鑒定、合成、優(yōu)化和表征蛋白調(diào)節(jié)劑的化合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及鑒定、合成、優(yōu)化和識別為蛋白質(zhì)抑制劑或活化劑的化合物，所述蛋白質(zhì)為天然存在的內(nèi)源性蛋白質(zhì)及某些內(nèi)源性蛋白質(zhì)的變體形式，并涉及鑒定所述變體的新方法。通過命中鑒定的改進(jìn)、先導(dǎo)優(yōu)化、生物識別和毒性化合物的快速排除，使藥物發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)方法簡化，從而，所述方法加速了作為潛在治療有效藥物的化合物的鑒定和研發(fā)。由于效率的相應(yīng)增加，該實(shí)施導(dǎo)致藥物發(fā)現(xiàn)過程中的總成本降低。
【專利說明】鑒定、合成、優(yōu)化和表征蛋白調(diào)節(jié)劑的化合物和方法
[0001]本申請是申請日為2006年11月24日、申請?zhí)枮?00680051498.8、發(fā)明名稱為“鑒定、合成、優(yōu)化和表征蛋白調(diào)節(jié)劑的化合物和方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002]相關(guān)申請的交叉引用
[0003]本申請是2006年8月29日提交的PCT國際申請PCT/US06/33890的部分繼續(xù)申請，PCT/US06/33890是2005年5月23日提交的PCT國際申請PCT/US2005/18412的部分繼續(xù)申請，其要求2005年11月23日提交的U.S.Ser.N0.60/739，477、2005年11月23日提交的 U.S.Ser.N0.60/739，476,2005 年 12 月 2 日提交的 U.S.Ser.N0.60/741，767,2005 年 12月 16 曰提交的 U.S.Ser.N0.60/751，030、2006 年 3 月 13 曰提交的 U.S.Ser.N0.60/783，106、2006 年 3 月 23 日提交的 U.S.Ser.N0.60/785, 904、2006 年 3 月 23 日提交的 U.S.Ser.N0.60/785，817 和 2006 年 4 月 4 日提交的 U.S.Ser.N0.60/789，379 的優(yōu)先權(quán)。 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明涉及鑒定、合成、優(yōu)化和表征為蛋白質(zhì)抑制劑或活化劑的化合物，所述蛋白質(zhì)為天然存在的內(nèi)源性蛋白質(zhì)及某些內(nèi)源性蛋白質(zhì)的變體形式，并涉及鑒定所述變體的新方法。通過命中鑒定的改進(jìn)、先導(dǎo)優(yōu)化、生物識別和毒性化合物的快速排除使藥物發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)方法簡化，所述方法加速了作為潛在治療有效藥物的化合物的鑒定和研發(fā)。由于效率的相應(yīng)增加，該實(shí)施導(dǎo)致藥物發(fā)現(xiàn)過程中的總成本降低。
[0005]發(fā)明背景
[0006]針對存在人細(xì)胞中的選擇性蛋白質(zhì)靶的現(xiàn)代新藥物的發(fā)現(xiàn)/生產(chǎn)方法的重要組成包括:
[0007]1.鑒定抑制或活化所選靶蛋白質(zhì)的〃命中〃化合物。(基于這些目的，定義命中為在給定的測試中得分為正的化合物并可具有一些研究者希望的效果和藥學(xué)性質(zhì)。然而，在現(xiàn)代藥學(xué)研究中，實(shí)際上命中只有在實(shí)質(zhì)性進(jìn)一步修飾后才能成為最終的臨床候選)；
[0008]2.選擇先導(dǎo)化合物，在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究和改進(jìn)最初的命中化合物；
[0009]3.通過一系列設(shè)計(jì)主要用于改善先導(dǎo)化合物對靶蛋白質(zhì)的抑制或活化性質(zhì)的化學(xué)修飾，優(yōu)化先導(dǎo)化合物(其化學(xué)結(jié)構(gòu)與原始命中化合物相關(guān)或一致)，但所述的化學(xué)修飾還可以改善生物利用度、血漿半衰期、或降低毒性；
[0010]4.表征指定先導(dǎo)化合物的生物活性譜(包括優(yōu)化的先導(dǎo))以確定與其它非靶蛋白質(zhì)相比，其對所選的靶蛋白質(zhì)的相對特異性和選擇性，一些非靶蛋白質(zhì)與靶蛋白質(zhì)本身密切相關(guān)(例如蛋白質(zhì)家族的其它成員)；
[0011]5.設(shè)計(jì)臨床前體外和體內(nèi)動物研究以評價劑量范圍、致癌性、吸收、分配、代謝、排泄、藥代動力學(xué)、口服生物利用度(如果需要的話)、藥效學(xué)、毒性和相關(guān)參數(shù)；
[0012]6.在健康志愿者和患有疾病的患者中進(jìn)行的臨床測試，對其而言有效的治療性處置被認(rèn)為是有益的。
[0013]本發(fā)明涉及實(shí)質(zhì)改進(jìn)上述步驟1-4的新方法。所述方法也可以用于產(chǎn)生和優(yōu)化化合物，所述化合物比用目前采用的標(biāo)準(zhǔn)且簡單的方法鑒定、優(yōu)化或表征的典型實(shí)驗(yàn)藥物有效得多且毒性低得多。
[0014]作為努力研發(fā)先進(jìn)新藥學(xué)技術(shù)的一部分，研發(fā)了本文描述的方法，通過發(fā)明可預(yù)測、可信賴的方法學(xué)，將所述藥學(xué)技術(shù)將“藥物發(fā)現(xiàn)”過程變成一個被更精確地描述為“藥物生產(chǎn)”過程，所述方法學(xué)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供必需的工具以產(chǎn)生靶向人類疾病中重要的特異性蛋白質(zhì)的新藥物，同時減少與藥物發(fā)現(xiàn)/研發(fā)方法有關(guān)的時間和高額成本。
[0015]患者中耐藥性的進(jìn)行性發(fā)展為使用許多類型藥物長期治療的標(biāo)志，尤其是在癌癥和感染性疾病的治療領(lǐng)域中。已經(jīng)鑒定了介導(dǎo)某些類型的耐藥性現(xiàn)象的分子機(jī)制，而在其它情況中，獲得的以及重新形成的耐受性的機(jī)制目前仍然未知。
[0016]最初認(rèn)為在癌癥療法領(lǐng)域中相關(guān)的誘導(dǎo)的(獲得的)耐藥性的一種機(jī)制包括稱作P-糖蛋白(P-gp)的蛋白質(zhì)表達(dá)增加。P-gp位于細(xì)胞膜中并且起藥物流出泵的作用。該蛋白質(zhì)能夠從細(xì)胞中泵出毒性化學(xué)活性劑，包括許多類型的抗癌藥。因此，P-糖蛋白的增量調(diào)節(jié)通常產(chǎn)生對多種藥物的耐藥性。P-糖蛋白在腫瘤細(xì)胞中增量調(diào)節(jié)可以代表一種防御機(jī)制，該機(jī)制在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)展以便防止受到毒性化學(xué)活性劑損害。目前已經(jīng)鑒定了具有與P-gP類似的功能的其它相關(guān)耐藥性蛋白質(zhì)，包括多藥物-抗性-相關(guān)蛋白家族成員，諸如MRPl和ABCG2。在任何情況下，在研發(fā)對指定靶蛋白具有特異性且毒性較低的化合物時，P-糖蛋白和相關(guān)ATP-結(jié)合彈夾(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在臨床顯著性耐藥性中的重要性已經(jīng)下降。
[0017]另一種可能的獲得性耐藥的分子機(jī)制在于可選的信號途徑導(dǎo)致持續(xù)的細(xì)胞存活和代謝，即使原始藥物仍然對其靶標(biāo)有效。此外，藥物胞內(nèi)代謝的改變也可以導(dǎo)致治療功效喪失。此外，可以發(fā)生基因表達(dá)和基因擴(kuò)增結(jié)果的改變，從而導(dǎo)致指定靶蛋白的表達(dá)增加或減少，并且通常需要增加藥物劑量以便維持相同作用(Adcock和Lane，2003)。
[0018]突變誘導(dǎo)的耐藥性通常為感染性疾病領(lǐng)域中出現(xiàn)的情況。例如，已經(jīng)研發(fā)了幾種抑制在人免疫缺陷(HIV)病毒基因組中編碼的病毒逆轉(zhuǎn)錄酶或病毒蛋白酶的藥物。在文獻(xiàn)中充分確立了使用例如逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑反復(fù)治療HIV-感染的AIDS患者最終產(chǎn)生了對藥物的敏感性減低的病毒突變體形式。已經(jīng)在編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的基因中出現(xiàn)的突變賦予所述酶的突變體形式受藥物的影響降低。
[0019]考慮到錯誤被引入HIV基因組的比例，在HIV治療過程中耐藥性的出現(xiàn)并不令人意外。已知HIV逆轉(zhuǎn)錄酶特別具有錯誤趨向性，其中正向突變率約為3.4xl0_5種突變/堿基對/復(fù)制循環(huán)(Mansky等，J.Virol.69:5087-94 (1995))。然而，在哺乳動物細(xì)胞中編碼的內(nèi)源性基因的類似突變率低一個數(shù)量級以上。
[0020]新的證據(jù)表明耐藥性還可能因涉及編碼藥物靶標(biāo)的基因的突變結(jié)果產(chǎn)生(Gorre等，Science, 2001 ;PCT/US02/18729)。在這種情況中，使患者接觸具體的治療物質(zhì)，諸如靶向特異性所關(guān)注的蛋白質(zhì)(Ρ0Ι或"靶"蛋白)的指定癌癥藥物后，隱含在編碼為治療物質(zhì)靶標(biāo)的蛋白質(zhì)的基因中出現(xiàn)的突變的一組細(xì)胞的過度生長。目前還不了解該細(xì)胞群的過度生長是否因已經(jīng)隱含產(chǎn)生藥物抗性的POI的突變的患者的小百分比的預(yù)先存在的細(xì)胞所致，或這類突變是否在動物或人接觸能夠活化或抑制所述`POI的治療劑過程中或之后重新產(chǎn)生。任一,清況中，這類突變結(jié)果均可以產(chǎn)生突變的蛋白(下文定義為theramutein)，它受所述治療物質(zhì)的影響程度較低或可能完全不受影響。
[0021]慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)的特征在于在該病穩(wěn)定或慢性期過程中保持分化能力的骨髓先祖(progenitor)過度增殖。多線證據(jù)已經(jīng)確立了作為某些形式的CML中的致病性癌基因的Abl酪氨酸激酶的失調(diào)。這種失調(diào)通常與稱作費(fèi)城染色體(Ph)的染色體易位相關(guān)，導(dǎo)致由與Abe I son酪氨酸激酶融合的BCR基因產(chǎn)物組成的融合蛋白表達(dá)，由此形成具有酪氨酸激酶活性的p210to_Ab1。相關(guān)的融合蛋白稱作pl90to_Ab1，其由BCR基因中的不同斷點(diǎn)產(chǎn)生并且已經(jīng)證實(shí)出現(xiàn)在具有費(fèi)城染色體陽性(Ph+)的急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)的患者中(Melo，1994 ；Ravandi等，1999)。轉(zhuǎn)化看起來因多信號途徑，包括那些涉及RAS、MYC和JUN的途徑活化所致。甲磺酸伊馬替尼(“ST1-571”或“GleevecK'M)為靶向Abi的激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點(diǎn)的2-苯氨基嘧啶(Druker等，NEJM2001，p.1038)。隨后還通過其它方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了血小板衍生的生長因子(TOGF) β受體的抑制劑和Kit酪氨酸激酶，其中后者涉及胃腸道間質(zhì)瘤的發(fā)生(參見下文)。 [0022]直到近期為止，尚未觀察到在使用指定內(nèi)源性細(xì)胞蛋白的特異性抑制劑治療的過程中，其相應(yīng)的內(nèi)源性基因中的突變可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)不同的表達(dá)，所述蛋白質(zhì)變體的細(xì)胞功能耐受所述抑制劑。Charles Sawyers和同事所做的工作(Gorre等，Science293:876-80(2001) ；PCT/US02/18729)首次證實(shí)了使用能夠抑制p210Bra_Abl酪氨酸激酶的藥物(即ST1-571)治療患者后，在編碼產(chǎn)生p210to_Abl癌的含有Abelson酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的靶蛋白的基因中隱含突變的所述患者中可能出現(xiàn)具有臨床意義的細(xì)胞群。各種這類突變產(chǎn)生p210M1的突變體形式，它們對Gleevec治療的反應(yīng)性低于產(chǎn)生最初癌癥的形式。值得注意的是，出現(xiàn)的突變對突變蛋白賦予了對蛋白激酶抑制劑藥物作用的相對抗性，同時維持了一定程度的突變蛋白激酶的原始底物特異性。在Gorre等的工作前，本領(lǐng)域技術(shù)人員一般認(rèn)為可以在接觸抑制Abelson蛋白激酶的化合物，諸如ST1-571的患者中觀察到的抗性類型可能因上述藥物抗性的其它機(jī)制中的一種或多種或由某些其它尚不了解的機(jī)制導(dǎo)致，但在任何情況下，所述的抗性均可以涉及不同于藥物靶標(biāo)POI的靶標(biāo)(蛋白質(zhì)或其它)。
[0023]因此，治療臨床相關(guān)的還為現(xiàn)存療法靶標(biāo)的蛋白質(zhì)突變體形式可能極為有用。這類突變蛋白(如下文定義的theramuteins)正在被公認(rèn)和理解為復(fù)發(fā)性癌癥中的重要靶標(biāo)，并且還在其它疾病中變得具有重要性。存在對治療劑的需求，這類治療劑對可能在一般有效藥物療法之前、過程中或之后產(chǎn)生的細(xì)胞蛋白的這類藥物抗性變體形式具有活性。本發(fā)明的一個關(guān)鍵目的在于提供一種普遍的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用所述方法從高通量篩選(HTS)系統(tǒng)中鑒定命中、產(chǎn)生和優(yōu)化先導(dǎo)化合物以及表征所述化合物的生物活性譜，而不需要依賴于較老的方法，例如無細(xì)胞的放射性配體結(jié)合測試等。本發(fā)明的另一個關(guān)鍵目的在于提供可以用作用于克服在內(nèi)源性出現(xiàn)的蛋白質(zhì)中的突變-誘導(dǎo)的耐藥性的潛在治療劑的化合物。
[0024]發(fā)明概述
[0025]本文描述的方法涉及基于細(xì)胞應(yīng)答的藥物發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)系統(tǒng)的產(chǎn)生，所述系統(tǒng)利用所定義、預(yù)先確定的細(xì)胞特征的調(diào)節(jié)(稱為表型反應(yīng))作為工具來測量指定化合物(化學(xué)試劑、調(diào)節(jié)劑)活化或抑制所選靶蛋白質(zhì)的能力。通過重復(fù)應(yīng)用該方法，可以利用本文描述的方法來鑒定蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)劑(如本文所定義的)，在所述調(diào)節(jié)劑上進(jìn)行先導(dǎo)優(yōu)化，并生物表征所述調(diào)節(jié)劑的靶蛋白質(zhì)特異性和選擇性。
[0026]可以對任何靶蛋白質(zhì)和任何真核細(xì)胞類型使用本文描述的發(fā)明，然而條件是，首先鑒定并根據(jù)本文教導(dǎo)利用本發(fā)明稱為表型反應(yīng)的一個基本兀素。所述方法的一個實(shí)施方案給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供鑒別所選靶蛋白質(zhì)的抑制劑或活性劑的能力。另一個實(shí)施方案允許本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行快速先導(dǎo)優(yōu)化研究以得到潛在的臨床候選化合物。另一個實(shí)施方案給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供設(shè)計(jì)具有對指定靶蛋白質(zhì)具有需要程度特異性以及對所述蛋白質(zhì)相對于不同但密切相關(guān)靶蛋白質(zhì)家族成員具有選擇性的化合物的能力，所述靶蛋白質(zhì)家族成員可能與某些祀一起存在。
[0027]化合物(包括已經(jīng)批準(zhǔn)的藥物)治療功效的改進(jìn)是藥學(xué)研究中一個重要的重復(fù)出現(xiàn)的問題。一個通常采用的方法是從已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)開始，然后對所述結(jié)構(gòu)進(jìn)行其他化學(xué)修飾以改進(jìn)其效力、特異性(針對靶蛋白質(zhì))、或與患者治療功效相關(guān)的其它參數(shù)。在一些情況下，起始結(jié)構(gòu)可以是已知藥物。在其它情況下可以簡單地是使用無細(xì)胞或基于原代細(xì)胞篩選試驗(yàn)鑒定的最初篩選命中。在其它情況下，所述化合物可以是基于篩選命中或其它模型結(jié)構(gòu)的以最低限度定義的最初化學(xué)結(jié)構(gòu)，且通常稱為“骨架”。就本發(fā)明目的而言，骨架定義為相對于代表性化合物除去一個或多個側(cè)鏈或環(huán)取代的化學(xué)結(jié)構(gòu)，所述代表性化合物在其他方面其具有相同的骨架。例如，表4中第三個化合物可認(rèn)為是骨架。
[0028]本發(fā)明一個重要的貢獻(xiàn)是表型反應(yīng)的使用，以及確定第一化合物相對于第二化合物的細(xì)胞特異性以便確定第一化合物相對于第二化合物是否展現(xiàn)出改進(jìn)的細(xì)胞特異性。本文描述的發(fā)明中首次報導(dǎo)的所述方法代表對現(xiàn)有技術(shù)的一個根本進(jìn)步。現(xiàn)有技術(shù)依賴于無細(xì)胞測試系統(tǒng)，其利用純化或重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)來測試化合物活性，并比較指定化合物對靶蛋白質(zhì)與對其他蛋白質(zhì)的作用，所述的其他蛋白質(zhì)與靶蛋白質(zhì)通常(密切或不密切)相關(guān)?？梢栽谖墨I(xiàn)中發(fā)現(xiàn)許多這類現(xiàn)有技術(shù)方法的實(shí)例，包括Hanke等人，1996，Warmuth 等人，US2003/0162222A1, Knight and Shokat, 2005，和其中的參考文獻(xiàn)。在鑒定和優(yōu)化指定骨架的細(xì)胞特異性和治療功效方面，所述較老類型的無細(xì)胞方法與本發(fā)明相比，效率要低得多或完全無效。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)改進(jìn)來自至少三個關(guān)鍵元素。
[0029]第一，表型反應(yīng)的概念，當(dāng)與測量指定化合物(例如通過確定其CSG來測定)的細(xì)胞特異性一起使用時，提供允許鑒定可能以改進(jìn)的、功能上更有效的方式與靶蛋白質(zhì)相互作用的化合物的系統(tǒng)。
[0030]第二，本發(fā)明提供鑒定化合物的方法，所述化合物還能與其他不同于靶蛋白質(zhì)的細(xì)胞組分相互作用(其包括但不限于信號傳導(dǎo)途徑的上游或下游組分，所述信號傳導(dǎo)途徑涉及靶蛋白質(zhì)例如單或多亞基蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物、蛋白質(zhì)/核酸復(fù)合物等)，其在特異性信號傳導(dǎo)途徑中起作用或在其中靶蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)起作用的細(xì)胞傳導(dǎo)途徑的外圍，以促進(jìn)關(guān)注的疾病狀態(tài)，例如所選的人類癌癥形式。由于在更高級有序的生物體(例如人)細(xì)胞中存在的信號傳導(dǎo)級聯(lián)的復(fù)雜性，目前狀態(tài)的現(xiàn)有技術(shù)不能完全了解關(guān)于其中指定靶蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)起作用的所有機(jī)理。
[0031]第三，本發(fā)明排除了與其他非靶蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)的化合物，所述非靶蛋白質(zhì)不參與為其中靶蛋白質(zhì)起作用的疾病狀態(tài)的基礎(chǔ)的信號傳導(dǎo)途徑。本發(fā)明排除所述化合物(其將會對患者產(chǎn)生不利的副作用)的能力來自使用表型反應(yīng)的化合物的細(xì)胞特異性的直接比較測試，其根本上排除了對照細(xì)胞的作用。如果與參照化合物相比指定測試化合物的作用導(dǎo)致降低的細(xì)胞特異性，那么可以立即排除該化合物。測試化合物對靶蛋白質(zhì)的效果是否更低，或測試化合物是否與其他不參與靶蛋白質(zhì)的信號傳導(dǎo)途徑的非靶蛋白質(zhì)相互作用(所述信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)與靶蛋白質(zhì)相關(guān)的表型反應(yīng))，或測試化合物是否只是細(xì)胞毒性的，這些都是不相關(guān)的且只是出于學(xué)術(shù)興趣。關(guān)鍵的一點(diǎn)是測試化合物治療有效性更低且不用作進(jìn)一步考慮。這為本領(lǐng)域技術(shù)研究人員節(jié)約了評價各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的時間和精力。對于讀者來說重要的是，識別可能針對無細(xì)胞測試系統(tǒng)中的靶非常有效力并高度有效的化合物可能顯示相對低的CSG測定并因此可能被很快排除，從而節(jié)省了時間和先前的資源。
[0032]本發(fā)明前述的關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)沒有在現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)，且提供了本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)本質(zhì)上的改進(jìn)。將這些優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用于所有潛在治療靶蛋白質(zhì)，但對難處理、高度抗藥性的靶蛋白質(zhì)(已知為theramuteins)而言是尤其重要的(W02005/115992)。
[0033]作為使用本發(fā)明的結(jié)果，大大簡化和提高了改進(jìn)和優(yōu)化指定化合物(相對于其他效率較低的化合物)的問題。本領(lǐng)域技術(shù)人員簡單地從第一化合物開始，無論它是否為批準(zhǔn)的藥物、篩選命中、或?yàn)橐阎种苹蚧罨P(guān)注蛋白質(zhì)的基本骨架，并使用第一化合物作為參考目的的起始點(diǎn)。然后，使用現(xiàn)在本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的基本藥物化學(xué)合成方法合成其他化合物，所述其他化合物為第一化合物的類似物、同系物、異構(gòu)體等(本文也稱為“起始化合物”或“參考化合物”)。在本文的其他部分參考了部分這些化學(xué)合成方法，且讀者還可以參考Burbaum等人，1995和Goodnow等人，2003作為所述方法的一般參考。一旦合成了其他化合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員開始使用本發(fā)明的方法而不是通常指由無細(xì)胞測試獲得的結(jié)果(通過測試新化合物對靶蛋白質(zhì)和一批其他非靶蛋白質(zhì)以嘗試使所述化合物與其他蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)最小化)的現(xiàn)有技術(shù)方法。相反，通過使用本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過直接參考由使用基于本發(fā)明表型反應(yīng)的細(xì)胞測試系統(tǒng)測定每個待測化合物的CGS獲得的結(jié)果來指導(dǎo)起始化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)的改進(jìn)。最重要地，整體排除了持續(xù)依賴于無細(xì)胞、純化蛋白質(zhì)測試的結(jié)果，包括上述在Hanke等人(1996)和Knight and Shokat (2005)中參考的“kinasepanel”，且來自實(shí)施本方法的化合物優(yōu)于由較老方法獲得的化合物，如本文鑒定的化合物的活性所示，其對高度抗藥性的theramutein p210Bcr_Abl T315I是有效的(如表4所示)。不限制本領(lǐng)域技術(shù)人員在無細(xì)胞系統(tǒng)中獨(dú)立測試所得的任何化合物用以獨(dú)立確認(rèn)(如果需要的話)，但這對于實(shí)施本發(fā)明是決不需要的。
[0034]在本發(fā)明之前，尚未證實(shí)基于細(xì)胞應(yīng)答的藥物發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)能鑒定和對所選的靶蛋白質(zhì)的抑制劑或活性劑進(jìn)行排序，而不用先參考無細(xì)胞、純化蛋白配體結(jié)合測試或酶測試(當(dāng)靶蛋白質(zhì)是酶時)以確立正在研究的化合物確實(shí)與靶蛋白質(zhì)結(jié)合。
`[0035]這些結(jié)果首次證實(shí)，使用基于細(xì)胞應(yīng)答的測試系統(tǒng)作為主要工具從在高通量篩選(HTS)中評分為正的化合物中鑒定指定靶蛋白質(zhì)的抑制劑或活性劑。這些結(jié)果還證實(shí)一旦鑒定命中或先導(dǎo)化合物能活化或抑制指定靶蛋白質(zhì)(通過任何方法，包括本文公開的實(shí)施例或通過經(jīng)典的無細(xì)胞HTS方法)，所述化合物也可以是化學(xué)優(yōu)化的(即，可以對所述化合物進(jìn)行先導(dǎo)優(yōu)化)完全采用基于表型反應(yīng)的細(xì)胞測試系統(tǒng)而不用隨后依賴于無細(xì)胞純化蛋白質(zhì)測試系統(tǒng)以獨(dú)立驗(yàn)證/確認(rèn)在先導(dǎo)優(yōu)化過程中合成的各個連續(xù)化合物的抑制或活化能力。僅這個實(shí)施方案給本領(lǐng)域技術(shù)人員節(jié)省了大量的時間、精力和大量的實(shí)驗(yàn)室資源，這些通常在采用經(jīng)典的無細(xì)胞純化蛋白質(zhì)測試、放射性配體結(jié)合測試等產(chǎn)生和獨(dú)立確認(rèn)抑制或活化性質(zhì)是需要花費(fèi)的。
[0036]本文證實(shí)的方法使用涉及慢性骨髓性白血病(CML)的發(fā)展和進(jìn)行中的引起癌癥的蛋白質(zhì)的特異性突變形式。所述蛋白稱為Abelson蛋白激酶，以其引起癌癥的形式為某些酪氨酸激酶抑制劑例如甲磺酸伊馬替尼(imatinib)的一個已知的靶。然而，如下面詳細(xì)討論的，所述靶蛋白質(zhì)可以在患者中以對伊馬替尼的抑制作用有抗性的突變形式產(chǎn)生。Abelson激酶的所述形式稱為theramutein。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，鑒定了能抑制或活化指定theramutein的合適先導(dǎo)化合物。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，優(yōu)化先導(dǎo)化合物。所述方法對鑒定命中、所述命中的先導(dǎo)優(yōu)化(無論最初是如何鑒定了所述命中)、和涉及非theramutein內(nèi)源性革巴蛋白質(zhì)的化合物的生物識別是有效的。使用由隱含賦予高度抗藥性的T315I突變的Abelson激酶的突變形式組成的theramutein證實(shí)了所述方法的一般用途。
[0037]本發(fā)明進(jìn)一步涉及為蛋白質(zhì)的變體形式的抑制劑或活化劑的活性劑。本發(fā)明還涉及為內(nèi)源性蛋白質(zhì)的某些變體形式的抑制劑或活化劑的活性劑。特別關(guān)注的是由已經(jīng)突變的基因編碼的內(nèi)源性蛋白質(zhì)變體的抑制劑和活化劑，所述的變體通常在接觸已知為相應(yīng)未突變內(nèi)源性蛋白質(zhì)的抑制劑或活化劑的化學(xué)活性劑后產(chǎn)生或至少在已經(jīng)產(chǎn)生后首先得到鑒定。這類蛋白質(zhì)變體(突變蛋白)在本文中稱作"theramuteins",它們可以自發(fā)在生物體內(nèi)出現(xiàn)(并且在某些情況中預(yù)先存在突變)或所述的突變體可以作為使用當(dāng)能夠抑制所述theramutein的未突變形式(本文稱作“prototheramutein”)的指定化學(xué)活性劑治療生物體時產(chǎn)生的選擇壓力的結(jié)果產(chǎn)生?？梢岳斫庠谀承┣闆r中,prototheramutein可以為POI的“野生型〃形式(例如因失調(diào)產(chǎn)生疾病的蛋白質(zhì))。在其它情況中,prototheramutein為引起疾病的“野生型”蛋白質(zhì)的變體，它已經(jīng)突變且由此促使作為所述在先突變結(jié)果的患病狀態(tài)發(fā)生。Prototheramutein的后一種類型的一個實(shí)例為Ρ210Β%ΑΒ?癌蛋白，并且在315位上隱含蘇氨酸⑴到異亮氨酸⑴突變的這種蛋白質(zhì)的突變體形式稱作Ρ210ΒΜ_Τ3151，并且為theramutein的一個實(shí)例。本文所用的命名“P210~ “與術(shù)語“p210Ba:-Abl”、“野生型Bcr-Abl蛋白質(zhì)”等為同義詞。
[0038]Theramuteins為一類罕有的內(nèi)源性蛋白質(zhì),它們隱含了賦予所述蛋白質(zhì)對藥物的抗性的突變，已知所述的藥物以治療有效方式抑制或活化它們的未突變對應(yīng)體。目前已知編碼少數(shù)幾種這類蛋白質(zhì)的內(nèi)源性基因在某些情況下表現(xiàn)出這類突變。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抑制Abelson酪氨酸激酶蛋白質(zhì)的某些耐藥性突變體(theramuteins)的組合物，所述的Abelson酪氨酸激酶蛋白質(zhì)在文獻(xiàn)中最初稱作P210-Bcr_Abl,它涉及慢性髓細(xì)胞性白血病的發(fā)生。`
[0039]本發(fā)明的方法特別涉及鑒定蛋白質(zhì)的特異性抑制劑或特異性活化劑的方法。術(shù)語“特異性”在上下文中術(shù)語“抑制劑”或“活化劑”中的應(yīng)用(參見下文中的定義)指的是所述的抑制劑或活化劑結(jié)合蛋白質(zhì)并且抑制或活化蛋白質(zhì)的細(xì)胞功能，但不結(jié)合和活化或抑制細(xì)胞中的各種其它蛋白質(zhì)或非-蛋白質(zhì)靶標(biāo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員充分了解，在醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中討論蛋白質(zhì)抑制劑或活化劑的作用時，在特異性抑制劑或特異性活化劑的概念和靶蛋白“特異性”的相關(guān)概念方面存在一定程度的可變性。因此，就本發(fā)明的目的而言，物質(zhì)為指定theramutein的特異性抑制劑或特異性活化劑,條件是所述物質(zhì)能夠以指定濃度抑制或活化所述蛋白質(zhì)，使得相應(yīng)的表型反應(yīng)(phenoresponse)以適當(dāng)方式得到調(diào)節(jié),而在相同指定濃度下對相應(yīng)對照細(xì)胞的表型反應(yīng)(如果有的話)不具有可感覺到的作用，所述的相應(yīng)對照細(xì)胞基本上不表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0040]在某些實(shí)施方案中，物質(zhì)可以為兩個密切相關(guān)的蛋白質(zhì)如prototheramutein和其相應(yīng)的theramutein之一的調(diào)節(jié)劑。在其它實(shí)施方案中，除為prototheramutein和theramutein的調(diào)節(jié)劑外,物質(zhì)還可以調(diào)節(jié)具有相似功能的蛋白質(zhì)的活性。如上所述，除抑制p210Btt Abl酪氨酸激酶外，甲磺酸伊馬替尼還能夠抑制在某些胃腸道間質(zhì)瘤中超表達(dá)的c-kit癌基因產(chǎn)物(也為酪氨酸激酶)以及在某些慢性骨髓單核細(xì)胞性白血病(CMML)中表達(dá)的TOGFii受體(也為酪氨酸激酶)。這類化合物有時稱作“適度特異性”抑制劑。
[0041]本發(fā)明還提供了可以用于鑒定活化或抑制theramutein的物質(zhì)的一般方法,所述的物質(zhì)將theramute iη活化或抑制到相同程度、并且優(yōu)選到甚至大于能夠抑制該蛋白質(zhì)的相應(yīng)"野生型"形式的已知藥物物質(zhì)的程度(然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員充分了解這類蛋白質(zhì)的所述〃野生型〃形式已經(jīng)在產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)參與的相應(yīng)疾病的過程中突變)。
[0042]在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有通式I的Ρ210β?_αβη3151theramutein的抑制劑:
[0043]
【權(quán)利要求】
1.鑒定與第一化合物相比具有改進(jìn)細(xì)胞特異性的化合物的方法，所述第一化合物為蛋白質(zhì)的抑制劑并調(diào)節(jié)相應(yīng)的表型反應(yīng)，包括: a)測量用所述第一化合物處理過的測試細(xì)胞的表型反應(yīng)的調(diào)節(jié)； b)測量用所述第一化合物處理過的對照細(xì)胞的表型反應(yīng)的調(diào)節(jié)； c)測量用受試化合物處理過的測試細(xì)胞的表型反應(yīng)的調(diào)節(jié)； d)測量用受試化合物處理過的對照細(xì)胞的表型反應(yīng)的調(diào)節(jié)； e)確定第一化合物的細(xì)胞特異性缺口和受試化合物的細(xì)胞特異性缺口； 和f)如果所述受試化合物的細(xì)胞特異性缺口大于所述第一化合物的細(xì)胞特異性缺口，則鑒定所述受試化合物具有改進(jìn)的細(xì)胞特異性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞特異性缺口由所述對照細(xì)胞的IC5tl除以所述測試細(xì)胞的IC5tl來確定。
3.鑒定與第一化合物相比具有改進(jìn)的細(xì)胞特異性的化合物的方法，所述第一化合物為蛋白質(zhì)的活化劑并調(diào)節(jié)相應(yīng)的表型反應(yīng)，包括: a)測量用所述第一化合物處理過的測試細(xì)胞的表型反應(yīng)的調(diào)節(jié)； b)測量用所述第一化合物處理過的對照細(xì)胞的表型反應(yīng)的調(diào)節(jié)； c)測量用受試化合物處理`過的測試細(xì)胞的表型反應(yīng)的調(diào)節(jié)； d)測量用受試化合物處理過的對照細(xì)胞的表型反應(yīng)的調(diào)節(jié)； e)確定第一化合物的細(xì)胞特異性缺口和受試化合物的細(xì)胞特異性缺口； 和f)如果所述受試化合物的細(xì)胞特異性缺口大于所述第一化合物的細(xì)胞特異性缺口，則鑒定所述受試化合物具有改進(jìn)的細(xì)胞特異性。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述細(xì)胞特異性缺口由所述測試細(xì)胞的IC5tl除以所述對照細(xì)胞的IC5tl來確定。
5.改進(jìn)第一化合物優(yōu)化的方法，所述第一化合物為蛋白質(zhì)的抑制劑并調(diào)節(jié)相應(yīng)的表型反應(yīng),包括: a)測量所述第一化合物對測試細(xì)胞的表型反應(yīng)的ICto； b)測量所述第一化合物對對照細(xì)胞的表型反應(yīng)的ICto； c)測量具有與所述第一化合物相同骨架的受試化合物對所述測試細(xì)胞的表型反應(yīng)的IC50; d)測量所述受試化合物對所述對照細(xì)胞的表型反應(yīng)的ICto； 和e)如果所述測試化合物的細(xì)胞特異性缺口大于所述第一化合物的細(xì)胞特異性缺口，則鑒定所述受試化合物為所述第一化合物的改進(jìn)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述蛋白質(zhì)是P210?1或pl90Bra_Ab1，其在相應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)包含相應(yīng)蘇氨酸到異亮氨酸的突變。
7.改進(jìn)第一化合物優(yōu)化的方法，所述第一化合物為蛋白質(zhì)的活化劑并調(diào)節(jié)相應(yīng)的表型反應(yīng),包括: a)測量所述第一化合物對測試細(xì)胞的表型反應(yīng)的ICto； b)測量所述第一化合物對對照細(xì)胞的表型反應(yīng)的ICto； c)測量具有與所述第一化合物相同骨架的受試化合物對所述測試細(xì)胞的表型反應(yīng)的IC50;d)測量所述受試化合物對所述對照細(xì)胞的表型反應(yīng)的ICto ； 和e)如果所述測試化合物的細(xì)胞特異性缺口大于所述第一化合物的細(xì)胞特異性缺口，則鑒定受試化合物為第一化合物的改進(jìn)。
8.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其包括選擇步驟(e)的優(yōu)化化合物并重復(fù)步驟(a) - (d)。
9.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法,其中所述蛋白質(zhì)為theramutein。
10.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試化合物的IC5tl高于所述第一化合物。
11.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述的受試化合物的IC5tl低于所述第一化合物。
12.確定一種物質(zhì)是否是蛋白質(zhì)的特異性抑制劑的方法，所述蛋白質(zhì)能引起可檢測的表型反應(yīng)，其包括: a)溫育測試細(xì)胞，所述測試細(xì)胞表達(dá)所述蛋白質(zhì)并能用所述物質(zhì)引起與該細(xì)胞中所述蛋白質(zhì)的存在和功能活性相關(guān)的表型反應(yīng)； b)溫育對照細(xì)胞，所述對照細(xì)胞在更低水平表達(dá)或不表達(dá)所述蛋白質(zhì)并能以更低程度引起或完全不引起與細(xì)胞中所述蛋白質(zhì)的存在和功能活性相關(guān)的可檢測的表型反應(yīng)； c)比較用所述物質(zhì)處理過的所述測試細(xì)胞的表型反應(yīng)與用所述物質(zhì)處理過的所述對照細(xì)胞的表型反應(yīng)； 和d)如果所述物質(zhì)能調(diào)節(jié)所述測試細(xì)胞表型反應(yīng)的程度大于所述對照細(xì)胞，則確定所述物質(zhì)是所述蛋白質(zhì)的特異性抑制劑。
13.確定一種物質(zhì)是否是蛋白質(zhì)的特異性活化劑的方法，所述蛋白質(zhì)能引起可檢測的表型反應(yīng)，其包括: a)溫育測試細(xì)胞，所述測試細(xì)胞表達(dá)所述蛋白質(zhì)并能用所述物質(zhì)引起與該細(xì)胞中所述蛋白質(zhì)的存在和功能活性相關(guān)的表型反應(yīng)； b)溫育對照細(xì)胞，所述對照細(xì)胞在更低水平表達(dá)或不表達(dá)所述蛋白并能以更低程度引起或完全不引起與該細(xì)胞中所述蛋白質(zhì)的存在和功能活性相關(guān)的可檢測的表型反應(yīng)； c)比較用所述物質(zhì)處理過的所述測試細(xì)胞的表型反應(yīng)與用所述物質(zhì)處理過的所述對照細(xì)胞的表型反應(yīng)； 和d)如果所述物質(zhì)能調(diào)節(jié)所述測試細(xì)胞表型反應(yīng)的程度大于所述對照細(xì)胞，則確定所述物質(zhì)是所述蛋白質(zhì)的特異性活化劑。
【文檔編號】C12Q1/37GK103789389SQ201310695946
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2006年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2005年11月23日
【發(fā)明者】杰勒德·M·豪斯 申請人:杰勒德·M·豪斯