一種α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉Afm78（Asperillus?niger?Afm78），已于2013年11月12日保存于位于北京市朝陽區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC），菌株保藏編號(hào)為CGMCC?No.8470。本發(fā)明以黑曲霉CGMCC?No.8245為出發(fā)菌株，利用紫外誘變方法得到一株高產(chǎn)α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的突變菌株黑曲霉Afm78（Asperillus?niger?Afm78），其發(fā)酵酶活高達(dá)6699U/mL，比出發(fā)菌提高了54%。所述黑曲霉Afm78表達(dá)的α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，可廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域。其中在低聚異麥芽糖漿生產(chǎn)中添加本發(fā)明所述α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，能使轉(zhuǎn)苷效率提高50%以上，得到的產(chǎn)品中異麥芽低聚糖的質(zhì)量體積比達(dá)到92%以上，市場(chǎng)前景廣闊。
【專利說明】一種Cl-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶(a -transglucosidase E.C.2.4.1.24)能夠從低聚糖類底物的非還原性末端切開α-1、4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，或?qū)⒂坞x出的葡萄糖殘基以α_1、6糖苷鍵轉(zhuǎn)移到另一個(gè)糖類底物上，從而得到非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖(簡(jiǎn)稱頂0，主要包括異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖及四糖以上的低聚糖)、糖脂或糖肽等。該酶既具有水解能力，又可以專一地進(jìn)行葡萄糖苷鍵的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，是生產(chǎn)低聚異麥芽糖的必需酶制劑之一。
[0003]α -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶在自然界中分布廣泛，種類繁多，性質(zhì)各異，幾乎存在于所有生物體內(nèi)，在人類的糖原降解及動(dòng)物、植物和微生物的糖類代謝方面具有重要的生理功能，該酶主要應(yīng)用于生產(chǎn)低聚異麥芽糖。MO作為功能性低聚糖，攝入后不被人體消化吸收，也不易被大腸中的多數(shù)腐敗細(xì)菌所利用，但MO是人類腸道有益菌群雙歧桿菌的增殖因子，能作為雙歧桿菌的碳源而被利用，具有促進(jìn)腸道有益菌群增值、潤(rùn)腸通便、調(diào)節(jié)血脂、低甜度、低熱量等獨(dú)特功效。作為一種功能性食品原料，頂O已被廣泛用于各種食品的制造如乳制品、糖果類、焙烤食品、飲料、酒類、肉制品、嬰幼兒食品等。
[0004]目前工業(yè)上已經(jīng)有以淀粉或麥芽糖為原料，通過酶法生產(chǎn)低聚異麥芽糖的工藝，但是已有的生產(chǎn)工藝轉(zhuǎn)化率并不高。此外，雖然我國(guó)異麥芽糖產(chǎn)量很高，α_轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶作為低聚異麥芽糖生產(chǎn)中最關(guān)鍵的酶制劑的用量很大，但國(guó)內(nèi)卻一直沒有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，該酶仍然依賴進(jìn)口，這些限制因素都極大制約了國(guó)內(nèi)低聚異麥芽糖的生產(chǎn)。因此，本領(lǐng)域亟需獲得高活性的α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶及其相應(yīng)的更加穩(wěn)定、高產(chǎn)α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的生產(chǎn)菌株，以適應(yīng)低聚異麥芽糖生產(chǎn)工藝的需要，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的生產(chǎn)菌株，該菌株是以黑曲霉(Asperillus niger) CGMCC N0.8245為出發(fā)菌株，通過紫外誘變的方法對(duì)其進(jìn)行突變，最終篩選到一株高產(chǎn)α -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉突變菌株，從而有利于促進(jìn)α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的廣泛應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)α -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉Afm78 (Asperillus nigerAfm78),已于2013年11月12日保存于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，菌株保藏編號(hào)為 CGMCC N0.8470。
[0007]用于作為起始誘變的黑曲霉(Asperillus niger) Af7株,于2013年9月25日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8245。[0008]本發(fā)明所述黑曲霉Afm78用于生產(chǎn)a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶。
[0009]本發(fā)明以黑曲霉CGMCC N0.8245為出發(fā)菌株，利用紫外誘變方法得到一株高產(chǎn)a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的突變菌株黑曲霉Afm78(Asperillus niger Afm78),其發(fā)酵酶活高達(dá)6699U/mL，比出發(fā)菌提高了 54%。所述黑曲霉Afm78表達(dá)的a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，可廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域。其中在低聚異麥芽糖漿生產(chǎn)中添加本發(fā)明所述a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，能使轉(zhuǎn)苷效率提高50%以上，得到的產(chǎn)品中異麥芽低聚糖的質(zhì)量體積比達(dá)到92%以上，市場(chǎng)前景廣闊。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1:本發(fā)明的突變菌株黑曲霉Afm78發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳檢測(cè)圖，其中泳道I所示為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記，由上至下為116.0kD, 66.2kD，45.0kD, 35.0kD, 25.0kD,18.4kDa和14.4kD ;泳道2所示為出發(fā)菌株Asperillus niger CGMCC N0.8245發(fā)酵上清液中蛋白表達(dá)情況；泳道3所示為突變菌株黑曲霉Afm78發(fā)酵上清液中蛋白表達(dá)情況，箭頭所指109kDa處的蛋白條帶即為重組表達(dá)的a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶；
[0011]圖2: a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的相對(duì)酶活與pH的曲線圖；
[0012]圖3: a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的相對(duì)酶活與溫度的曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]本發(fā)明用到了在遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法。例如 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)等參考書中所記載的技術(shù)。但是，這并不意味著將本發(fā)明限定于具體實(shí)施例中所述的具體方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以選用已公開的技術(shù)來實(shí)施本發(fā)明實(shí)施例中記載的方案。
[0014]本發(fā)明中，核酸是按5'至3'方向從左至右書寫；氨基酸是按氨基至羧基的方向從左至右書寫。
[0015]本發(fā)明說明書中記載的低聚異麥芽糖和異麥芽低聚糖可互換使用，都指選自下組的一種或多種糖:異麥芽糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖、或潘糖。此外，應(yīng)理解，所述的術(shù)語還包括上述糖的混合物。
[0016]本發(fā)明所記載的a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，又稱為a-D-葡萄糖苷水解酶，能切開麥芽糖和麥芽低聚糖分子結(jié)構(gòu)中a -1, 4糖苷鍵，并能將游離出來的一個(gè)葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個(gè)葡萄糖分子或麥芽糖或麥芽三糖等分子中的a -1, 6位上，其轉(zhuǎn)糖苷作用可將低聚糖中的a-l，4糖苷鍵轉(zhuǎn)化成a-1，6糖苷鍵或其他形式的鏈接，從而得到非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖或糖酯、糖肽等。
[0017]基因指參與生產(chǎn)多肽的DNA片段，包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，以及各編碼片段(外顯子)之間的 插入序列(內(nèi)含子)。
[0018]核酸包括DNA、RNA,單鏈或雙鏈的，以及它們的化學(xué)修飾物；核酸與多核苷酸在本說明書中可以互換使用。
[0019]宿主菌株或宿主細(xì)胞是指表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物的合適宿主，所述表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物包含本發(fā)明的編碼a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優(yōu)選地是絲狀真菌細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是野生型絲狀真菌宿主細(xì)胞或者經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”指由絲狀真菌菌株細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞核原生質(zhì)體。
[0020]絲狀真菌指所有絲狀形式的真菌亞門生物(參見INTRODUCTORY MYCOLOGY, 4thEd.(Alexopoulos,2007)和 AINSWORTH AND BISBY DICTIONARY OF THE FUNGI, 10thEd.(Kirk et al.，2008))。這些真菌的特征是帶有由幾丁質(zhì)、纖維素和其他復(fù)雜多糖組成的細(xì)胞壁的營(yíng)養(yǎng)菌絲體。本發(fā)明所述的絲狀真菌在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)上不同于酵母。絲狀真菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過菌絲的延伸來完成的，碳代謝是專性需氧的。在本發(fā)明中，絲狀真菌親代細(xì)胞可以使，但不限于，曲霉屬某種(Aspergillus sp.)(例如棒曲霉(A.clavatus)、煙曲霉(A.fumigatus)、泡盛曲霉(A.awamori)、黃曲霉(A.f Iavus)，土曲霉(A.terreus)和米曲霉(A.0ryzae))、青霉屬某種(Penicillium sp.)(例如產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum))、新薩托菌屬某種(Neosartorya sp.)(例如費(fèi)希新薩托菌(N.fischeri))、粘帚霉菌屬某種(Gliocladium sp.)(例如粉紅粘帚霉(G.roseum))、木霉屬某種(Trichoderma sp.)(例如里氏木霉(T.reesei)、綠色木霉(T.viride)、康寧木霉(T.koningii)、哈茨木霉(T.harzianum))、腐質(zhì)霉屬某種(Humicola sp.)(例如特異腐質(zhì)霉(H.1nsolens)和灰腐質(zhì)霉(H.grisea))、金孢霉屬某種(Chrysosporium sp.)、鐮刀菌屬某種(Fusarium sp.)、脈孢霉屬某種(Neurospora sp.)、肉座菌屬某種(Hypocrea sp.)和裸孢殼屬某種(Emericella sp.)的細(xì)胞。
[0021]本發(fā)明所涉及的曲霉或曲霉屬某種是指以前或目前被分類為曲霉屬的任何真菌
屬。
[0022]本發(fā)明中的酶表達(dá)的分析和酶活力的測(cè)定方法如下:
[0023]為了評(píng)價(jià)α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的表達(dá)，可以在蛋白水平或核酸水平進(jìn)行分析。可以應(yīng)用的分析方法包括Northern印跡、斑點(diǎn)印跡(DNA或RNA分析)、Southern印跡、放射自顯影、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和含有適當(dāng)標(biāo)記的探針(基于核酸編碼序列)進(jìn)行的原位雜交。此外，基因表達(dá)可以通過免疫學(xué)方法，諸如細(xì)胞、組織切片的免疫組織化學(xué)染色或者組織培養(yǎng)基的免疫試驗(yàn)。例如通過Western印跡或ELISA來評(píng)估。這樣的免疫試驗(yàn)可以用于定性地和定量地評(píng)價(jià)α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶(諸如Afm78)的表達(dá)。此類方法的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且用于實(shí)施此類方法的許多試劑是可商業(yè)獲得的。在一些實(shí)施方式中，α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶(諸如Afm78)的表達(dá)通過SDS-PAGE進(jìn)行分析。
[0024]實(shí)施例1:紫外誘變與篩選
[0025]出發(fā)菌株:黑曲霉(Asperillus niger) CGMCC N0.8245是通過將來源于煙曲霉(Aspergillus fumigatus)的α -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶基因轉(zhuǎn)化入黑曲霉宿主菌Gl中，構(gòu)建得到的能異源表達(dá)α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉工程菌。
[0026]1.1紫外誘變方法
[0027](I)將出發(fā)菌株Asperillus niger CGMCC N0.8245接種到CMA斜面上活化，在37°C下培養(yǎng)4d ；
[0028](2)用3ml無菌的0.l%Tween-80洗滌活化的新鮮斜面制得孢子懸液，吸取IOul置于血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果稀釋孢子懸液至孢子數(shù)目約為IO6個(gè)/ml左右；
[0029](3)吸取5ml稀釋后的孢子懸液置于9cm培養(yǎng)皿中，在紫外燈30w、照射距離22cm、照射時(shí)間4min的條件下進(jìn)行紫外誘變；[0030](4)紫外照射完畢后，將誘變后的孢子懸液稀釋100倍，吸取稀釋后的孢子懸液涂布CMA平板，每個(gè)CMA平板涂IOOul，約涂100個(gè)平板左右，在37°C下避光培養(yǎng)40h ；
[0031](5)培養(yǎng)40h后，挑取平板上長(zhǎng)出的個(gè)體形態(tài)小、菌絲濃密且緊實(shí)的突變菌落，于另一 CMA平板上進(jìn)行劃線純化，劃線平板在37°C下培養(yǎng)40h ；
[0032](5)挑出約100個(gè)劃線平板上長(zhǎng)出的單菌落，接種至CMA斜面，在37°C下培養(yǎng)4天以上；
[0033]CMA平板:20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白胨，15g瓊脂，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0034]1.2突變菌株的篩選
[0035]1、初篩
[0036]根據(jù)CMA斜面上誘變菌株的生長(zhǎng)情況，挑選長(zhǎng)勢(shì)相近的誘變菌株分批進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，同時(shí)以出發(fā)菌株作對(duì)照。發(fā)酵采用一步搖瓶發(fā)酵法:將黑曲霉誘變菌株的孢子懸浮液分別接種于20mL TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株接I瓶，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)5d ;將所得發(fā)酵液用8層紗布過濾，濾液在14000 Xg條件下離心lOmin，收集上清液；將上清液在濃度為12%的SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳，通過觀察比較a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶重組蛋白條帶的表達(dá)量，挑選出16株比出 發(fā)菌株表達(dá)效率提高的突變菌株。
[0037]2、復(fù)篩
[0038]將挑選出的16株突變菌株再次進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，同時(shí)以出發(fā)菌株作對(duì)照。發(fā)酵采用兩步搖瓶發(fā)酵法:將黑曲霉誘變菌株的孢子懸浮液接種于20ml CLS發(fā)酵培養(yǎng)基中，在300C，200rpm的條件下培養(yǎng)48h ;然后按10%接種量，吸取2ml CSL培養(yǎng)液菌體接種于20mLTSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)5d ;將所得發(fā)酵液用8層紗布過濾，濾液在 14000 Xg 條件下離心 IOmin,收集上清液；用 Econo-PaclODG Columns (BO1-RAD)對(duì)上清液進(jìn)行脫鹽除糖處理；然后將其進(jìn)行12%SDS-PAGE檢測(cè)分析并測(cè)定酶活；最終挑選出一株a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶表達(dá)量最高的突變菌株，命名為黑曲霉Afm78 (AspergillusnigerAfm78)，并于2013年11月12日保藏于北京市朝陽區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，菌株保藏編號(hào)為CGMCCN0.8470。
[0039]a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶活力測(cè)定方法
[0040]采用中華人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB2525-2001，將a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶作用于底物a-甲基-D-葡萄糖苷生成葡萄糖，所生成的葡萄糖與含有葡萄糖氧化酶、過氧化酶的4-氨基安替比林(4-Aminoantipyrin)和酹試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)來定量測(cè)定。
[0041]具體測(cè)定方法包括:吸取2% a -甲基-D-葡萄糖苷底物溶液Iml和0.02mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5.0)lml加入試管(15mmX150mm)內(nèi)，在(50±0.5) °C的恒溫水浴箱中保溫lOmin。加入樣品酶液0.5ml，混勻，于(50±0.5)°C的恒溫水浴箱中準(zhǔn)確保溫60min后，將試管轉(zhuǎn)移至沸水浴中加熱5min,然后用流水快速冷卻。冷卻后，吸此溶液0.1ml到試管中，并加入4-氨基安替比林-苯酚顯色劑3ml，混勻。將此試管放入(40±0.5) °C的恒溫水浴中保溫20min，測(cè)定500nm處的吸光度，根據(jù)吸光度值計(jì)算a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶活力(U/ml),即在此試驗(yàn)條件下,在反應(yīng)混合物2.5ml中，60min產(chǎn)生I y g葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶活力單位。[0042]TSB 發(fā)酵培養(yǎng)基:12g NaNO3,0.5g KCl，1.5g KH2PO4, 2.05gMgS04 ? 7H20，3.5gNaH2PO4 ? H20，45g胰蛋白大豆肉湯，70g檸檬酸鈉，Ig吐溫80，ImL痕量元素(見下)，加入dlH20至終體積700mL，高壓蒸氣滅菌后加入300mL用0.22 y m的微孔濾膜過濾除菌的40%
麥芽糖。
[0043]痕量元素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4 ? 7H20，8.8g ZnSO4 ? 7H20，0.4gCuSO4 *5H20,0.15g MnSO4 *4H20,0.1g Na2B4O7 ? IOH2O, 50mg (NH4) 6Mo7024 ? 4H20，0.2mL 濃 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0.22 ii m的微孔濾膜過濾除菌。
[0044]TSB 發(fā)酵培養(yǎng)基:12g NaNO3,0.5g KCl，1.5g KH2PO4, 2.05gMgS04 ? 7H20，3.5gNaH2PO4 ? H20，45g胰蛋白大豆肉湯，70g檸檬酸鈉，Ig吐溫80，ImL痕量元素(見下)，加入dlH20至終體積700mL，高壓蒸氣滅菌后加入300mL用0.22 y m的微孔濾膜過濾除菌的40%
麥芽糖。
[0045]痕量元素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4 ? 7H20，8.8g ZnSO4 ? 7H20，0.4gCuSO4 *5H20,0.15g MnSO4 *4H20,0.1g Na2B4O7 ? IOH2O, 50mg (NH4) 6Mo7024 ? 4H20，0.2mL 濃 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0.22 ii m的微孔濾膜過濾除菌。
[0046]CSL 發(fā)酵培養(yǎng)基:100g 玉米衆(zhòng)，Ig NaH2PO4 *H20,0.5g MgSO4, 100g 麥芽糖，IOg 葡萄糖，50g果糖，加入CllH2O至900mL，用固體NaOH顆粒調(diào)pH5.8后定容至1L，高壓蒸氣滅菌。
[0047]實(shí)施例2:突變菌株黑曲霉Afm78的搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證
[0048]將突變菌株黑曲霉Afm78 (CGMCC N0.8470)和出發(fā)菌株同時(shí)接種到CMA平板上培養(yǎng)4-5d，取其各自孢子懸浮液分別接種于20ml CLS發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)48h ;然后按10%接種量，吸取2ml CSL培養(yǎng)液菌體分別接種于20mL TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)5d，分別收集Afm78和出發(fā)菌株的發(fā)酵上清液；用Econo-PaclODG Columns (BO1-RAD)對(duì)上清液進(jìn)行脫鹽除糖處理，然后將其進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析，結(jié)果如圖1所示，兩株菌在109kDa處均有明顯的蛋白條帶，說明本發(fā)明獲得的突變菌株黑曲霉Afm78也能重組表達(dá)a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶；酶活測(cè)定結(jié)果顯示，出發(fā)菌株Asperillus niger CGMCC N0.8245的發(fā)酵酶活為4347U/mL，而突變株黑曲霉Afm78的發(fā)酵酶活高達(dá)6699U/mL，比出發(fā)菌提高了 54%。而突變菌株傳代后，重組表達(dá)a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的效率并沒有明顯的變化，說明突變后的菌株的遺傳性狀保持穩(wěn)定。
[0049]實(shí)施例3:酶學(xué)性質(zhì)分析
[0050]用pH值為 2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0、11.0 的緩沖液稀釋實(shí)施例 2
所述出發(fā)菌和突變菌的發(fā)酵上清液，分別測(cè)定其酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，做作用PH-相對(duì)酶活曲線。結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明的突變株黑曲霉Afm78表達(dá)的a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶與出發(fā)菌相比，作用PH-相對(duì)酶活曲線并未發(fā)生變化，最適作用PH值均為5.0。
[0051]分別在30°c、40°c、5(rc、6(rc、7(rc、8(rc、9(rc，PH5.0 條件下測(cè)定實(shí)施例 2 所述出發(fā)菌和突變菌發(fā)酵上清液酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，做溫度-相對(duì)酶活曲線。結(jié)果如圖3所示，本發(fā)明的突變株黑曲霉Afm78表達(dá)的a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶與出發(fā)菌相比，作用溫度-相對(duì)酶活曲線并未發(fā)生變化，最適作用溫度均為60°C。
[0052]上述結(jié)果表明，本發(fā)明獲得的突變株黑曲霉Afm78的突變并未引起其表達(dá)的a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生失活突變，而只是表達(dá)效率得到了提高。
[0053]實(shí)施例4: a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶在食品領(lǐng)域的應(yīng)用[0054]作為一種功能性食品原料，低聚異麥芽糖漿已被廣泛用于各種食品的制造如乳制品、糖果類、焙烤食品、飲料、酒類、肉制品、嬰幼兒食品等。
[0055]工業(yè)上生產(chǎn)低聚異麥芽糖漿，以淀粉為原料，加水制成30%粉漿，在pH值為
6.0-7.0、溫度為90~120°C條件下，經(jīng)耐熱性α -淀粉酶液化后，在pH值為5.0、溫度為60°C的條件下，用β_淀粉酶、普魯蘭酶和真菌α-淀粉酶同時(shí)作用，轉(zhuǎn)化成麥芽糖后，加入本發(fā)明所述突變株黑曲霉Afm78表達(dá)的α -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶進(jìn)行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)生成異麥芽糖、異麥芽三糖、四糖及五糖等含α-1，6鍵的分支低聚糖與潘糖。結(jié)果表明，本發(fā)明所述α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶可使其轉(zhuǎn)化率明顯提高50%以上。
[0056]將上述轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的產(chǎn)物經(jīng)活性炭脫色、離子交換樹脂脫鹽，濃縮到固形物為60-70%，得到普通異麥芽糖漿，其中異麥芽低聚糖質(zhì)量體積比為45%~55%，葡萄糖質(zhì)量體積比約為35%-40% ;再將異麥芽糖漿中的葡萄糖用酵母發(fā)酵或膜過濾除去，便可得到含異麥芽低聚糖質(zhì)量體積比為92%以上的產(chǎn)品。
[0057]上述結(jié)果表明本發(fā)明所述突變菌株黑曲霉Afm78表達(dá)的轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，可廣泛應(yīng)用于低聚異麥芽糖漿的生 產(chǎn)，市場(chǎng)前景廣闊。
【權(quán)利要求】
1.一種黑曲霉菌株，其特征在于，所述的黑曲霉菌株的保藏編號(hào)為CGMCC N0.8470。
2.權(quán)利要求1所述的黑曲霉菌株，是以保藏編號(hào)為CGMCCN0.8245的黑曲霉為出發(fā)菌株，利用紫外誘變方法得到的。
3.權(quán)利要求1所述的黑曲霉菌株在生產(chǎn)a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/10GK103740599SQ201310714695
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】王華明, 訾禎禎 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司, 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所