一株雞新城疫病毒株h12株及其在制備雞新城疫弱毒活疫苗中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株雞新城疫病毒株H12株及其在制備雞新城疫弱毒活疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的一株雞新城疫病毒株H12株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其微生物保藏號為CGMCC?No.8506。實驗表明，本發(fā)明分離得到的NDV?H12株是一株免疫原性好、生產(chǎn)性能優(yōu)良、適宜大規(guī)模生產(chǎn)的種毒。由該NDV?H12株制備的活疫苗產(chǎn)品質(zhì)量合格，能夠滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求。
【專利說明】一株雞新城疫病毒株H12株及其在制備雞新城疫弱毒活疫苗中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株雞新城疫病毒株及其應(yīng)用，具體涉及雞新城疫病毒株H12株及其在制備預(yù)防或治療雞新城疫生物制劑中的應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]新城疫(newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種急性、高度接觸性禽類傳染病，是當(dāng)今全球范圍內(nèi)重要的家禽傳染病之一。在臨床上該病常呈敗血癥經(jīng)過，主要特征是呼吸困難、下痢、神經(jīng)機能紊亂、黏膜和漿膜出血。該病發(fā)病急、致死率高，對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，因此被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)定為A類傳染病，我國也將其列為一類動物疫病。 [0003]目前，該病已廣泛流行于我國所有養(yǎng)雞地區(qū)，在家禽病毒病中，它的流行和危害性占首位。據(jù)農(nóng)業(yè)部估計，我國每年因各種禽病造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)十億元，其中NDV占了近 10%。
[0004]NDV只有I個血清型，但根據(jù)其毒力的不同，可以分為強毒株、中等毒力株和弱毒株(低致病力毒株)。強毒株又可稱為速發(fā)型毒株，中等毒力株為中發(fā)型毒株，弱毒株為緩發(fā)型毒株。
[0005]盡管我國新城疫免疫接種已經(jīng)普及多年并己基本上控制了典型新城疫的流行，但非典型ND仍時有發(fā)生，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展。目前疫苗是控制本病發(fā)生的重要手段。
[0006]自從1940開始，就在全球范圍內(nèi)使用新城疫疫苗，最為成功的疫苗是由緩發(fā)型病毒株和經(jīng)過精心篩選的某些中發(fā)型病毒株組成的新城疫活病毒疫苗。
[0007]在我國，使用弱毒活疫苗和油乳劑滅活疫苗已成為防治新城疫的常規(guī)實踐。
[0008]滅活苗自70年開始應(yīng)用，分單純滅活苗和油乳劑滅活苗，目前應(yīng)用較多的是油乳劑滅活苗。油乳劑滅活苗可以產(chǎn)生堅強而持久的免疫力，不會通過疫苗的使用而擴散病原。
[0009]弱毒疫苗株包括中等毒力的I系疫苗(Mukteswar株)以及弱毒的II系、III系、IV系和V4弱毒疫苗。
[0010]最近幾年，隨著細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，細胞苗和克隆苗相繼問世?？寺∶缇哂锌乖约円?，免疫原性強的特點。我國從美國引進的克隆N-79株型La Sota弱毒株，從I系中挑選出的克隆-30及克隆-83是具有良好免疫原性而且遺傳性非常穩(wěn)定的弱毒疫苗。
[0011 ] 細胞苗具有成本低、容易生產(chǎn)和可避免雞源性潛在疾病感染的特點。
[0012]成纖維細胞是結(jié)締組織最主要的細胞成分，它是由胚胎時期的間充質(zhì)細胞分化而來，在分泌細胞外基質(zhì)成分和構(gòu)建細胞外基質(zhì)中扮演著十分重要的角色，在組織創(chuàng)傷修復(fù)過程中也發(fā)揮著重要的作用。由于雞胚成纖維細胞相對容易獲得，而且增殖能力強，適應(yīng)性強，具有良好的耐受性，性狀比較穩(wěn)定，不易發(fā)生轉(zhuǎn)化。因此，使得成纖維細胞除了應(yīng)用于細胞和分子生物學(xué)的研究，還被廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)研究領(lǐng)域，同時也是疫苗生產(chǎn)的重要細胞資源。
[0013]但目前市售的雞新城疫活疫苗絕大部分來源于雞胚組織苗，因為利用現(xiàn)有的雞胚成纖維細胞生產(chǎn)工藝所生產(chǎn)的原液，病毒滴度不穩(wěn)定，批間差異較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種低致病力的雞新城疫病毒，該病毒具有免疫原性好，安全，且同時具有在細胞上增殖的特性，從而適宜作為大規(guī)模生產(chǎn)弱毒疫苗的種毒。
[0015]為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段:
[0016]2012年，本發(fā)明發(fā)明人從黑龍江省齊齊哈爾市郊某養(yǎng)殖場，采集瀕死雞肝臟，研磨后用2000單位青、鏈霉素溶液處理，再接種雞胚,收集48h~96h雞胚尿囊液，分離了一株低致病力的雞新城疫病毒，其具有在細胞上增殖的特性?；诖耍景l(fā)明通過利用病毒馴化與純化技術(shù)，篩選出了在雞胚成纖維細胞上增殖力良好的低致病力的病毒株，研究表明該病毒株具有滴度高、免疫原性好、安全性好等優(yōu)點。
[0017]本發(fā)明分離得到低致病力的雞新城疫病毒，命名為H12株，分類命名為雞新城疫病毒，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，微生物保藏號為CGMCC N0.8506 ;保藏日期:2013年11月18日。
[0018]本發(fā)明還提出了所述的低致病力的雞新城疫病毒在制備雞新城疫弱毒活疫苗中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明所要解決 的技術(shù)問題之二是提供一種制備雞新城疫弱毒活疫苗的方法。
[0020]為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段:
[0021]一種制備雞新城疫弱毒活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0022](I)將保藏號為CGMCC N0.8506的H12株用無血清DMEM稀釋IO4倍后，接種單層雞胚成纖維細胞，至37°C培養(yǎng)，當(dāng)細胞80%出現(xiàn)病變時，至_20°C凍融3次后，收獲用于疫苗制備.[0023](2)凍干
[0024]向收獲的細胞原液內(nèi)加入相同體積的凍干保護劑，混勻、定量、凍干；
[0025](3)壓蓋、軋蓋
[0026]凍干完成后，抽真空、壓緊膠塞，并用鋁蓋軋緊密封，-20°C凍存，即得。
[0027]本發(fā)明的制備得到的一種雞新城疫弱毒活疫苗，其特征在于有效成分為本發(fā)明所述的低致病力的雞新城疫病毒。
[0028]優(yōu)選的，所述的凍干保護劑為5%蔗糖脫脂乳(蔗糖5g+脫脂乳至100ml)。
[0029]實驗表明，本發(fā)明分離得到的NDV H12株是一株免疫原性好、生產(chǎn)性能優(yōu)良、適宜大規(guī)模生產(chǎn)的種毒。由該NDV H12株制備的活疫苗產(chǎn)品質(zhì)量合格，具備產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的條件。
【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0031]實施例1本發(fā)明雞新城疫病毒株種毒的分離、培養(yǎng)及鑒定
[0032]一、病料采集及微量紅細胞凝集(HA)試驗
[0033]病料來自黑龍江省齊齊哈爾市郊某養(yǎng)殖場，采集瀕死雞肝臟，研磨后用2000單位青、鏈霉素溶液處理，再接種雞胚，收集48h~96h雞胚尿囊液。對收獲的雞胚液進行血凝試驗，微量紅細胞凝集(HA)試驗的具體操作步驟如下:
[0034]1、向微量 血凝板每孔中加入PBS25 μ 1，共做4行平行重復(fù)。
[0035]2、吸取雞胚液加入到第I列各孔，每孔25 μ 1，然后自左向右進行2倍系列稀釋至第11列孔，從第11列各孔吸取25 μ I混合液，棄去。第12列各孔不加抗原，作為對照孔。
[0036]3、向每孔中加入1%紅細胞懸液25 μ I。
[0037]4、將微量血凝板置微型震蕩器上震蕩I分鐘。
[0038]5、將微量血凝板置室溫作用30分鐘，判定結(jié)果。
[0039]結(jié)果表明，收獲的雞胚液的HA血凝價為71og2。
[0040]二、病毒分離株血凝抑制(HI)試驗
[0041]分別用H5、H7和H9亞型Al標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及ND、EDS-76病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與HA為陽性的雞胚尿囊液進行HI試驗。
[0042]微量血凝抑制(HI)試驗的具體操作步驟如下
[0043]1、在96孔微量板上，第I孔至第12孔，每孔加入25 μ I PBS。
[0044]2、向第I孔中加入被檢血清25 μ I,依次2倍系列稀釋至第12孔,最后從第12孔棄去25 μ I混合液。
[0045]3、向每孔中加入25 μ 14倍的HA單位工作抗原液，置微型震蕩器上震蕩I分鐘。
[0046]4、置室溫下作用30分鐘。
[0047]5、向每孔加入1%紅細胞懸液25 μ 1，置微型震蕩器上震蕩I分鐘。
[0048]6、置室溫作用30分鐘，判定結(jié)果。
[0049]結(jié)果表明，與Η5、Η9、Η7亞型Al和EDS-76病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清反應(yīng)為陰性，與ND標(biāo)準(zhǔn)陽性血清反應(yīng)為陽性。
[0050]三、Fl代原始種毒腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)和靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)的測定
[0051]1、腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)的測定
[0052]取I日齡SPF雛雞10只，各腦內(nèi)注射KT1稀釋的新鮮含F(xiàn)l代原始種毒的尿囊液(接種針頭直徑0.45mm,長5mm)。另取2只以同樣方法注射稀釋病毒用的生理鹽水各
0.05ml ο
[0053]接種后，每日在相應(yīng)接種的時間觀察，記錄雛雞的情況，分正常、(活動靈活，行動無共濟失調(diào)現(xiàn)象)、發(fā)病(包括麻痹、臥地不起，但不包括只表現(xiàn)遲鈍的雞)和死亡。觀察8日，計算正常、發(fā)病、死亡雞的總數(shù)，根據(jù)不同的權(quán)值(正常為0，發(fā)病為1，死亡為2)累計總分?jǐn)?shù)。ICPI為累計總分除以正常、發(fā)病和死亡雞的累計總數(shù)的平均值。統(tǒng)計結(jié)果如表1所示:
[0054]表1腦內(nèi)致病指數(shù)測定表
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種低致病力的雞新城疫病毒，命名為H12株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其微生物保藏號為CGMCC N0.8506。
2.權(quán)利要求1所述的低致病力的雞新城疫病毒在制備雞新城疫弱毒活疫苗中的應(yīng)用。
3.一種制備雞新城疫弱毒活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將保藏號為CGMCCN0.8506的Hl 2株用無血清DMEM稀釋IO4倍后，接種單層雞胚成纖維細胞，至37°C培養(yǎng)，當(dāng)細胞80%出現(xiàn)病變時，至_20°C凍融3次后，收獲用于疫苗制備； (2)凍干 向收獲的細胞原液內(nèi)加入相同體積的凍干保護劑，混勻、定量、凍干； (3)壓蓋、軋蓋 凍干完成后，抽真空、壓緊膠塞，并用鋁蓋軋緊密封，-20°C凍存，即得。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的凍干保護劑為5%蔗糖脫脂乳。
5.一種雞新城疫弱毒活疫苗，其特征在于有效成分為權(quán)利要求1所述的低致病力的雞新城疫 病毒。
【文檔編號】C12R1/93GK103710313SQ201310726202
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】張楊, 楊萬秋, 楊朋欣, 李東偉, 焦利紅, 叢秋實, 柴華, 張明波, 李靜, 梁宛楠, 胡瑞鴻, 劉洪斌 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司