干細(xì)胞在外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作用下分化及鑒定的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞在外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作用下分化及鑒定的方法,包括有以下步驟:胚胎大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的分離和擴(kuò)增;依賴EGF和FGF的神經(jīng)球細(xì)胞在不同外源性因子作用下的培養(yǎng)及分化;含HIF-1α、BDNF序列的重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建;大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染及分析:表達(dá)產(chǎn)物的測(cè)定和生物活性分析。本發(fā)明的干細(xì)胞分化及鑒定的方法性能穩(wěn)定。
【專利說(shuō)明】干細(xì)胞在外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作用下分化及鑒定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞在外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作用下分化及鑒定的方法,屬于醫(yī)學(xué)生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]脊髓損傷是造成人體截癱的主要原因,一直是神經(jīng)外科研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。脊髓損傷的病理生理過(guò)程包括脊髓原發(fā)性損傷、繼發(fā)性損害和脊髓修復(fù)三個(gè)階段。脊髓原發(fā)性損傷是受傷當(dāng)時(shí)物理性損傷造成的神經(jīng)細(xì)胞的死亡。脊髓繼發(fā)性損害的機(jī)制包括血液循環(huán)障礙、生化活性物質(zhì)改變及能量代謝障礙等多個(gè)方面,其核心問(wèn)題是組織的缺血缺氧。脊髓損傷后功能的喪失是由于神經(jīng)細(xì)胞的死亡、上行和下行軸突的中斷以及缺乏有效的再生。最近的研究表明軸突再生的失敗是由于損傷部位存在阻礙軸突再生的疤痕組織及抑制性分子、被切斷的軸突缺乏營(yíng)養(yǎng)支持和軸突被切斷后的內(nèi)在性神經(jīng)細(xì)胞改變包括細(xì)胞變性及死亡。脊髓損傷治療主要包括提供受損軸突生長(zhǎng)允許性微環(huán)境、增強(qiáng)被切斷軸突的神經(jīng)細(xì)胞的再生作用二大方面。過(guò)去所采用的方法包括脊髓內(nèi)移植胚胎組織、外周神經(jīng)、原代細(xì)胞、細(xì)胞系;以及應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)因子、促使生長(zhǎng)相關(guān)基因過(guò)度表達(dá)等。但是,單純應(yīng)用一種方法并不能得到滿意的脊髓功能恢復(fù),而聯(lián)合應(yīng)用多種方法已經(jīng)顯示出良好的脊髓功能恢復(fù)。
[0003]近來(lái),從胚胎、成體腦和脊髓中分離出的神經(jīng)干細(xì)胞引起了我們極大的興趣,包括胚胎干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、祖細(xì)胞、定向祖細(xì)胞。自我更新和多種分化潛能是神經(jīng)干細(xì)胞的二種基本屬性。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明 提供了一種穩(wěn)定的干細(xì)胞在外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作用下分化及鑒定的方法。
[0005]為解決以上技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:干細(xì)胞在外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作用下分化及鑒定的方法,包括有以下步驟:
(1)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的分離和擴(kuò)增
嚴(yán)格無(wú)菌條件下,在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中取出胚胎大鼠脊髓,用HBSS沖洗,剪碎,移入含DMEM/F12、EGF、FGF的全生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基,用吸管吹打制成單細(xì)胞懸液,移入培養(yǎng)瓶;原代細(xì)胞克隆形成后再次機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液,每7-10天傳代一次,方法同前;低溫保存時(shí),全生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10%DMS0 ;在傳代同時(shí)并進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn),用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)NestiruECAM確定細(xì)胞類型;
(2)依賴EGF和FGF的神經(jīng)球細(xì)胞在不同外源性因子作用下的培養(yǎng)及分化
依賴EGF和FGF的神經(jīng)球細(xì)胞轉(zhuǎn)移到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板,在EGF或FGF和以下一種或數(shù)種因子聯(lián)合作用下培養(yǎng)4-8天:H)GF、NT-3, BDNF, NGF, EGF、FCS, FGF、順式視黃酸;免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)Nestin、ECAM、NeuN確定細(xì)胞類型;
(3)含HIF-1α、BDNF序列的重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建1)鼠HIF-1α的克隆:鼠肝癌細(xì)胞系IfepalclcTjaffi總RNA? HIF-1 a cDNA (核心序列約2.5Kb) 重組質(zhì)粒一轉(zhuǎn)化細(xì)菌一篩選菌落,
2)質(zhì)粒pGEM-3zf(+)-GDNF由中科院分子免疫中心提供,轉(zhuǎn)化細(xì)菌一篩選菌落,
3)目的基因的陽(yáng)離子脂質(zhì)體的包裝和測(cè)定,
4)表達(dá)載體的鑒定:酶切、瓊脂糖凝膠電泳及聚丙烯酰胺電泳分析HIF-1α、GDNF基因并驗(yàn)證其表達(dá)的正確性;
(4)大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染及分析:含目的基因的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞共同孵育I小時(shí),然后置于含G418的細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24小時(shí),收集新霉素抗性克隆;臺(tái)盤藍(lán)染色,至移植時(shí),在HBSS中分離成單細(xì)胞懸液,重新放于全生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基,確定細(xì)胞活性及密度為IO5細(xì)胞/μ 1,移植后,剩余的細(xì)胞行組織化學(xué)法及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)類型等,并檢測(cè)β -gal與⑶NF、HIF-1 α表達(dá)的相關(guān)性;
(5)表達(dá)產(chǎn)物的測(cè)定和生 物活性分析:采用Westernblot法和Slot blot法驗(yàn)證⑶NF、HIF-1 α的表達(dá),應(yīng)用Ε8雞胚DRG檢測(cè)⑶NF的生物活性;采用Western blot法、免疫組織化學(xué)法從蛋白質(zhì)水平測(cè)定HIF-Ια的生物活性。
[0006]本專利設(shè)計(jì)了通過(guò)脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、定向分化,并經(jīng)HIF-1 α、⑶NF基因修飾后可移植入脊髓損傷模型,神經(jīng)干細(xì)胞被移植后,大部分因局部微環(huán)境中信號(hào)因子的調(diào)節(jié)而分化成相應(yīng)的細(xì)胞并遷徙、整合入宿主組織。從腦和脊髓中分離與培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)特異性因子處理后仍可以長(zhǎng)期增殖并保持其分化潛能,即分化成成熟的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的能力,產(chǎn)生適合需要的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞,代替缺失的神經(jīng)元、挽救宿主瀕死的神經(jīng)元、重建神經(jīng)環(huán)路、提供宿主再生的軸突及去神經(jīng)支配神經(jīng)元之間的中繼站。本發(fā)明的干細(xì)胞分化及鑒定的方法性能穩(wěn)定。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0007]附圖1是本發(fā)明體外實(shí)驗(yàn)的步驟圖。
[0008]附圖2是本發(fā)明動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的步驟圖。
【具體實(shí)施方式】
[0009]本發(fā)明涉及干細(xì)胞在外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作用下分化及鑒定的方法,具體名詞解釋如下:
DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基,是在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的。與MEM比較增加了各種成分用量,同時(shí)又分為高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長(zhǎng),適于生長(zhǎng)較快、附著較困難腫瘤細(xì)胞等。
[0010]HBSS:Hank’s Balanced Salt Solution---Hank’s 平衡鹽溶液
Hank 平衡鹽溶液(HBSS)的配方為:8 g/L NaCl, 0.4 g/L KCl, I g/L 葡萄糖,60mg/L KH2P04, 47.5 mg/L Na2HP04, NaHC03, 0.35g/L,調(diào) pH 至 7.2.一般用于配制細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的培養(yǎng)基或者清洗細(xì)胞。
[0011]DMSO即二甲基亞諷。二甲基亞諷(Dimethyl sulfoxide或DMS0),無(wú)色液體,重要的極性非質(zhì)子溶劑。它可與許多有機(jī)溶劑及水互溶。二甲基亞砜具有極易滲透皮膚的特殊性質(zhì),造成使用人員感覺(jué)類似牡蠣般的味道。[0012]EGF:上皮生長(zhǎng)因子,表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子是人體內(nèi)的一種活性物質(zhì),由53個(gè)氨基組成的活細(xì)胞,藉由刺激表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體之酪氨酸磷酸化,達(dá)到修補(bǔ)增生肌膚表層細(xì)胞,據(jù)說(shuō)對(duì)受傷、受損之表皮肌膚擁有絕佳之療效。其最大特點(diǎn)是能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化,從而以新生的細(xì)胞代替衰老和死亡的細(xì)胞。EGF還能止血,并具有加速皮膚和粘膜創(chuàng)傷愈合,消炎鎮(zhèn)痛,防止?jié)兊墓πАGF的穩(wěn)定性能極好,在常溫下不易失散流動(dòng),能與人體內(nèi)各種酶形成良好的協(xié)調(diào)效應(yīng)。最初的EGF主要被運(yùn)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,主要用于促進(jìn)受損表皮的修復(fù)與再生,如治療燒傷、燙傷等。
[0013]FGF:在頭發(fā)的根部存在一種負(fù)責(zé)制造“FGF”蛋白質(zhì)的基因,“人類基因組計(jì)劃”科學(xué)家稱之為“FGF基因”,這是影響黑發(fā)生長(zhǎng)的根源。人類基因組計(jì)劃(Human GenomeProject, HGP)是由美國(guó)科學(xué)家于1985年率先提出,于1990年正式啟動(dòng)的。美國(guó)、英國(guó)、日本和中國(guó)等科學(xué)家共同參與了這一價(jià)值達(dá)30億美元的人類基因組計(jì)劃。
[0014]Nestin:巢蛋白,是一種中間絲類型的蛋白,能夠特異性的表達(dá)在神經(jīng)上皮干細(xì)胞上一種分子標(biāo)記物;可能對(duì)神經(jīng)元的分化有作用。NESTIN僅在胚胎發(fā)育早期的神經(jīng)上皮表達(dá),出生后表達(dá)就停止。為神經(jīng)干細(xì)胞的特征性標(biāo)志物。
[0015]具體包括有以下步驟:
(1)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的分離和擴(kuò)增
嚴(yán)格無(wú)菌條件下,在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中取出胚胎大鼠脊髓,用HBSS沖洗,剪碎,移入含DMEM/F12、EGF、FGF的全生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基,用吸管吹打制成單細(xì)胞懸液,移入培養(yǎng)瓶;原代細(xì)胞克隆形成后再次機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液,每7-10天傳代一次,方法同前;低溫保存時(shí),全生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10%DMS0 ;在傳代同時(shí)并進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn),用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)Nestin、ECAM確定細(xì)胞類型;
(2)依賴EGF和FGF的神經(jīng)球細(xì)胞在不同外源性因子作用下的培養(yǎng)及分化 依賴EGF和FGF的神經(jīng)球細(xì)胞轉(zhuǎn)移到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板,在EGF或FGF和以下一種或數(shù)種因子聯(lián)合作用下培養(yǎng)4-8天:H)GF、NT-3, BDNF, NGF, EGF、FCS, FGF、順式視黃酸;免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)Nestin、ECAM、NeuN確定細(xì)胞類型;
(3)含HIF-1α、BDNF序列的重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建
1)鼠HIF-1α的克隆:鼠肝癌細(xì)胞系IfepalclcTjaffi總RNA? HIF-1 a cDNA (核心序列約2.5Kb) 重組質(zhì)粒一轉(zhuǎn)化細(xì)菌一篩選菌落,
2)質(zhì)粒pGEM-3zf(+)-GDNF由中科院分子免疫中心提供,轉(zhuǎn)化細(xì)菌一篩選菌落,
3)目的基因的陽(yáng)離子脂質(zhì)體的包裝和測(cè)定,
4)表達(dá)載體的鑒定:酶切、瓊脂糖凝膠電泳及聚丙烯酰胺電泳分析HIF-1α、GDNF基因并驗(yàn)證其表達(dá)的正確性;
(4)大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染及分析:含目的基因的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞共同孵育I小時(shí),然后置于含G418的細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24小時(shí),收集新霉素抗性克??;臺(tái)盤藍(lán)染色,至移植時(shí),在HBSS中分離成單細(xì)胞懸液,重新放于全生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基,確定細(xì)胞活性及密度為IO5細(xì)胞/μ 1,移植后,剩余的細(xì)胞行組織化學(xué)法及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)類型等,并檢測(cè)β -gal與⑶NF、HIF-1 α表達(dá)的相關(guān)性;
(5)表達(dá)產(chǎn)物的測(cè)定和生物活性 分析:采用Westernblot法和Slot blot法驗(yàn)證⑶NF、HIF-1 α的表達(dá),應(yīng)用Ε8雞胚DRG檢測(cè)⑶NF的生物活性;采用Western blot法、免疫組織化學(xué)法從蛋白質(zhì)水平測(cè)定HIF-1 α的生物活性。
[0016]膠質(zhì)源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Glialcellline-derived neurotrophic factor, GDNF)主要由神經(jīng)元產(chǎn)生,對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的分化、發(fā)育、生長(zhǎng)等方面具有重要的作用。在脊髓損傷動(dòng)物模型上應(yīng)用表明,它能夠防止脊髓神經(jīng)元萎縮、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)及促進(jìn)神經(jīng)通路的再生。低氧誘導(dǎo)因子I ct (hypoxia-1nducible factor I α,HIF-1 α )作為轉(zhuǎn)錄因子,能反式作用于氧調(diào)芐基因的順式調(diào)控序列,促進(jìn)無(wú)氧代謝、血管再生、血管擴(kuò)張、紅細(xì)胞生成增加等,從而使受損脊髓更好的耐受缺血缺氧,為脊髓損傷的恢復(fù)創(chuàng)造時(shí)機(jī)。
[0017]陽(yáng)離子脂質(zhì)體是一種擁有質(zhì)子氨基群和每個(gè)3段區(qū)域就有一個(gè)高陽(yáng)離子區(qū)的化合物,其可形成微小顆粒通過(guò)碰撞等物理行為經(jīng)過(guò)細(xì)胞胞吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),另外,脂質(zhì)體包含類似細(xì)胞內(nèi)的核小體和溶酶體的結(jié)構(gòu)能保護(hù)DNA免于胞內(nèi)核酸酶的降解,穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因進(jìn)入細(xì)胞。
[0018]基于上述考慮,將表達(dá)膠質(zhì)源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(⑶NF)及低氧誘導(dǎo)因子Ia(HIF-Ια )的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞采用脊髓內(nèi)細(xì)胞移植的方法,通過(guò)大鼠脊髓損傷模型,以觀察基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)損傷脊髓軸突再生、神經(jīng)元再生的影響,以及神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的分化;并觀察大鼠脊髓損傷治療前后行為功能的變化,來(lái)評(píng)價(jià)基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞脊髓內(nèi)細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓損傷的作用。
[0019]上述方法的得到的干細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn):
1:所有動(dòng)物都應(yīng)用環(huán)孢菌素A,以抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)。
[0020]2:動(dòng)物模型的制作:采用顯微神經(jīng)外科手術(shù)方法,行大鼠頸髓3-4右側(cè)半部分切除,包括全部脊髓側(cè)索、部分腹側(cè)索及脊髓灰質(zhì)(正常對(duì)照組不行手術(shù))。將含有細(xì)胞培養(yǎng)基的Gelfoam填入脊髓損傷創(chuàng)腔,然后用微量注射器(針頭直徑50 μ m)注入細(xì)胞密度為IO5細(xì)胞/μ I的細(xì)胞培養(yǎng)基10 μ I ;用10號(hào)絲線縫合硬脊膜,逐層縫合肌肉和皮膚。
[0021]3:動(dòng)物分組:體重250克-300克、雌性、SD (Sprague Dawley)大鼠282只,分成五組:
A組(20只):正常對(duì)照組,其中3只行FG逆行示蹤法顯示紅核神經(jīng)元,6只行BDA順行示蹤法顯示紅核脊髓束纖維,其余行細(xì)胞凋亡檢查。
[0022]B組(64只):損傷對(duì)照組,予Gelform治療,分I月、2月、6月三個(gè)時(shí)間組,每個(gè)時(shí)間組大鼠分別行FG、BDA、TUNEL、流式細(xì)胞儀、免疫化學(xué)等檢查;每周一次觀察大鼠行為變化,并取8只大鼠于13周、8只大鼠于24周重新行脊髓損傷并每周一次觀察其行為變化,8周后處死,行FG、BDA、免疫化學(xué)檢查。
[0023]C組(70只):⑶NF、HIF_1 α雙基因修飾脊髓神經(jīng)干細(xì)胞治療組,并分I月、2月、6月三個(gè)時(shí)間組,每個(gè)時(shí)間組大鼠分別行FG、BDA、TUNEL、流式細(xì)胞儀、免疫化學(xué)等檢查;每周一次觀察大鼠行為變化,并取8只大鼠于13周、8只大鼠于24周重新行脊髓損傷并每周一次觀察其行為變化,8周后處死,行FG、BDA、免疫化學(xué)檢查。另取6只大鼠于I周后處死,以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
[0024]D組(64只):單純脊髓神經(jīng)干細(xì)胞治療組,并分I月、2月、6月三個(gè)時(shí)間組,每個(gè)時(shí)間組大鼠分別行FG、BDA、 TUNEL、流式細(xì)胞儀、免疫化學(xué)等檢查;每周一次觀察大鼠行為變化,并取8只大鼠于13周、8只大鼠于24周重新行脊髓損傷并每周一次觀察其行為變化,8周后處死,行FG、BDA、免疫化學(xué)檢查。[0025]E組(64只):單純基因治療組,并分I月、2月、6月三個(gè)時(shí)間組,每個(gè)時(shí)間組大鼠分別行FG、BDA、TUNEL、流式細(xì)胞儀、免疫化學(xué)等檢查;每周一次觀察大鼠行為變化;并取8只大鼠于13周、8只大鼠于24周重新行脊髓損傷并每周一次觀察其行為變化,8周后處死,并行FG、BDA、免疫化學(xué)檢查。
然后對(duì)標(biāo)本處理及檢測(cè):
接受各種處理的動(dòng)物,常規(guī)飼養(yǎng),分時(shí)處死動(dòng)物,按不同要求處理標(biāo)本,進(jìn)行檢測(cè)。
[0026]1:采用X-gal組織化學(xué)法、Western blot法和Slot blot法、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)GDNF、HIF-1的表達(dá)、移植細(xì)胞的存活及在體內(nèi)的分化、與創(chuàng)腔的關(guān)系、與再生神經(jīng)纖維的關(guān)
系O
[0027]2:免疫組織化學(xué)法、組織化學(xué)法檢測(cè)宿主對(duì)移植物的反應(yīng),創(chuàng)腔組織修復(fù)類型。
[0028]3:組織化學(xué)法、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)體內(nèi)的紅核脊髓束纖維、再生的紅核脊髓束纖維,與移植物的關(guān)系、與周圍組織的關(guān)系。
[0029]4:組織化學(xué)法、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)體內(nèi)的紅核神經(jīng)元及再生的紅核神經(jīng)元,并計(jì)數(shù),觀察其形態(tài)。
[0030]5 =TUNEL末端標(biāo)記法檢測(cè)各組組織切片細(xì)胞凋亡,流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法測(cè)定各組細(xì)胞凋亡率。
[0031]6:采用大鼠自發(fā)垂直探詢法檢測(cè)大鼠前肢的活動(dòng),同時(shí)監(jiān)測(cè)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP)和脊髓體感誘發(fā)電位(SCEP)。13周及24周后重新行大鼠頸髓3_4右側(cè)半部分切除,重新觀察動(dòng)物行為的變化。并檢測(cè)體內(nèi)的紅核脊髓束纖維、再生的紅核脊髓束纖維、紅核神經(jīng)元、神經(jīng)干細(xì)胞的存活及分化。
【權(quán)利要求】
1.干細(xì)胞在外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作用下分化及鑒定的方法,包括有以下步驟: (1)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的分離和擴(kuò)增 嚴(yán)格無(wú)菌條件下,在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中取出胚胎大鼠脊髓,用HBSS沖洗,剪碎,移入含DMEM/F12、EGF、FGF的全生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基,用吸管吹打制成單細(xì)胞懸液,移入培養(yǎng)瓶;原代細(xì)胞克隆形成后再次機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液,每7-10天傳代一次,方法同前;低溫保存時(shí),全生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10%DMS0 ;在傳代同時(shí)并進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn),用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)NestiruECAM確定細(xì)胞類型; (2)依賴EGF和FGF的神經(jīng)球細(xì)胞在不同外源性因子作用下的培養(yǎng)及分化 依賴EGF和FGF的神經(jīng)球細(xì)胞轉(zhuǎn)移到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板,在EGF或FGF和以下一種或數(shù)種因子聯(lián)合作用下培養(yǎng)4-8天:H)GF、NT-3, BDNF, NGF, EGF、FCS, FGF、順式視黃酸;免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)Nestin、ECAM、NeuN確定細(xì)胞類型; (3)含HIF-1a、BDNF序列的重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建
1)鼠HIF-1α的克隆:鼠肝癌細(xì)胞系IfepalclcTjaffi總RNA? HIF-1 a cDNA (核心序列約2.5Kb) 重組質(zhì)粒一轉(zhuǎn)化細(xì)菌一篩選菌落, 2)質(zhì)粒pGEM-3zf(+)-GDNF由中科院分子免疫中心提供,轉(zhuǎn)化細(xì)菌一篩選菌落, 3)目的基因的陽(yáng)離子脂質(zhì)體的包裝和測(cè)定, 4)表達(dá)載體的鑒定:酶切、瓊脂糖凝膠電泳及聚丙烯酰胺電泳分析HIF-1a、GDNF基因并驗(yàn)證其表達(dá)的正確性; (4)大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染及分析:含目的基因的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞共同孵育I小時(shí),然后置于含G418的細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24小時(shí),收集新霉素抗性克隆;臺(tái)盤藍(lán)染色,至移植時(shí),在HBSS中分離成單細(xì)胞懸液,重新放于全生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基,確定細(xì)胞活性及密度為IO5細(xì)胞/μ 1,移植后,剩余的細(xì)胞行組織化學(xué)法及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)類型等,并檢測(cè)β -gal與⑶NF、HIF-1 α表達(dá)的相關(guān)性; (5)表達(dá)產(chǎn)物的測(cè)定和生物活性分析:采用Westernblot法和Slot blot法驗(yàn)證⑶NF、HIF-1 α的表達(dá),應(yīng)用Ε8雞胚DRG檢測(cè)⑶NF的生物活性;采用Western blot法、免疫組織化學(xué)法從蛋白質(zhì)水平測(cè)定HIF-Ια的生物活性。
【文檔編號(hào)】C12N15/861GK103695374SQ201310724168
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】陳茂華 申請(qǐng)人:溫州市中心醫(yī)院