一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟：步驟一，取小塊人宮頸瘤變組織；步驟二，用I型膠原酶消化分解后制成細(xì)胞懸液；步驟三，利用臺(tái)盼藍(lán)拒染法對(duì)細(xì)胞的活性進(jìn)行判定；步驟四，將細(xì)胞懸液接種到低胎牛血清培養(yǎng)基且經(jīng)鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中，等待細(xì)胞貼壁；步驟五，細(xì)胞貼壁后更換無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞進(jìn)行純化，每周更換至少兩次培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合至80％～85％后傳代；利用該方法培養(yǎng)出來(lái)的CIN細(xì)胞成活率高，純度高，傳代后細(xì)胞的形態(tài)與原代無(wú)明顯改變，攜帶人乳頭瘤病毒(Human?papillomavirus，HPV)；CIN細(xì)胞體外培養(yǎng)成功，為宮頸癌的治療研究提供了技術(shù)保障。
【專利說(shuō)明】一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，尤其涉及一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的培養(yǎng)方法。【背景技術(shù)】
[0002]宮頸癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，其發(fā)生是一個(gè)由癌前病變逐漸衍變?yōu)榘┑倪^(guò)程，時(shí)間可以從數(shù)年到數(shù)十年。這種癌前變化代表了一系列組織學(xué)異常的宮頸上皮細(xì)胞，故又稱為宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical intraepithelial neoplasia, CIN)。根據(jù)細(xì)胞異常的程度，CIN又進(jìn)一步分為CINI (輕度不典型增生)，CINII (中度不典型增生)和CINIII (重度不典型增生和原位癌)。CINI在大多數(shù)情況下會(huì)自然消退，因此，事實(shí)上不屬于癌前病變的范疇；但是CINII和CINIII往往持續(xù)存在，其中20%~45%未經(jīng)治療CINII / III會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成宮頸癌，因此，CINII和CINIII被認(rèn)為是高級(jí)別病變和宮頸癌前病變。研究認(rèn)為，幾乎所有高級(jí)別CIN都是由致癌性人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus, HP V)的持續(xù)感染引起的，而長(zhǎng)期的病毒感染是CIN進(jìn)一步發(fā)展的必要條件，但是，病毒沒(méi)有自己獨(dú)立的代謝系統(tǒng)，必須寄生在宿主細(xì)胞中才能繁殖，因此，HPV不能在進(jìn)行細(xì)胞外培養(yǎng)。在CIN生物學(xué)特性的體內(nèi)外研究中，培養(yǎng)自然HPV感染的CIN細(xì)胞具有重要意義。
[0003]由于技術(shù)和方法的問(wèn)題，人CIN細(xì)胞的體外培養(yǎng)及特性等研究仍然很不成熟，特別是標(biāo)本的大小問(wèn)題。宮頸發(fā)生瘤變的組織往往較小，進(jìn)行分離后很難得到足夠的CIN細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。到目前為止，只有兩篇文獻(xiàn)對(duì)CIN細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法進(jìn)行了描述。其中一項(xiàng)研究中采用的是“組織塊培養(yǎng)法”，對(duì)整塊病變組織進(jìn)行顯微鏡下分割后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，收集從組織塊中長(zhǎng)出的角質(zhì)細(xì)胞并接種到滅活的小鼠成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層上。該種方法的主要缺點(diǎn)在于經(jīng)過(guò)輻射處理的小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞有病毒感染等潛在風(fēng)險(xiǎn)。此外，角質(zhì)細(xì)胞收集的數(shù)量較少，且容易在培養(yǎng)中被快速生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞所污染。另一項(xiàng)研究中，將CIN組織用II型膠原酶消化后接種到含有10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的DMEM-F12培養(yǎng)基中，與成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)。該培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)在于培養(yǎng)方法相對(duì)復(fù)雜，培養(yǎng)過(guò)程中需剪除培養(yǎng)瓶上層，增加污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)所需時(shí)間較長(zhǎng)，需要五周傳代。此外，培養(yǎng)基中的FBS增加了成纖維細(xì)胞污染的風(fēng)險(xiǎn)以及角質(zhì)細(xì)胞的分化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種成活率及純度高且傳代后細(xì)胞生物學(xué)特性無(wú)明顯改變(即細(xì)胞無(wú)明顯分化)，攜帶HPV的宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0006]步驟一，取小塊人宮頸瘤變組織，小部分進(jìn)行HPV分型檢測(cè)，部分進(jìn)行培養(yǎng)；
[0007]步驟二，用I型膠原酶消化分解后制成細(xì)胞懸液；
[0008]步驟三，利用臺(tái)盼藍(lán)拒染法對(duì)細(xì)胞的活性進(jìn)行判定；[0009]步驟四，將細(xì)胞懸液接種到低胎牛血清培養(yǎng)基且經(jīng)鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中，等待細(xì)胞貼壁；
[0010]步驟五，細(xì)胞貼壁后更換無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞進(jìn)行純化，每周更換至少兩次培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合至80%~85%后傳代。
[0011]步驟六，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，通過(guò)PCR對(duì)HPV進(jìn)行分型檢測(cè)。
[0012]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，在上述步驟一中，用3%~5%醋酸和盧格氏碘溶液標(biāo)記病變組織，在陰道鏡引導(dǎo)下活檢鉗鉗取宮頸上皮內(nèi)瘤變組織約2~3_3，在甲硝唑液體中浸泡4~6分鐘，將宮頸上皮內(nèi)瘤變組織取出后置于轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中3V~5°C低溫保存。
[0013]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基含有2000U / ml青霉素、2000ug / ml鏈霉素和5ug / ml兩性霉素。 [0014]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，在上述步驟二中，取出宮頸上皮內(nèi)瘤變組織放入陪替氏培養(yǎng)基中；在無(wú)菌條件下，將宮頸上皮內(nèi)瘤變組織用含有青霉素、鏈霉素和兩性霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2~4次；
[0015]將宮頸上皮內(nèi)瘤變組織剪碎，加入預(yù)熱至36°C~38°C的I型膠原酶，然后將其移入無(wú)菌離心管中，用I型膠原酶沖洗陪替氏培養(yǎng)基并將沖洗液加入同一離心試管中；將離心試管放在置于電熱恒溫振蕩器中，慢慢攪動(dòng)25~35min，用吸液管吹打離散I~3min ；
[0016]然后用吸液管吸取含有單個(gè)細(xì)胞的液體,用200目篩網(wǎng)過(guò)濾至無(wú)菌離心管中；用PBS沖洗離心管后將沖洗液過(guò)濾至同一離心管中；將含有單細(xì)胞懸液的離心管放置臺(tái)式離心機(jī)上，以1000r / min離心4~6min ；
[0017]棄上清液，重新加入完全培養(yǎng)液，用吸液管吹打成單細(xì)胞懸液；利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0018]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述PBS中青霉素、鏈霉素和兩性霉素的濃度分別為200U / ml、200ug / ml 和 5ug / ml。
[0019]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，在上述步驟四中，將細(xì)胞分離后的細(xì)胞懸液接種在鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中，所用完全培養(yǎng)基為含有4%~6% FBS的無(wú)血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基(K-SFM);將培養(yǎng)瓶放置含4%~6% CO2且溫度為36°C~38°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等待細(xì)胞貼壁。
[0020]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，在上述步驟五中，細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行細(xì)胞換液，所用完全培養(yǎng)基更換為K-SFM ;每周至少2次更換培養(yǎng)液；用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)；細(xì)胞融合至約80%~85%后傳代。
[0021]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述培養(yǎng)瓶選用T25培養(yǎng)瓶。
[0022]由于采用了上述技術(shù)方案，一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟:步驟一，取小塊人宮頸瘤變組織；步驟二，用I型膠原酶消化分解后制成細(xì)胞懸液；步驟三，利用臺(tái)盼藍(lán)拒染法對(duì)細(xì)胞的活性進(jìn)行判定；步驟四，將細(xì)胞懸液接種到低胎牛血清培養(yǎng)基且經(jīng)鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中，等待細(xì)胞貼壁；步驟五，細(xì)胞貼壁后更換無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞進(jìn)行純化，每周更換至少兩次培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合至80%~85%后傳代；利用該方法培養(yǎng)出來(lái)的CIN細(xì)胞成活率高，純度高，傳代后細(xì)胞形態(tài)與原代比較無(wú)明顯改變，HPV分型檢測(cè)結(jié)果與培養(yǎng)前一致；CIN細(xì)胞體外培養(yǎng)成功，為宮頸癌的治療研究提供了技術(shù)保障。[0023]說(shuō)明書附圖
[0024]圖1是原代培養(yǎng)細(xì)胞圖；
[0025]圖2是傳代培養(yǎng)細(xì)胞圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。在下面的詳細(xì)描述中，只通過(guò)說(shuō)明的方式描述了本發(fā)明的某些示范性實(shí)施例。毋庸置疑，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以用各種不同的方式對(duì)所描述的實(shí)施例進(jìn)行修正。因此，附圖和描述在本質(zhì)上是說(shuō)明性的，而不是用于限制權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
[0027]—種宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0028]步驟一，取小塊人宮頸瘤變組織，用3~5%醋酸和盧格氏碘溶液標(biāo)記病變組織，醋酸含量選用5%最佳，在陰道鏡引導(dǎo)下活檢鉗鉗取宮頸上皮內(nèi)瘤變組織約2~3_3在甲硝唑液體中浸泡4~6分鐘，本實(shí)施例選用5分鐘，將宮頸上皮內(nèi)瘤變組織取出后置于轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中3°C~5 °C低溫保存，所述轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基含有2000U / ml青霉素、2000ug / ml鏈霉素和5ug / ml兩性霉素，其中雙抗?jié)舛仁浅Ｒ?guī)濃度的10倍，目的是減少陰道內(nèi)G+和G_細(xì)菌的污染； [0029]步驟二，取出宮頸上皮內(nèi)瘤變組織放入直徑9cm的塑料陪替氏培養(yǎng)基中；在無(wú)菌條件下，將宮頸上皮內(nèi)瘤變組織用青霉素、鏈霉素和兩性霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2~4次，所述PBS中青霉素、鏈霉素和兩性霉素的濃度分別為200U / ml、200ug / ml和5ug / ml ；
[0030]用含有10% FBS的培養(yǎng)基對(duì)I型膠原酶進(jìn)行消化，以減少消化過(guò)程中對(duì)細(xì)胞造成的損害；將宮頸上皮內(nèi)瘤變組織剪碎，加入預(yù)熱至36°C~38°C的I型膠原酶，以37°C最佳，然后用巴斯德吸管將其移入無(wú)菌離心管中，用2mll型膠原酶沖洗陪替氏培養(yǎng)基并將沖洗液加入同一離心試管中；將離心試管放在置于電熱恒溫振蕩器中，慢慢攪動(dòng)25~35min，本實(shí)施例選用30min,用5ml的吸液管吹打離散I~3min,選用2min最佳；
[0031]然后用IOml的吸液管吸取含有單個(gè)細(xì)胞的液體,用200目篩網(wǎng)過(guò)濾至15ml的無(wú)菌離心管中；用5ml的PBS沖洗離心管后將沖洗液過(guò)濾至同一離心管中；將含有單細(xì)胞懸液的離心管放置臺(tái)式離心機(jī)上，以1000r / min離心4~6min,離心5min即可；
[0032]棄上清液，重新加入5ml完全培養(yǎng)液，用5ml的吸液管吹打成單細(xì)胞懸液；利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0033]步驟三，利用臺(tái)盼藍(lán)拒染法對(duì)細(xì)胞的活性進(jìn)行判定，臺(tái)盼藍(lán)拒染法為本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)，這里不再贅述；
[0034]步驟四，將細(xì)胞分離后的細(xì)胞懸液接種在鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中，所述培養(yǎng)瓶選用T25培養(yǎng)瓶，所用完全培養(yǎng)基為含有4%~6% FBS的無(wú)血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基(K-SFM)，本實(shí)施例選用含有5% FBS的無(wú)血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁；將培養(yǎng)瓶放置含4%~6% CO2且溫度為36°C~38°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在本實(shí)施例中，選用5% CO2且溫度為37°C的培養(yǎng)箱，等待細(xì)胞貼壁，細(xì)胞貼壁需要5天左右，5天后細(xì)胞貼壁能力逐漸減弱；
[0035]步驟五，細(xì)胞貼壁后，即大約五天后，進(jìn)行細(xì)胞換液，所用完全培養(yǎng)基更換為K-SFM，目的是純化CIN細(xì)胞，減少成纖維細(xì)胞的污染；每周2次更換培養(yǎng)液，首次換液時(shí)間由傳統(tǒng)的第3天延長(zhǎng)至第5天換液；用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)；細(xì)胞融合至約80%~85%后傳代。
[0036]步驟五結(jié)束后，原代培養(yǎng)結(jié)束，可以根據(jù)需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的方法如下:
[0037]1、吸取瓶中培養(yǎng)液用PBS沖洗一次；
[0038]2.加入ImL0.05%-0.01%的胰蛋白酶-EDTA，輕輕搖動(dòng)，30s ;
[0039]3.37°C的環(huán)境下放置一段時(shí)間，直至角化細(xì)胞分離。
[0040]4.用5ml的PBS沖洗培養(yǎng)瓶后將細(xì)胞懸液移至離心管中以終止消化，以1000r /min 離心 5min ；
[0041]5.棄上清，加入IOml完全培養(yǎng)液，用IOml的吸液管吹打成單細(xì)胞懸液。分別接種于兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，3天后換液，每周更換2次培養(yǎng)液。
[0042]6.用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)；
[0043]7.細(xì)胞融合至約80%后傳代。
[0044]步驟六，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，通過(guò)PCR對(duì)HPV進(jìn)行分型檢測(cè)；免疫熒光檢測(cè)及PCR技術(shù)為本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)，這里不再贅述。
[0045]原代細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn):
[0046]CIN組織中分離出的細(xì)胞數(shù)大約在5~10X104，細(xì)胞的活性大約在95%以上。第一天和第三天時(shí)，分別有約30%和60%以上的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。收集第三天未貼壁的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)定顯示細(xì)胞活性仍在80%以上，但是在接下來(lái)的三天時(shí)僅有30%的細(xì)胞在新的培養(yǎng)基中貼壁，同時(shí)，可能由于細(xì)胞密度較低，貼壁的細(xì)胞逐漸凋亡。因此，我們將首次換液時(shí)間改為第五天，結(jié)果有70%~80%的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，明顯提高了細(xì)胞的貼壁率。培養(yǎng)至第7-8天時(shí)，CIN細(xì)胞形成多個(gè)群落，并以其大小形態(tài)不一、細(xì)胞核增大、深染等特點(diǎn)與成纖維細(xì)胞形成鮮明的區(qū)別，當(dāng)這兩種細(xì)胞開始生長(zhǎng)的時(shí)候，都保持著各自的生長(zhǎng)和形態(tài)特點(diǎn)。培養(yǎng)至第12~14天時(shí)，成纖維細(xì)胞幾乎消失，CIN細(xì)胞融合約80%以上。上述培養(yǎng)過(guò)程重復(fù)3次，所得結(jié)果基本相似，如圖1和圖2所示。
[0047]CIN細(xì)胞的傳代培養(yǎng)特點(diǎn):
[0048]與原代細(xì)胞相比，傳代CIN細(xì)胞的生長(zhǎng)行為略有不同。24小時(shí)后，幾乎所有CIN細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)。傳代CIN細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較原代細(xì)胞快，大約傳代后第10天，約80%的細(xì)胞融合。此外，CIN細(xì)胞傳代后仍然保持其大小不一，形狀異常的形態(tài)，沒(méi)有明顯的分化現(xiàn)象，與原代細(xì)胞沒(méi)有明顯的不同。傳代3次后CIN細(xì)胞生長(zhǎng)速度逐漸減慢并凋亡。
[0049]本發(fā)明的描述是為了示例和描述起見(jiàn)而給出的，而并不是無(wú)遺漏的或者將本發(fā)明限于所公開的形式。選擇和描述實(shí)施例是為了更好說(shuō)明本發(fā)明的原理和實(shí)際應(yīng)用，并且使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明從而設(shè)計(jì)適于特定用途的帶有各種修改的各種實(shí)施例。
【權(quán)利要求】
1.一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一，取小塊人宮頸瘤變組織，小部分進(jìn)行HPV分型檢測(cè)，部分進(jìn)行培養(yǎng)； 步驟二，用I型膠原酶消化分解后制成細(xì)胞懸液； 步驟三，利用臺(tái)盼藍(lán)拒染法對(duì)細(xì)胞的活性進(jìn)行判定； 步驟四，將細(xì)胞懸液接種到低胎牛血清培養(yǎng)基且經(jīng)鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中，等待細(xì)胞貼壁； 步驟五，細(xì)胞貼壁后更換無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞進(jìn)行純化，每周更換至少兩次培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合至80%~85%后傳代； 步驟六，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，通過(guò)PCR對(duì)HPV進(jìn)行分型檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，在上述步驟一中，用3%~5%醋酸和盧格氏碘溶液標(biāo)記病變組織，在陰道鏡引導(dǎo)下活檢鉗鉗取宮頸上皮內(nèi)瘤變組織約2~3mm3，在甲硝唑液體中浸泡4~6分鐘，將宮頸上皮內(nèi)瘤變組織取出后置于轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中3°C~5°C低溫保存。
3.如權(quán)利要求2所述的一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基含有2000U / ml青霉素、2000ug / ml鏈霉素和5ug / ml兩性霉素。
4.如權(quán)利要求2所述的一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，在上述步驟二中，取出宮頸上皮內(nèi)瘤變組織放入陪替氏培養(yǎng)基中；在無(wú)菌條件下，將宮頸上皮內(nèi)瘤變組織用含有青霉素、鏈霉素和兩性霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2~4次； 將宮頸上皮內(nèi)瘤變組織剪碎，加入預(yù)熱至36°C~38°C的I型膠原酶，然后將其移入無(wú)菌離心管中，用I型膠原酶沖洗陪替氏培養(yǎng)基并將沖洗液加入同一離心試管中；將離心試管放在置于電熱恒溫振蕩器中，慢慢攪動(dòng)25~35min，用吸液管吹打離散1~3min ； 然后用吸液管吸取含有單個(gè)細(xì)胞的液體，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾至無(wú)菌離心管中；用PBS沖洗離心管后將沖洗液過(guò)濾至同一離心管中；將含有單細(xì)胞懸液的離心管放置臺(tái)式離心機(jī)上，以 1000r / min 離心 4 ~6min ； 棄上清液，重新加入完全培養(yǎng)液，用吸液管吹打成單細(xì)胞懸液；利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
5.如權(quán)利要求4所述的一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于:所述PBS中青霉素、鏈霉素和兩性霉素的濃度分別為200U / ml、200ug / ml和5ug / ml。
6.如權(quán)利要求1所述的一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，在上述步驟四中，將細(xì)胞分離后的細(xì)胞懸液接種在鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中，所用完全培養(yǎng)基為含有4%~6% FBS的無(wú)血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基(K-SFM);將培養(yǎng)瓶放置含4%~6% CO2且溫度為36°C~38 °C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等待細(xì)胞貼壁。
7.如權(quán)利要求6所述的一種宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法,其特征在于,在上述步驟五中，細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行細(xì)胞換液，所用完全培養(yǎng)基更換為K-SFM ;每周至少2次更換培養(yǎng)液；用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)；細(xì)胞融合至約80%~85%后傳代。
8.如權(quán)利要求6所述的一種宮 頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)瓶選用T25培養(yǎng)瓶。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103602630SQ201310637730
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】劉玉珍 申請(qǐng)人:劉玉珍