一種高效提取厭氧顆粒污泥微生物總rna的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種高效提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，取活性污泥離心，棄上清，然后向離心管內(nèi)加入滅菌玻璃珠和貯存液Ⅰ，將離心管管蓋擰緊后置于旋渦混合器擊打，離心棄上清，磷酸鹽緩沖液洗滌；加入貯存液Ⅱ溫育；加入TRIzol，漩渦振蕩后離心取上清，加入氯仿，漩渦振蕩，室溫放置并離心取上清，加入異丙醇，－20℃放置后離心棄上清，加入75％乙醇洗滌沉淀，離心棄上清，風干沉淀，貯存液Ⅲ溶解核酸沉淀，加入DNase?I(RNase?free)和RNase抑制劑，采用RNA純化試劑盒純化RNA。簡化了微生物總RNA提取步驟，實現(xiàn)了快速、高效的提取厭氧顆粒污泥的微生物總RNA。
【專利說明】一種高效提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高效提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]活性顆粒污泥是由以細菌為主的微生物與懸浮物質(zhì)、膠體物質(zhì)、腐殖質(zhì)等混雜在一起所形成的茶褐色絮凝體，其中微生物是廢水生物處理過程的主體，它們生理狀態(tài)的好壞直接影響著處理效果?；钚灶w粒污泥具有高度的生物多樣性且成分極其復(fù)雜，不僅含有重金屬、腐殖酸等有機污染物，還存在大量核糖核酸酶(RNase)，因此從活性污泥中提取RNA存在一定難度。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，對活性污泥中微生物種群的多樣性、功能基因的表達與處理效果之間關(guān)系的研究越來越受到環(huán)境微生物工作者的重視。
[0003]已有研究表明，通過分子生物學(xué)手段展開活性污泥中微生物的有關(guān)研究主要基于DNA水平進行，但從DNA水平上檢測到的微生物多樣性、豐度等微生物生態(tài)分析不受存活力、代謝狀況和環(huán)境條件等因素的影響，不能反映真實狀態(tài)，而在RNA水平上進行的微生物種群分析與基因的表達分析則更能真實地體現(xiàn)分析時的狀況，因而提取高質(zhì)量的RNA是在基因表達水平上研究廢水生物處理過程活性污泥中微生物菌群變化及關(guān)鍵調(diào)控基因表達規(guī)律的必要條件。關(guān)于RNA的提取方法，國內(nèi)外已做過大量的研究報道，主要包括Trizol法、異硫氰酸胍法、酚-SDS法等，但這些方法只能從一般的細菌、動物、植物等材料中提取獲得較好質(zhì)量的RNA，對成分復(fù)雜的活性污泥不太適用。目前已報道的環(huán)境樣品RNA提取方法主要是針對土壤、沉積物等，而活性顆粒污泥與這些環(huán)境樣品的特性不同，不僅生物量大，而且存在菌膠團，因此這些方法并不太適用成分復(fù)雜的活性污泥。盡管國外有文獻報道凍融法、珠磨法、試劑盒法等能`從土壤、沉積污泥、活性污泥等樣品中提取出RNA，但這些方法都有各自的缺點，凍融法很費時，珠磨法需要特殊的儀器珠磨機，試劑盒的價格昂貴，均難以用于大量樣品的分析，此外，國內(nèi)關(guān)于活性污泥中RNA的提取方法鮮見報道。另外，不同的提取方法獲得的微生物群落基因多樣性及其種類、豐度均不同。因而尋找一種操作簡便、成本低廉且適合于提取活性顆粒污泥總RNA的方法，全面反映微生物多樣性，對于利用分子生物學(xué)手段研究活性污泥中的微生物生態(tài)、功能基因及表達具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種快速、有效、高質(zhì)量的可用于厭氧顆粒污泥的微生物總RNA提取的方法。該方法具有RNA提取總量多、純度高、降解程度低、完整性好、具有豐富的生物多樣性。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0006]一種高效提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，包括下列步驟:
[0007]I)取活性污泥于滅菌離心管中離心；[0008]2)棄上清，然后向離心管內(nèi)加入滅菌玻璃珠和貯存液I，將離心管管蓋擰緊后置于旋渦混合器擊打3~Smin以解絮凝并洗滌污泥除去腐殖酸，離心；
[0009]3)棄上清，重復(fù)步驟2)處理I次后，用磷酸鹽緩沖液PBS洗滌污泥I次；
[0010]4)取步驟3)預(yù)處理后的污泥，加入貯存液II于30~40°C溫育5~15min ；
[0011]5)加入TRIzol,鏇潤振蕩3~8min后,離心；
[0012]6)取上清，加入氯仿，漩渦振蕩10~20s后，室溫放置I~4min并離心；
[0013]7)取上清，加入異丙醇，一20°C放置15~25min，離心；
[0014]8)棄上清,加入75%乙醇洗漆沉淀后,9000~11000r/min離心3~8min ； [0015]9)棄上清，風干沉淀，用貯存液III溶解核酸沉淀后，加入DNase I (RNasefree) 25~35U和RNase抑制劑35~40U，并于30~40°C作用10~20min，進一步采用RNA純化試劑盒純化RNA。
[0016]優(yōu)選的，步驟I)和2)所述離心為，7000~9000r/min, 3~8°C條件下離心3~8min ;優(yōu)選的,步驟I)和2)所述離心為,8000r/min,4°C條件下離心5min。
[0017]優(yōu)選的，步驟2)所述滅菌玻璃珠的直徑為2~3mm，滅菌玻璃珠的加入量為0.2~
0.4g/ml活性污泥；貯存液I的加入量為I~2mL/ml活性污泥；更優(yōu)選的，滅菌玻璃珠的加入量為0.3g/ml活性污泥；忙存液I的加入量為1.4mL/ml活性污泥；優(yōu)選的，步驟3)中，將離心管管蓋擰緊后置于旋渦混合器擊打5min以解絮凝并洗滌污泥除去腐殖酸，
[0018]步驟3)所述的磷酸鹽緩沖液PBS為磷酸鹽緩沖液，PH為7.4，組成:NaC1137mmol/L, KC12.7mmol/L, Na2HP0410mmol/L，KH2P042mmol/L。
[0019]優(yōu)選的，步驟4)中貯存液II的加入量為ΙΟΟμ L/ΙΟΟμ L預(yù)處理后的污泥；優(yōu)選的，步驟4)中于37°C溫育lOmin。
[0020]優(yōu)選的，步驟5)所述的TRIzol加入量為0.5~1.5mL/100 μ L預(yù)處理后的污泥；更優(yōu)選的，步驟5)所述的TRIzoI加入量為lmL/ΙΟΟμ L預(yù)處理后的污泥；TRIzol為一種總RNA抽提試劑，其主要成分為苯酚。
[0021]優(yōu)選的，步驟5)、6)和7)所述的離心為9000~11000r/min離心8~12min ;更優(yōu)選的，步驟5)、6)和7)所述的離心為10000r/min離心IOmin0
[0022]優(yōu)選的，步驟6)中，氯仿加入量為150~240 μ L/100 μ L預(yù)處理后的污泥；更優(yōu)選的，步驟6)中，氯仿加入量為200yL/100yL預(yù)處理后的污泥。
[0023]優(yōu)選的，步驟7)中，異丙醇加入量為150~240μ L/ΙΟΟμ L預(yù)處理后的污泥；更優(yōu)選的，步驟6)中，異丙醇加入量為200 μ L/100 μ L預(yù)處理后的污泥。
[0024]優(yōu)選的，步驟8)中10000r/min離心5min。
[0025]優(yōu)選的，步驟9)中貯存液III的加入量為20~40 μ L/100 μ L預(yù)處理后的污泥；更優(yōu)選的，步驟9)中貯存液III的加入量為30 μ L/100 μ L預(yù)處理后的污泥；
[0026]步驟9)所述的DNase I (RNase free)為無RNA酶的脫氧核糖核酸酶I ;RNase抑制劑為一種大腸桿菌表達的重組蛋白，可以通過非競爭性方式按1:1比例和RNase A>RNaseB或RNase C結(jié)合，并抑制這三種酶的活性，保護RNA不被這三種酶降解。
[0027]優(yōu)選的，步驟9)中加入DNase I (RNase free) 30U和RNase抑制劑40U，并于37°C作用15min。
[0028]其中，所有耗材都要經(jīng)過DEPC處理及高壓滅菌。所述DEPC為焦碳酸二乙酯，是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。
[0029]本文所述的“上清”指上層清液。
[0030]DEPC處理水:無菌蒸餾水中加入0.1%(ν/ν)焦碳酸二乙酯(DEPC)，室溫攪拌4小時以上，121度高壓滅菌20分鐘，冷卻備用。
[0031]更優(yōu)選的，技術(shù)方案如下:
[0032]取IOmL活性污泥于15mL的滅菌離心管中離心8000r/min, 4°C, 5min,棄上清后，向管內(nèi)加入3g滅菌玻璃珠(直徑2~3_)和1.4mL貯存液I，將離心管管蓋擰緊后置于旋渦混合器擊打5min以解絮凝并洗滌污泥除去腐殖酸，離心8000r/min，4°C，5min，棄上清，重復(fù)處理I次后，用磷酸鹽緩沖液PBS洗滌污泥I次，沉淀用于細胞裂解。取一定量預(yù)處理后的污泥樣品并加入100μ L常用貯存液II于37°C溫育IOmin后，加入ImL TRIzol，漩渦振蕩5min后，10000r/min離心IOmin,取上清加入200 μ L氯仿,鏇潤振蕩15s后，室溫放置2min并于10000r/min離心IOmin,取上清并加入等體積異丙醇，一 20°C放置20min, 10000r/min離心lOmin,棄上清,加入75%乙醇洗漆沉淀后，10000r/min離心5min,棄上清并風干沉淀，用30 μ L常用貯存液III溶解核酸沉淀后，加入DNase I (RNase free) 30U和RNase抑制劑40U，并于37°C作用15min，進一步采用RNA純化試劑盒純化RNA。其中，所有耗材都要經(jīng)過DEPC處理及高壓滅菌。
[0033]提取RNA 貯存液 1:Tris-HC150mmol/L+EDTA20mmol/L+Nacll00mmol/L+PVPl% 配制成100ml溶液；EDTA為乙二胺四乙酸，Tris-HCl為三(羥甲基)氨基甲烷，PVP為聚乙烯基吡咯烷酮均聚物，簡稱貯存液I。PVP在貯存液I的濃度是1%。所述的提取RNA貯存液中，如無特殊說 明，所述濃度均為提取RNA貯存液中的溶質(zhì)濃度。
[0034]提取RNA貯存液II:20mg/mL溶菌酶+ 20mg/mL蛋白酶K+10%SDS配制成100ml溶液；溶菌酶為N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，蛋白酶K為是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，SDS為十二烷基磺酸鈉，簡稱貯存液II。
[0035]提取RNA貯存液II1:1.2mL DEPC處理水+ lmmol BSA配制成100ml溶液；DEPC處理水為無菌蒸餾水中加入0.1%(ν/ν)焦碳酸二乙酯(DEPC)，室溫攪拌4小時以上，121度高壓滅菌20分鐘，冷卻備用。BSA為牛血清白蛋白。簡稱貯存液III。
[0036]本發(fā)明的有益效果在于:
[0037]1、本發(fā)明制備的提取液為溶菌酶、蛋白酶K、SDS，利于微生物細胞壁裂解。
[0038]2、本發(fā)明制備的提取液中含有BSA，可以促進PCR反應(yīng)的穩(wěn)定性。
[0039]3、本發(fā)明制備的提取液配方組成，是實驗室普遍采用的常規(guī)試劑，經(jīng)濟性好。
[0040]4、本發(fā)明制備的提取液無毒、無刺激性氣味，操作安全。
[0041]5、本發(fā)明簡化了微生物總RNA提取步驟，實現(xiàn)了快速、高效的提取厭氧顆粒污泥的微生物總RNA。
[0042]6、本發(fā)明制備的提取液提取效果好，蛋白質(zhì)、酚類等雜質(zhì)殘留較少。
[0043]通過比較RNA產(chǎn)量、純度、降解程度、特定基因的擴增能力、微生物多樣性等評價指標，考察和探討RNA提取方法對活性污泥總RNA提取效果的影響并最終建立了一種快速、有效的活性污泥RNA提取方法。即在TENP和PBS洗滌沉淀污泥的基礎(chǔ)上，分別采用溶菌酶和TRIzol裂解活性污泥細菌、氯仿去除細菌裂解液中的蛋白和大部分DNA、異丙醇沉淀核酸和DNaseI水解殘留DNA后，最后進一步用離心柱純化RNA。[0044]結(jié)果表明，這種方法可以有效提取高質(zhì)量的菌群RNA，不僅提取的RNA總量多(每g污泥可提取169.6 u gRNA)、純度高、降解程度低、完整性好、具有豐富的生物多樣性，而且可同時進行16SrRNA和amcrA基因的RT-PCR擴增反應(yīng)；與其它方法相比，性價比高，具有明顯的優(yōu)越性，適用于活性污泥RNA的大量提取，同時，T-RFLP結(jié)果證明RNA提取方法對分析樣品的微生物種類和豐度分析結(jié)果影響較大，不同的RNA提取方法所獲得的微生物群落基因多樣性及其種類、豐度均不同。本研究建立了一種快速、有效的高質(zhì)量RNA提取方法，將在監(jiān)測活性污泥菌群動態(tài)變化、菌群代謝功能學(xué)、微生物群落芯片等研究上具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1為實施例1的RNA電泳圖；
[0046]圖2為實施例2的RNA電泳圖。
【具體實施方式】
[0047]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0048]實施例1
[0049]活性顆粒污泥樣品取自山東省禹城市福田藥業(yè)有限公司污水處理廠。
[0050]取IOmL活性污泥于15mL的滅菌離心管中離心8000r/min, 4°C, 5min,棄上清后，向管內(nèi)加入3g滅菌玻璃珠(直徑2-3_)和1.4mL貯存液I，將離心管管蓋擰緊后置于旋渦混合器擊打5min以解絮凝并洗滌污泥除去腐殖酸，離心8000r/min，4°C，5min，棄上清，重復(fù)處理I次后，用磷酸鹽緩沖液PBS洗滌污泥I次，沉淀用于細胞裂解。取一定量預(yù)處理后的污泥樣品并加入IOOii L常用貯存液II于37°C溫育IOmin后，加入ImL TRIzol，漩渦振蕩5min后，10000r/min離心IOmin,取上清加入200 u L氯仿,鏇潤振蕩15s后，室溫放置2min并于10000r/min離心IOmin,取上清并加入等體積異丙醇，一 20°C放置20min, 10000r/min離心IOmin,棄上清,加入75%乙醇洗漆沉淀后，10000r/min離心5min,棄上清并風干沉淀，用30 ii L常用貯存液III溶解核酸沉淀后，加入DNase I (RNase free) 30U和RNase抑制劑40U，并于37°C作用15min，進一步采用RNA純化試劑盒純化RNA。取I y L RNA,稀釋50倍，用紫外分光光度計進行質(zhì)量檢測。取5yL RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA條帶。
[0051]總RNA 0D260/0D280為1.98，這表明RNA無蛋白質(zhì)或酚污染，電泳結(jié)果表明RNA樣品條帶清晰，28S比18S rRNA條帶亮度接近2:1，說明RNA質(zhì)量較高，見圖1、表1。
[0052]表1RNA質(zhì)量檢測
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，包括下列步驟: 1)取活性污泥于滅菌離心管中離心； 2)棄上清，然后向離心管內(nèi)加入滅菌玻璃珠和貯存液I，將離心管管蓋擰緊后置于旋渦混合器擊打3~Smin以解絮凝并洗滌污泥除去腐殖酸，離心； 3)棄上清，重復(fù)步驟2)處理I次后，用磷酸鹽緩沖液PBS洗滌污泥I次； 4)取步驟3)預(yù)處理后的污泥，加入貯存液II于30~40°C溫育5~15min； 5)加入TRIzol，鏇潤振蕩3~8min后，離心； 6)取上清,加入氯仿,鏇潤振蕩10~20s后,室溫放置I~4min并離心； 7)取上清，加入異丙醇，-20°C放置15~25min，離心； 8)棄上清,加入75%乙醇洗漆沉淀后,9000~11000r/min離心3~8min； 9)棄上清，風干沉淀，用貯存液III溶解核酸沉淀后，加入DNaseI (RNase free) 25~35U和RNase抑制劑35~40U，并于30~40°C作用10~20min，進一步采用RNA純化試劑盒純化 RNA。
2.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟I)和2)所述離心為，7000~9000r/min, 3~8°C條件下離心3~8min。
3.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟2)所述滅菌玻璃珠的直徑為2~3mm，滅菌玻璃珠的加入量為0.2~0.4g/ml活性污泥；貯存液I的加入量為I~2mL/ml活性污泥。
4.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟3)中，將離心管管蓋擰緊后置于旋渦混合器擊打5min以解絮凝并洗滌污泥除去腐殖酸，步驟4)中貯存液II的加入量為100 μ L/100 μ L預(yù)處理后的污泥；步驟4)中于37°C溫育lOmin。
5.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟5)所述的TRIzol加入量為0.5~1.5mL/100 μ L預(yù)處理后的污泥。
6.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟5)、6)和7)所述的離心為9000~11000r/min離心8~12min。
7.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟6)中，氯仿加入量為150~240 μ L/100 μ L預(yù)處理后的污泥； 步驟7)中，異丙醇加入量為150~240 μ L/100 μ L預(yù)處理后的污泥； 步驟 8)中 10000r/min 離心 5min。
8.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟9)中忙存液III的加入量為20~40 μ L/100 μ L預(yù)處理后的污泥。
9.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，步驟9)中加入 DNase I (RNase free) 30U 和 RNase 抑制劑 40U，并于 37°C作用 15min。
10.如權(quán)利要求1所述的提取厭氧顆粒污泥微生物總RNA的方法，其特征在于，所有耗材都要經(jīng)過DEPC處理及高壓滅菌。
【文檔編號】C12N15/10GK103695414SQ201310724606
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】姬丹丹, 臧立華, 薛嶸, 李肖玲 申請人:齊魯工業(yè)大學(xué)