釀酒酵母在水果采后病害防治的應(yīng)用及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及釀酒酵母在水果采后病害防治的應(yīng)用及使用方法，屬于生物防治【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的釀酒酵母Saccharomycescerevisiae，保藏菌株編號(hào)為CGMCC?No.7129。利用其進(jìn)行水果采后病害防治及貯藏保鮮方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行：將釀酒酵母活化、發(fā)酵培養(yǎng)，離心得到菌體；將菌體用無(wú)菌水稀釋制備成菌懸液；將水果放入菌懸液中，浸泡30秒的時(shí)間后馬上取出，再風(fēng)干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫或冷藏條件下存放。可以明顯的抑制葡萄、草莓等產(chǎn)生腐爛腐敗的病原菌，防止水果采后發(fā)生腐爛，并且具有不產(chǎn)生毒素、可以和化學(xué)殺菌劑共同使用等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】釀酒酵母在水果采后病害防治的應(yīng)用及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物防治【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及一種釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae)以及該菌種對(duì)水果采后病害防治的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水果在采摘、運(yùn)銷、儲(chǔ)藏過(guò)程中因腐爛造成的損失是巨大的，也是全球關(guān)注的問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，在發(fā)達(dá)國(guó)家有10% - 30%的新鮮產(chǎn)品由于采后病害導(dǎo)致腐爛，而在缺乏貯運(yùn)冷藏設(shè)備的發(fā)展中國(guó)家，果實(shí)采后腐爛率則高達(dá)40% — 50%。國(guó)外水果貯藏保鮮量占水果總產(chǎn)量60%以上，目前我國(guó)果品貯藏量800多萬(wàn)噸，不到總量的15%，其中冷藏庫(kù)和氣調(diào)庫(kù)的貯藏量為70萬(wàn)噸，僅占總產(chǎn)量的7%。我國(guó)水果采后腐爛率一般在20% - 30%,高者甚至達(dá)到50%。水果腐爛主要?dú)w因于病原微生物的致病作用，這些病原微生物主要有灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、葡枝根霉(Rhizopus stoloniger)、青霉屬(Penicillium spp.)、毛霉屬(Mucorspp.)、鏈格抱(Alternaria spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)和軟腐細(xì)菌(Erwinia sp.)
坐寸ο
[0003]目前最常用的控制水果采后腐爛的方法是低溫和化學(xué)殺菌劑處理。近年來(lái)雖然冷藏技術(shù)在我國(guó)得到了廣泛的發(fā)展和應(yīng)用，但是在低溫條件下仍有相當(dāng)數(shù)量的致病菌可以生長(zhǎng)從而引起腐爛。例如，能引起多種水果灰霉病的灰葡萄孢(Botrytis cinerea),也稱灰霉菌，在-0.5°C時(shí)還能生長(zhǎng)繁殖，引起許多水果腐爛變質(zhì)，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。而那些對(duì)低溫敏感的水果，因只能在不低于使產(chǎn)品受冷害的溫度下貯藏，病原物的生長(zhǎng)、繁殖不能得到有效地抑制，腐爛相當(dāng)嚴(yán)重?；瘜W(xué)殺菌劑的使用，雖然防治病害可以起到立竿見影的效果，但是在殺死病原菌的同時(shí)也殺死了有益微生物，且水果上的化學(xué)殺菌劑殘留對(duì)人體健康造成影響、對(duì)環(huán)境造成污染。美國(guó) 科學(xué)院(National Academy of ScincesMtJ—份報(bào)告顯不，在用于處理食品的殺菌劑中，60%有致癌的危險(xiǎn)性。目前多種殺菌劑(如CaptaruBenomyl等)已被美國(guó)環(huán)保局明令禁止使用或者在部分水果產(chǎn)品上限制使用。為了保證農(nóng)產(chǎn)品的衛(wèi)生和安全，各國(guó)科學(xué)家都在積極的探索能代替化學(xué)殺菌劑的水果采后病害防治新技術(shù)。近年來(lái)，美國(guó)、意大利等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)水果采后病害生物防治的研究已經(jīng)取得了階段性的成果，生物防治的應(yīng)用潛力巨大，使得它成為一種取代化學(xué)殺菌劑的有效方法。
[0004]我國(guó)水果采后病害生物防治研究起步較晚。范青等(2001)對(duì)果實(shí)病害生物防治拮抗菌進(jìn)行了篩選和分離，結(jié)果表明:季也蒙假絲酵母(Candida guiliermondii)、朽1樣形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)對(duì)甜櫻桃褐腐病都表現(xiàn)出顯著的抑制效果，季也蒙假絲酵母和檸檬形克勒克酵母能有效地防治核果類果實(shí)軟腐病；田世平等(2004)研究，在甜櫻桃采前噴灑I X 108CFU/mL的絲孢酵母(Trichosporon pullulans),羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)和粘紅酵母(Rhodotorula glutinis),分別在25°C,0°C以及氣調(diào)忙藏下，絲孢酵母在果實(shí)上繁殖數(shù)量最高，抑菌效果最好；張紅印等(2005)研究了不同溫度下，羅倫隱球酵母對(duì)灰霉病的防治效果，結(jié)果表明，25°C下，梨灰霉病的發(fā)病率為16.7%，結(jié)合CaCl2使用效果更顯著。[0005]從國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中可知當(dāng)前以有效微生物取代化學(xué)殺菌劑用于水果采后病害的防治已顯示出巨大的應(yīng)用前景，水果采后病害的生物防治成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。但到目前為止，已實(shí)際應(yīng)用于生產(chǎn)的拮抗菌種類不多，只有Biosave和Aspire等少數(shù)幾種產(chǎn)品上市，而我國(guó)目前尚沒(méi)有拮抗菌應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。主要原因在于商業(yè)生產(chǎn)條件下，目前已報(bào)道的拮抗微生物的防治效果往往不如化學(xué)殺菌劑的效果，從而達(dá)不到保鮮要求。這些因素影響了拮抗菌作為果蔬保鮮劑在生產(chǎn)中的使用。為了盡快地將拮抗微生物應(yīng)用于水果貯藏保鮮實(shí)際生產(chǎn)上，還需進(jìn)一步篩選拮抗效果好、抗病譜廣的微生物，同時(shí)需要深入探討拮抗微生物防治水果采后病害的機(jī)理，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高拮抗微生物的抑菌能力，開展拮抗微生物擴(kuò)大培養(yǎng)、保存和商品化應(yīng)用技術(shù)的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，發(fā)明人在前期廣泛研究的基礎(chǔ)上，提供了一株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株,具有較強(qiáng)生物防治效力。
[0007]本菌株系從鎮(zhèn)江市世業(yè)洲農(nóng)業(yè)生態(tài)果園篩選分離到一株對(duì)葡萄采后病害具有顯著防治作用的拮抗酵母912菌株，經(jīng)系統(tǒng)分類鑒定，鑒定為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
[0008]本發(fā)明的釀酒酵母912菌株已經(jīng)于2013年I月11日該菌株于送交位于中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏菌株編號(hào)為CGMCC N0.7129。
[0009]本發(fā)明同時(shí)提供了一種利用釀酒酵母進(jìn)行水果采后病害防治及貯藏保鮮方法；步驟如下:將釀酒酵母912活化、發(fā)酵培養(yǎng)，離心得到菌體；將菌體用無(wú)菌水稀釋制備成1.0X106個(gè)/ml-1.0X IO9個(gè)/ml的菌懸液；將水果放入菌懸液中，浸泡30秒的時(shí)間后馬上取出，再風(fēng)干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫或冷藏條件下存放。
[0010]本發(fā)明還提供該釀酒酵母菌株的用途，可以用其對(duì)水果的進(jìn)行采后病害防治及貯藏保鮮；尤其適合于葡萄、草莓等水果`的采后病害防治及貯藏保鮮。
[0011]本發(fā)明的釀酒酵母912菌株采用常規(guī)的菌種斜面保藏方法，采用培養(yǎng)基首選為NYDA培養(yǎng)基(牛肉膏0.8%，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1%，瓊脂2%)，也可以使用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15 — 20克，自來(lái)水1000毫升)。在pH7.0-9.0，26°C -28°C，培養(yǎng)36h。在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，可將斜面菌種直接接種至發(fā)酵培養(yǎng)基NYDB或者麥芽汁培養(yǎng)基中(將大麥芽粉碎稱重，加入4倍重量的水，在65°C的水浴鍋中保溫糖化3-4h，糖化時(shí)每隔5分鐘用玻璃棒攪拌一次，直至糖化完全(檢查方法:取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如無(wú)蘭色出現(xiàn)，即表示糖化完全)。糖化液用4-6層紗布過(guò)濾，濾液中加入1%重量的雞蛋清，將濾液置于高壓滅菌鍋里，升溫至115°C下并保持5min，使糖化液中的蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)，再用4-6層紗布過(guò)濾，除去沉淀，用手持糖度計(jì)(WYT-4型，泉州中友光學(xué)儀器有限公司)檢測(cè)糖化液殘?zhí)菨舛?，加水稀釋將糖化液濃度調(diào)整至12°Brix，自然ρΗΟ,ρΗ?.0-9.0，溫度260C -28°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)24_30h。一般在24h左右可以達(dá)到最大生物量。
[0012]本發(fā)明的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)912,可以明顯的抑制葡萄、草莓等產(chǎn)生腐爛腐敗的病原菌，防止水果采后發(fā)生腐爛，并且具有不產(chǎn)生毒素、可以和化學(xué)殺菌劑共同使用等優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛地用于水果采后病害的生物防治過(guò)程中，減少采后病害造成的損失。
[0013]通過(guò)借助以下實(shí)施實(shí)例將更加詳細(xì)的說(shuō)明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說(shuō)明性的，本發(fā)明并不受這些實(shí)施實(shí)例的限制。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為本發(fā)明釀酒酵母912ITS區(qū)序列進(jìn)化關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明菌株通過(guò)以下方法得到，從鎮(zhèn)江市世業(yè)洲農(nóng)業(yè)生態(tài)園生產(chǎn)的桑葚中分離得至|J。通過(guò)分離、篩選、培養(yǎng)、離體試驗(yàn)和活體試驗(yàn)，得到具有較強(qiáng)生防效力的微生物菌株912。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)培養(yǎng)、生理生化特征試驗(yàn)和小亞基5.8S rDNA和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITSl和ITS2區(qū)喊基序列分析，鑒定為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0016]本發(fā)明的菌株釀酒酵母912菌株(菌株編號(hào)=CGMCC N0.7129)具有以下微生物學(xué)特性:
[0017]1.形態(tài)學(xué)特征
[0018](I)在YEro固體培養(yǎng)基平板(酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL,瓊脂20g，pH6.0，115°C濕熱滅菌20min)上28°C培養(yǎng)48h，菌落呈卵圓形、邊緣整齊、乳白色、表面光滑、質(zhì)地均勻、易挑起。
[0019](2)在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，不形成醭，菌液渾濁，有沉淀，鏡檢酵母細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞大小(3.5-5.3) X (2.7-4.5) μ m,芽殖，單邊出芽。
[0020]2.生理特性`
[0021]本發(fā)明菌株碳源能夠同化葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、蔗糖纖維、木糖，不能同化淀粉。氮源能夠同化硝酸鹽，37°C可以生長(zhǎng)。其生理特性結(jié)果見下表1。
[0022]3.分子遺傳學(xué)鑒定
[0023]對(duì)篩選菌株釀酒酵母912小亞基5.8S rDNA-1TS區(qū)序列分析，在GenBank上檢索，確定912為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。根據(jù)檢索到的同源菌株，應(yīng)用DNAStar軟件的Mege5.1程序,構(gòu)建生物進(jìn)化關(guān)系樹如圖1。
[0024]表1釀酒酵母的生理生化特征
[0025]
菌號(hào)葡萄糖半乳糖麥芽糖蔗糖纖維二糖木糖淀粉硝酸鉀產(chǎn)酸 37 °C
釀酒醉母 912++++++ ———+
[0026]本發(fā)明的釀酒酵母912，采用常規(guī)的菌種斜面保藏方法，采用培養(yǎng)基首選為NYDA培養(yǎng)基(牛肉膏0.8%，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1%，瓊脂2%)，也可以使用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基。在pH7.0~9.0，26°C~28°C，培養(yǎng)24h。在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，可將斜面菌種直接接種至發(fā)酵培養(yǎng)基NYDB或者麥芽汁培養(yǎng)基中，pH7.0~9.0，溫度26°C~28°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)24~30h。一般在24h左右可以達(dá)到最大生物量。
[0027]實(shí)施例1:利用釀酒酵母進(jìn)行草莓的采后病害防治及貯藏保鮮方法
[0028]將活化后酵母接種在裝有50mlNYDB(酵母膏5g，牛肉浸膏Sg，葡萄糖10g，純化水 1000ml，pH7.0-9.0)的三角瓶中，28 °C、180r/min 搖床培養(yǎng) 24h。取菌液 7000r/min離心IOmin,棄上清，無(wú)菌水反復(fù)清洗3次，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)配成濃度為IX IO6個(gè)/ml,I X IO7個(gè)/ml，I X IO8個(gè)/ml，I X IO9個(gè)/ml的菌懸液。在果實(shí)腰部用打孔器打3個(gè)直徑為3m(寬)X3mm(深)的孔,每孔注30 μ I的拮抗菌細(xì)胞懸液,對(duì)照水果注入30 μ I無(wú)菌水。2h后分別接種病原菌匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子懸液30 μ I。晾干后將果實(shí)裝入塑料筐內(nèi)，保鮮膜封口保持95%的濕度，在室溫下貯藏，3d后統(tǒng)計(jì)果實(shí)的發(fā)病腐爛率。每個(gè)處理36個(gè)果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)3次。
[0029]按照上述步驟試驗(yàn)，3d后統(tǒng)計(jì)草莓的腐爛率結(jié)果見下表2。
[0030]表2釀酒酵母912對(duì)草莓葡枝根霉的抑制效果
[0031]
【權(quán)利要求】
1.釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae,保藏菌株編號(hào)為 CGMCC N0.7129。
2.權(quán)利要求1所述的釀酒酵母進(jìn)行水果采后病害防治及貯藏保鮮方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行:將釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae活化、發(fā)酵培養(yǎng),離心得到菌體；將菌體用無(wú)菌水稀釋制備成1.0X IO6個(gè)/ml - 1.0X IO9個(gè)/ml的菌懸液；將水果放入菌懸液中，浸泡30秒的時(shí)間后馬上取出，再風(fēng)干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫或冷藏條件下存放。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的釀酒酵母進(jìn)行水果采后病害防治及貯藏保鮮方法，其特征在于其中所述的水果為葡萄或草莓。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的釀酒酵母進(jìn)行水果采后病害防治及貯藏保鮮方法，其特征在于釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株采用常規(guī)的菌種斜面保藏方法,采用培養(yǎng)基NYDA培養(yǎng)基(牛肉膏0.8%，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1%，瓊脂2%)，或馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15 — 20克，自來(lái)水1000毫升)；在pH 7.0-9.0,26°C_28°C，培養(yǎng)36 h ;在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，可將斜面菌種直接接種至發(fā)酵培養(yǎng)基NYDB或者麥芽汁培養(yǎng)基中，pH 7.0-9.0，溫度26°C -28°C，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)24-30h。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的釀酒酵母進(jìn)行水果采后病害防治及貯藏保鮮方法，其特征在于所述的麥芽汁培養(yǎng)基按照下述步驟制備得到:大麥芽粉碎稱重，加入4倍重量的水，在65°C的水浴鍋中保溫糖化3-4h，糖化時(shí)每隔5分鐘用玻璃棒攪拌一次，直至糖化完全，糖化液用4-6層紗布過(guò)濾，濾液中加入1%重量的雞蛋清，將濾液置于高壓滅菌鍋里，升溫至115°C下并保持5min，使糖化液中的蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)，再用4_6層紗布過(guò)濾，除去沉淀，用手持糖度計(jì)檢測(cè)糖化液殘?zhí)菨舛龋铀♂寣⑻腔簼舛日{(diào)整至120Brix，自然pH。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的釀酒酵母進(jìn)行水果采后病害防治及貯藏保鮮方法，其特征在于所述的采用培養(yǎng)基NYDA培養(yǎng)基以質(zhì)量百分比計(jì)組成如下:牛肉膏0.8%，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1%，瓊脂2%;馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基組成如下:馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15 — 20克，自來(lái)水1000毫升。
【文檔編號(hào)】C12R1/865GK103820343SQ201310648466
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】張紅印, 李強(qiáng), 張曉云, 楊其亞 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)