type bacteria)中可在兩個(gè)方向上自主復(fù)制的穿梭載體pECCG112 (Kap-Soo,Noh, Kor.Jour.Microb1l.1991 年 7 月，第 149-154 頁)。
[0048]此外，可通過用于插入細(xì)菌染色體的載體來用新的多核苷酸替換染色體中編碼內(nèi)源靶蛋白的多核苷酸?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法(例如，同源重組)將多核苷酸插入染色體中。因?yàn)榭赏ㄟ^同源重組將本發(fā)明載體插入染色體中，所以其還可包含用于確認(rèn)其插入染色體中的選擇標(biāo)記。所述選擇標(biāo)記用來選擇經(jīng)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即用來確認(rèn)靶多核苷酸的插入。用于本發(fā)明的選擇標(biāo)記可選自提供可選擇表型例如藥物抗性、營養(yǎng)缺陷型、細(xì)胞毒性試劑抗性或表面蛋白表達(dá)的標(biāo)記。在用選擇性試劑處理的環(huán)境下，只有表達(dá)選擇標(biāo)記的細(xì)胞能夠存活或示出不同的表型，從而可選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
[0049]如本文所使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”意為將包含編碼靶蛋白的多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞中以便能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)由多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。經(jīng)轉(zhuǎn)化的多核苷酸包括插入宿主細(xì)胞染色體中或位于染色體外的所有基因，只要其可在宿主細(xì)胞中表達(dá)。此外，多核苷酸包括DNA和RNA，其編碼靶蛋白。只要可將多核苷酸引入宿主細(xì)胞中并使其在那里表達(dá)，可以以任何形式引入所述基因。
[0050]例如，多核苷酸可以以表達(dá)盒的形式引入宿主細(xì)胞中，所述表達(dá)盒是包含用于表達(dá)基因的所有元件的多核苷酸構(gòu)建體。所述表達(dá)盒包含與所述基因可操作地連接的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和翻譯終止信號(hào)。所述表達(dá)盒可以是能夠自主復(fù)制的表達(dá)載體的形式。多核苷酸也可通過自身引入宿主細(xì)胞中，并且可與宿主細(xì)胞中表達(dá)所必需的序列可操作地連接。
[0051]具體地，弱化由ysaA、ydaS或ybiX基因編碼的蛋白質(zhì)的活性可通過使所述基因缺失來弱化。具體地，可使用化學(xué)品或光(例如UV光)誘導(dǎo)基因突變，從而獲得具有缺失基因的變體?；蛘?，可通過基因重組技術(shù)將染色體基因替換為缺乏活性的核苷酸，通過經(jīng)同源重組進(jìn)行基因置換的方法獲得缺乏蛋白質(zhì)活性的變體。
[0052]此外，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案還提供了用于產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的方法，所述方法包括培養(yǎng)產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的重組大腸桿菌菌株，其中所述菌株被修飾以弱化選自以下的至少一種蛋白質(zhì)的活性:具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)YsaA、具有由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)YdaS和具有由SEQ ID N0:6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)YbiX。
[0053]本發(fā)明的培養(yǎng)方法可在本領(lǐng)域已知的合適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件中進(jìn)行。本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員可根據(jù)所選擇的菌株類型容易地對(duì)該培養(yǎng)方法進(jìn)行修改。培養(yǎng)方法的實(shí)例包括但不限于:分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和分批補(bǔ)料培養(yǎng)。
[0054]用于本發(fā)明微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可以是只要用于屬于埃希氏菌屬的微生物培養(yǎng)的那些培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，但是這些培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件應(yīng)適當(dāng)?shù)貪M足本發(fā)明微生物的需求。
[0055]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，可在需氧條件下在包含合適的碳源、氮源、氨基酸、維生素等的常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，同時(shí)調(diào)節(jié)溫度、pH等。
[0056]可用于本發(fā)明的碳源包括碳水化合物，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、山梨糖醇；醇類，例如糖醇、甘油、丙酮酸、乳酸和檸檬酸；以及氨基酸，例如有機(jī)酸、谷氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸。此外，可使用天然有機(jī)營養(yǎng)源，例如淀粉水解產(chǎn)物、糖蜜、黑糖蜜(blackstrap molasses)、米糠、木薯、甘鹿洛和玉米衆(zhòng)。具體地,有機(jī)營養(yǎng)源包括葡萄糖和經(jīng)無菌預(yù)處理的糖蜜(即，轉(zhuǎn)化為還原糖的糖蜜)，并且可沒有限制地使用合適量的碳源。
[0057]可用于本發(fā)明的氮源包括無機(jī)氮源，例如氨、硫酸銨、氯化銨、乙酸銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨；氨基酸，例如谷氨酸、甲硫氨酸和谷氨酰胺；以及有機(jī)氮源，例如蛋白胨、NZ-胺、肉膏、酵母提取物、麥芽提取物、玉米漿、酪蛋白水解產(chǎn)物、魚粉或其消化產(chǎn)物、脫脂大豆餅或其消化產(chǎn)物等。這些氮源可單獨(dú)使用或組合使用。培養(yǎng)基可包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀以及相應(yīng)的含鈉鹽作為磷源。
[0058]可用于本發(fā)明的無機(jī)化合物包括氯化鈉、氯化鈣、氯化鐵、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳和碳酸鈣。此外，培養(yǎng)基可包含氨基酸、維生素和合適的前體。這些培養(yǎng)基或前體可以以分批或連續(xù)的方式添加到培養(yǎng)基中。
[0059]在培養(yǎng)期間可以以合適的方式將化合物例如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸和硫酸添加到培養(yǎng)基中以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。
[0060]此外，在培養(yǎng)期間，可使用消泡劑(例如脂肪酸聚乙二醇酯)來抑制氣泡的形成。另外，為了使培養(yǎng)基保持在有氧狀態(tài)，可將氧氣或含氧氣體注射至培養(yǎng)基中。此外，為了使培養(yǎng)基保持在缺氧狀態(tài)或無氧狀態(tài)，不注射氣體，或者將氮?dú)狻錃饣蚨趸細(xì)怏w注射至培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基通常保持在27°C至37°C的溫度下，特別地在30°C至35°C的溫度下?？蛇B續(xù)培養(yǎng)微生物直到獲得期望水平的有用物質(zhì)。具體地，培養(yǎng)周期為10小時(shí)至100小時(shí)。
[0061]本發(fā)明的方法還可包括純化或回收在培養(yǎng)步驟中產(chǎn)生的L-氨基酸?？赏ㄟ^使用合適方法從培養(yǎng)基中純化或回收期望的L-氨基酸來進(jìn)行純化或回收過程，所述合適方法根據(jù)用來培養(yǎng)微生物的方法來選擇，例如，分批、連續(xù)或分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法。
[0062]在下文中，將參照實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，應(yīng)理解，這些實(shí)施例用于說明的目的，而不意圖限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
[0063]實(shí)施例1:構(gòu)建產(chǎn)生L-蘇氨酸和L-色氨酸的菌株，所述菌株具有由ysaA、ydaS或ybiX基因編碼的蛋白質(zhì)的弱化活性
[0064]在該實(shí)施例中，通過同源重組使產(chǎn)生L-色氨酸的菌株KCCM10812P (韓國專利注冊號(hào)10-0792095)和產(chǎn)生L-蘇氨酸的菌株KCCM10541 (韓國專利注冊號(hào)10-0576342)中的ysaA、ydaS或ybiX基因的每一個(gè)缺失。
[0065] 產(chǎn)生L-色氨酸的親本菌株KCCM10812P是來源于具有L-苯丙氨酸生產(chǎn)力的大腸桿菌變體KFCC 10066的菌株。其是具有L-色氨酸生產(chǎn)力的重組大腸桿菌菌株，特征在于染色體色氨酸營養(yǎng)缺陷型是脫敏的，pheA、trpR、mtr和tnaAB基因是弱化的并且aroG和trpE基因是經(jīng)修飾的。
[0066]此外，產(chǎn)生L-蘇氨酸的親本菌株KCCM10541是來源于大腸桿菌KFCC10718 (韓國專利公開公布號(hào)1992-0008365)的菌株。其具有L-甲硫氨酸類似物抗性、甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型表型、L-蘇氨酸類似物抗性、滲漏異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型表型、L-賴氨酸類似物抗性和α -氨基丁酸抗性，并且能夠產(chǎn)生L-蘇氨酸。
[0067]待缺失的ysaA、ydaS和ybiX基因具有分別由SEQ ID NO:1、2和3表示的多核苷酸序列。
[0068]為了該目的，使用一步失活方法(由Datsenko KA等開發(fā))，其是使用λ red重組酶的誘變技術(shù)(Proc Natl Acad Sci USA., (2000)97:6640-6645)。作為用于確認(rèn)插入基因中的標(biāo)記，使用了 pUCprmfmloxC的氯霉素抗性基因(韓國專利公開公布號(hào)2009-0075549)。
[0069]使用pUCprmfmloxC作為模板以及引物對(duì)I和2、引物對(duì)7和8以及引物對(duì)13和14通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(在下文中稱為PCR)擴(kuò)增約1200-bp的基因片段，其具有所述三種基因各自的一部分和pUCprmfmloxC的氯霉素抗性基因的一部分。PCR進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由在94°C變性30秒、在55°C退火30秒和在72°C延伸I分鐘組成。
[0070][表 I]
[0071]

【權(quán)利要求】
1.產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的重組大腸桿菌菌株，其中所述菌株被修飾以弱化選自以下的至少一種蛋白質(zhì)的活性:具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)YsaA、具有由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)YdaS和具有由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)YbiX。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的重組大腸桿菌菌株，其中所述蛋白質(zhì)YsaA由以SEQ ID NO:1表示的多核苷酸序列編碼，所述蛋白質(zhì)YdaS由以SEQ IDNO:3表示的多核苷酸序列編碼，并且所述蛋白質(zhì)YbiX由以SEQ ID NO:5表示的多核苷酸序列編碼。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的重組大腸桿菌菌株，其中所述重組大腸桿菌菌株是產(chǎn)生L-蘇氨酸的大腸桿菌(Escherichia coli)CA03-4257P(KCCM11243P)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的重組大腸桿菌菌株，其中所述重組大腸桿菌菌株是產(chǎn)生L-色氨酸的大腸桿菌(Escherichia coli)CA04-2002(KCCM11245P)。
5.一種用于產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的方法，所述方法包括培養(yǎng)產(chǎn)生L-蘇氨酸或L-色氨酸的重組大腸桿菌菌株，其中所述菌株被修飾以弱化選自以下的至少一種蛋白質(zhì)的活性:具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(YsaA)，具有由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(YdaS)和具有由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(YbiX)。
6.根據(jù)權(quán) 利要求5所述的方法，其中所述重組大腸桿菌菌株是產(chǎn)生L-蘇氨酸的大腸桿菌(Escherichia coli)CA03-4257P(KCCM11243P)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述重組大腸桿菌菌株是產(chǎn)生L-色氨酸的大腸桿菌(Escherichia coli)CA04-2002(KCCM11245P)。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104185679SQ201380008312
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2013年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月6日
【發(fā)明者】丁起龍, 李錫明, 黃榮彬, 李根喆, 李光鎬 申請(qǐng)人:Cj第一制糖株式會(huì)社