蝴蝶蘭PhEFP1基因、其編碼的蛋白及其啟動子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種蝴蝶蘭PhEFP1基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)和引導(dǎo)該基因進(jìn)行表達(dá)的啟動子。本發(fā)明的蝴蝶蘭PhEFP1基因具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；所編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列；引導(dǎo)該基因表達(dá)的啟動子具有SEQ?ID?NO:3所示的核苷酸序列。本發(fā)明也提供了一種用于檢測蝴蝶蘭PhEFP1基因在蝴蝶蘭不同組織和器官中的表達(dá)量方法，和用于該方法的DNA引物。啟動子序列分析表明，蝴蝶蘭PhEFP1基因的啟動子序列存在多種啟動子元件，包含花分生組織特異基因LEAFY和AGAMOUS響應(yīng)元件、與花發(fā)育相關(guān)的MADS類AGL15響應(yīng)元件，及與光調(diào)控、激素信號、抗病、抗逆境和生理節(jié)律等相關(guān)響應(yīng)元件。啟動子功能活性分析表明，該基因的啟動子具有驅(qū)動GUS基因在煙草中表達(dá)的能力。
【專利說明】蝴蝶蘭PhEFPI基因、其編碼的蛋白及其啟動子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)中的基因領(lǐng)域，具體涉及在蝴蝶蘭中與開花時(shí)間相關(guān)的PhEFPl (early flowering proteinl)基因及其啟動子、含有該基因或該基因的啟動子的重組植物表達(dá)載體、含有上述重組植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化體，以及PhEFPl基因在促進(jìn)植物開花上的應(yīng)用，還有應(yīng)用Real-time PCR檢測PhEFPl基因在蝴蝶蘭植株不同部位中表達(dá)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蝴蝶蘭屬蘭科(Orchidaceae)蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)植物,其花色艷麗,色澤豐富，具極高觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于大部分蝴蝶蘭品種的營養(yǎng)生長階段比較長，為提高商品價(jià)值，須調(diào)節(jié)蝴蝶蘭的花期，使其達(dá)到全年開花，特別是應(yīng)中國傳統(tǒng)節(jié)日春節(jié)開花。目前，生產(chǎn)上多采用低溫處理來調(diào)節(jié)蝴蝶蘭的花期，以應(yīng)對消費(fèi)者在不同時(shí)間的需求(Chen etal.，2008)。因此，研究低溫誘導(dǎo)蝴蝶蘭花芽分化和發(fā)育相關(guān)的分子機(jī)理一直是蝴蝶蘭研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，如將蝴蝶蘭不同品種(P.aphrodite subsp.formosana, P.equestris和P.bellina)的不同組織，如花序、花芽、根、嫩葉、老葉、冷脅迫葉、病菌浸染葉、原球莖、低溫誘導(dǎo)的花梗芽和盛開5天的花，混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得8，233個(gè)contigs和34，630個(gè) singletons(Hsiao et al., 2011 )。此外，將低溫誘導(dǎo)的 P.aphrodite subsp.formosana花芽進(jìn)行了小RNA的測序，共獲得11129條miRNA序列(An et al.，2011)。盡管這些轉(zhuǎn)錄組和smRNA數(shù)據(jù)在基因組學(xué)和生物技術(shù)方面提供了有益的信息，但是這些基因和smRNAs的全長和功能尚未闡明。
[0003]為分離和鑒定低溫誘導(dǎo)蝴蝶蘭生殖轉(zhuǎn)變的相關(guān)基因，本實(shí)驗(yàn)室以低溫誘導(dǎo)的蝴蝶蘭的花梗芽和處于營養(yǎng)生長階段的頂葉為檢測方和驅(qū)動方，利用抑制消減雜交法構(gòu)建了正向cDNA文庫。通過EST測序、生`物信息學(xué)分析及Real-time PCR檢測，獲得了一批開花調(diào)控相關(guān)的基因片段，包括蝴蝶蘭early flowering proteinl基因(PhEFPl)片段FS33(GenBank登錄號JK720330)。在蘆笑中，其early flowering proteinl基因在營養(yǎng)生長期向生殖生長轉(zhuǎn)變的早期，有很高水平的表達(dá)，而且開花速率與early flowering proteinl的蛋白量呈相關(guān)性(Yeo et al.，1996)。然而，蝴蝶蘭PhEFPl的全長cDNA序列和啟動子序列沒有被公開，也沒有任何蝴蝶蘭PhEFPl的啟動子被鑒定。
[0004]為進(jìn)一步了解蝴蝶蘭PhEFPl基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，我們克隆了蝴蝶蘭PhEFPl基因的全長cDNA序列和上游的啟動子序列，并分析了 PhEFPl基因的組織表達(dá)模式、鑒定了PhEFPl基因的功能和啟動子活性，為闡明蝴蝶蘭PhEFPl的表達(dá)調(diào)控機(jī)理和在其它植物中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供了一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的、與蝴蝶蘭花梗芽分化與發(fā)育密切相關(guān)的PhEFPl基因的cDNA全長序列，及其編碼的氨基酸序列。[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了應(yīng)用Real-time PCR檢測PhEFPl基因在蝴蝶蘭植株不同組織和器官中的表達(dá)量的方法。
[0007]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了一種新克隆的來源于蝴蝶蘭的PhEFPl基因的啟動子，用于驅(qū)動外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。
[0008]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供了一種含有上述啟動子序列的植物基因表達(dá)載體、含有上述啟動子序列的植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、組織和植物個(gè)體。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了 PhEFPl基因在縮短植物開花時(shí)間中的應(yīng)用。 [0010]本發(fā)明是通過授權(quán)專利“蝴蝶蘭FT基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列”(專利號201110158978.7)中所述的抑制消減雜交文庫，從該文庫中篩選到克隆子FS33(GenBank登錄號JK720330,含5，非編碼區(qū)，5’ UTR),根據(jù)FS33序列設(shè)計(jì)基因特異引物，利用RACE技術(shù)克隆到蝴蝶蘭雜交種Phalaenopsis hybrid Fortune saltzman的earlyflowering proteinl基因的全長cDNA序列。該cDNA序列全長720bp,其序列如序列表中SEQ ID NO:1所述，將該基因命名為PhEFPl。PhEFPl的開放閱讀框?yàn)閺?’端第36位至第512位堿基，共477bp，其編碼蛋白的氨基酸序列具有158個(gè)氨基酸殘基，將該蛋白命名為PhEFPl，其序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。
[0011]將PhEFPl蛋白在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp搜索，結(jié)果顯示，PhEFPl蛋白具有SRPBCC (START/RHO_alpha_C/PITP/Bet_vl/CoxG/CalC) superfamily 保守結(jié)構(gòu)域、Bet v1-1ike (Pathogenesis-related protein Bet v I family,主要花粉過敏原)保守結(jié)構(gòu)域、多個(gè)氨基乙酸富含環(huán)和配基結(jié)合位點(diǎn)。PhEFPl蛋白分別與油棕的early floweringproteinl (ACF06553.1)有 58% 的同源性、與風(fēng)信子的 pathogenesis-related protein(AAS20971.1)有 54% 的同源性，與蘆筍的 early flowering proteinl (AAB09084.1)有 53%的同源性。
[0012]本發(fā)明所述的檢測PhEFPl基因在蝴蝶蘭植株不同組織和器官中的表達(dá)量的方法，包括如下步驟:
[0013](I)分別提取各樣品的總RNA，再將不同樣品的RNA分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈；
[0014](2)根據(jù)核苷酸序列SEQ ID NO: 1，設(shè)計(jì)如下引物作為Real-time PCR的引物來擴(kuò)增目的片段長為186bp的特異區(qū)段:
[0015]PhEFPl-F:5’ -TCCTCCCCGACATCATCACC-3’〈SEQ ID N0:5>,
[0016]PhEFPl-R:5’ -ACTTCTTCCCCAAATCTCCA-3’〈SEQ ID N0:6>,
[0017]以蝴蝶蘭的actin (AY134752.1)作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異引物:
[0018]actin-F:5’ -CAGTGTTTGGATTGGAGGTT-3’ 〈SEQ ID N0:7>,
[0019]actin-R:5’ -TCTCGGGTTCCATTTCCATC-3’ 〈SEQ ID N0:8>,
[0020]擴(kuò)增長為139bp目的片段；
[0021](3) Real-time PCR反應(yīng)體系的組成、PCR擴(kuò)增、數(shù)據(jù)分析及作圖。
[0022]根據(jù)Real-time PCR試驗(yàn)結(jié)果，獲得PhEFPl基因在蝴蝶蘭不同組織和器官中的表達(dá)量。
[0023]在本發(fā)明的實(shí)施例中，是通過分別提取了蝴蝶蘭40mm大小的花梗芽、5個(gè)不同發(fā)育階段的花蕾、開花2d內(nèi)的花、及花器官如子房、萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱、營養(yǎng)階段的頂葉、成熟葉及根的總RNA，再將不同樣品的RNA (1.0 u g)分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈；根據(jù)前述的核苷酸序列SEQ ID NO:1，設(shè)計(jì)Real-time PCR引物來擴(kuò)增其特異區(qū)段，PhEFPl-F:5’-TCCTCCCCGACATCATCACC-3’ 和 PhEFPl-R:5’ -ACTTCTTCCCCAAATCTCCA-3’，目的片段長為186bp。以蝴蝶蘭的actin(AY134752.1)作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異引物actin_F:5’ -CAGTGTTTGGATTGGAGGTT-3’ 和 actin-R:5’ -TCTCGGGTTCCATTTCCATC-3’，目的片段長為139bp，其中，蝴蝶蘭的actin (AY134752.1)作為內(nèi)參基因是通過登錄GenBank而獲取。根據(jù)Real-time PCR試驗(yàn)結(jié)果，圖4所示，可判斷PhEFPl基因在蝴蝶蘭不同組織和器官中的表達(dá)量。從圖4可看出，PhEFPl基因在所檢測的組織中都有不同豐度的表達(dá)。與在營養(yǎng)生長階段的根和葉中的表達(dá)量相比，PhEFPl基因在40mm大小的花梗芽中的表達(dá)量明顯上升，而在花蕾發(fā)育后期(FS2-FS5)、整花及花器官中的表達(dá)量均顯著下降(圖4)?；谶@些結(jié)果，推測PhEFPl基因既參與蝴蝶蘭的營養(yǎng)生長，又參與蝴蝶蘭的生殖生長，且其與花梗芽的發(fā)育有著密切關(guān)系。
[0024]本發(fā)明人將上述PhEFPl基因的編碼區(qū)與植物表達(dá)載體連接，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將含有PhEFPl基因的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到擬南芥中，通過抗性篩選獲得含有PhEFPl基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在開花時(shí)間上，轉(zhuǎn)PhEFPl基因的擬南芥比野生型擬南芥提前開花，20株轉(zhuǎn)化株的平均開花時(shí)間為22天，而野生型的平均開花時(shí)間為27天。由此表明，PhEFPl基因在擬南芥中超量表達(dá)能縮短開花時(shí)間。因此，PhEFPl基因具有調(diào)控開花時(shí)間的功能。
[0025]本發(fā)明實(shí)施例中提供的啟動子的DNA序列，如SEQ ID NO: 3所示，代表的是蝴蝶蘭PhEFPl基因的起始密碼子ATG上游2961bp的DNA片段。在線啟動子元件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，PhEFPl基因轉(zhuǎn)錄可能位于翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游35bp的堿基(ATCCACACC)處，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游_33bp處有I個(gè)TATA-box，-99bp處含有I個(gè)CAAT_box順式作用元件，說明PhEFPl基因起始密碼子ATG 上游2961bp的DNA序列具有明顯的啟動子特征(圖7)。分析還發(fā)現(xiàn)，該DNA序列中含花分生組織特異基因LEAFY和AGAM0US響應(yīng)單元CCAATGT1個(gè)，與花發(fā)育相關(guān)的MADS類AGL15基因響應(yīng)元件CffffffffffffffffG有5個(gè)(表1和圖7)。此外，還含有多個(gè)光強(qiáng)、脫水、黃化、傷害、金屬離子、低溫、植物激素、抗病相關(guān)響應(yīng)元件(表1和圖7)。
[0026]本發(fā)明人將上述PhEFPl基因的啟動子序列與⑶S報(bào)告基因連接構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將含啟動子序列的重組植物基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到煙草的葉片中，經(jīng)共培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和篩選后，獲得煙草轉(zhuǎn)基因株系；然后，GUS組織化學(xué)染色檢測瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化含PhEFPl基因的啟動子序列的重組植物基因表達(dá)載體的煙草的葉片顯示藍(lán)色，而未轉(zhuǎn)化的植株葉片無藍(lán)色。由此表明，PhEFPl基因的啟動子能夠調(diào)控GUS基因在煙草內(nèi)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。因此，PhEFPl基因的啟動子具有啟動子活性。
[0027]從上述結(jié)果分析可表明，本發(fā)明所闡述的來自于蝴蝶蘭PhEFPl基因的啟動子區(qū)域的序列可作為一個(gè)啟動子元件插在DNA雙元載體中而用于所有能夠使用該啟動子的植物的轉(zhuǎn)化來表達(dá)目的基因。在構(gòu)建的表達(dá)載體中，與該啟動子連接的可以是任何目的基因序列。
[0028]因此，本發(fā)明提供的PhEFPl基因、其編碼蛋白及其啟動子在植物基因工程領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】[0029]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0030]圖1 蝴蝶蘭 PhEFPl 基因 3’RACE 電泳結(jié)果。M,DL2000DNA marker,泳道 I 為 PhEFPl基因的3’ RACE PCR產(chǎn)物 。
[0031]圖2蝴蝶蘭PhEFPl基因序列同源性比對圖。
[0032]圖3蝴蝶蘭PhEFPl基因cDNA全長及其對應(yīng)的氨基酸序列；ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子，下劃線AATAA為加尾信號。
[0033]圖4氨基酸序列比對；A，蝴蝶蘭PhEFPl基因編碼的蛋白通過NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果。B,各 GenBank 登錄號分別為 Asparagus off icinalis(AAB09084.1 )、Elaeisguineensis (ACF06553.1)和 Hyacinthus orientalis (AAS20971.1，，:，和‘.’分別表示缺口，一致性，相似性和半相似性的氨基酸殘基。
[0034]圖5蝴蝶蘭PhEFPl基因的表達(dá)量分析；A，蝴蝶蘭不同組織和器官:FS1_FS5，為不同發(fā)育時(shí)期的花蕾；FS6，盛開的整花;FS7,花萼;FS8，花瓣；FS9，唇瓣；FS10，合蕊柱；FS11，子房；FS12-FS14，分別為營養(yǎng)生長階段的根、成熟葉和頂葉；FS15，為40mm大小的花梗芽；B，real-time PCR檢測結(jié)果。
[0035]圖6蝴蝶蘭PhEFPl基因啟動子克隆的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；M1，DL2000DNA marker,泳道1，2，3，4分別為基因組DNA被Dra I ,EcoR V, Pvu II和Stu I酶切后為模板，進(jìn)行的第 2 次 PCR 的產(chǎn)物；M2, Ikb DNA marker。
[0036]圖7A蝴蝶蘭PhEFPl基因啟動子序列及預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
[0037]圖7B蝴蝶蘭PhEFPl基因啟動子序列及預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(圖7B為圖7A續(xù)表)。
【具體實(shí)施方式】
[0038]植物材料蝴蝶蘭雜交種Phalaenopsis hybrid Fortune saltzman,在人工智能溫室栽培。試驗(yàn)用的大腸桿菌DH5a菌株購自鼎國公司，LA Taq、rTaq、pMD_18Tvector、IkbDNA Marker 和 DNase I (RNase free)購自 TaKaRa 公司，DNA 膠回收試劑盒購自 TIANGEN公司，SMART? PCR cDNA Synthesis Kit>Advantage2PCR Kit>Advantage2Polymerase Mix和 Genome Walker? Universal Kit 購自 Clontech 公司，DL2000DNA Marker 購自普博欣公司；測序和引物合成均由Invitrogen公司完成。
[0039]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。
[0040]實(shí)施例1總RNA和基因組DNA的提取
[0041]以蝴蝶蘭40mm大小的花梗芽為材料，采用改良異硫氰酸胍法提取花梗芽的總RNA。RNA用Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)(Thermo，USA)分析濃度和質(zhì)量，結(jié)合1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0042]以蝴蝶蘭40mm大小的花梗芽為材料，采用改良CTAB法提取蝴蝶蘭的基因組DNA。DNA用Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)分析濃度和質(zhì)量，結(jié)合0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0043]實(shí)施例2cDNA第一鏈和第二鏈的合成
[0044]cDNA 第一鏈的合成:按照 SMART? PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech，USA)的操作步驟，取蝴蝶蘭花梗芽的總RNAl.0yg，與反轉(zhuǎn)錄引物3’ SMART⑶S Primer IIΑ(12μΜ)1.0μ I混合均勻，PCR儀上72°C，3min，接著42°C，2min，快速取出，放于室溫，然后加入 5XFirst Strand Buffer2 μ I, DTT(IOOmM)0.25 μ I, dNTP Mix(10mM of eachdNTP)I μ I, SMART II A Oligonucleotide(12 μ M)I μ I, Rnase inhibitor0.25 μ I, PowerScript Reverse Transcriptase (100U) I μ I,反應(yīng)體系為 10 μ I。反應(yīng)程序?yàn)?42°C 60min,72°C 7min, _20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0045]cDNA第二鏈的合成:將PCR儀預(yù)熱到95°C，取2 μ I稀釋10倍的第一鏈cDNA為模板，Deionized Η2082 μ 1,10XAdvantage2PCR BufferlOu I, 50X dNTP (IOmM of eachdNTP)2.0 μ I, 5，PCR Primer II A(12 μ M)2.0 μ I,50XAdvantage2Polymerase Mix2.0 μ I,反應(yīng)體系為 100 μ I。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C Imin ；95°C 15s，65。。30s，68°C，6min，20cycles。擴(kuò)增后，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0046]實(shí)施例3PhEFPl基因cDNA全長的克隆
[0047]根據(jù)FS33序列(含5’ UTR)，設(shè)計(jì)正向基因特異引物擴(kuò)增3’端，引物為PhEFPl.FP15’TGTGAAGGAGCGGCTTGATT3’〈SEQ ID NO:4>，然后以稀釋 10 倍的雙鏈 cDNA 為模板，以PhEFPl.FPl和3’ SMART CDS Primer II A為引物擴(kuò)增目的基因片段。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 4min ；94°C 30s, 58.5°C 30s, 72°C，lmin, 30cycles ；72°C，7min。
[0048]PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的片段。將回收產(chǎn)物連接到PMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，陽性克隆送公司進(jìn)行雙向測序。測序所得序列再與FS33序列利用Clustal X (1.8)軟件進(jìn)行拼接。
[0049]實(shí)施例4PhEFPl基因`及其編碼蛋白序列的生物信息學(xué)分析
[0050]將拼接序列用BLAST軟件進(jìn)行同源性比對，以確定為蝴蝶蘭early floweringproteinl基因(PhEFPl)的同源序列。通過blastx分析可知，PhEFPl的全長cDNA序列與油掠(Elaeis guineensis) early flowering proteinl 基因編碼蛋白 ACF06553.1 的序列同源性最高，達(dá)到58% (如圖2所示)。
[0051]該P(yáng)hEFPl基因的cDNA全長為720bp (圖3)，其序列如SEQ ID NO:1所示，其開放閱讀框?yàn)閺?’端第36位至第512位堿基，共477bp，其編碼蛋白的氨基酸序列具有158個(gè)氨基酸殘基(圖3)，其序列如SEQ ID N0:2所示。該P(yáng)hEFPl蛋白的等電點(diǎn)和分子量分別為
6.30和16879.29。將PhEFPl蛋白在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp搜索，結(jié)果表明，PhEFPl蛋白具有 SRPBCC (START/RH0_a I pha_C/P I TP/Be t_v I /CoxG/Ca IC ) superfamily 保守結(jié)構(gòu)域、Bet V 1-1ike (Pathogenesis-related protein Bet v I family,主要花粉過敏原)保守結(jié)構(gòu)域、多個(gè)氨基乙酸富含環(huán)和配基結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。Blastp也表明，該P(yáng)hEFPl蛋白與油掠(E.guineensis) early flowering proteinl (ACF06553.1)有 58% 的同源性、與風(fēng)信子(Hyacinthus orientalis) pathogenesis-related protein (AAS20971.1)有 54% 的同源性，與蘆笑(Asparagus officinalis)early flowering proteinl (AAB09084.1)有 53% 的同源性。比對結(jié)果如圖4所示。
[0052]實(shí)施例5PhEFPl基因的表達(dá)模式分析
[0053]取蝴蝶蘭分化發(fā)育出的40mm大小的花梗芽、5個(gè)不同發(fā)育階段的花蕾Fsl_Fs5、開花2d內(nèi)的花Fs6及花器官如子房、萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱、營養(yǎng)階段的頂葉、成熟葉及根為材料(圖5)，分別提取各樣品的總RNA，方法如前述。分別取各樣品的RNA1.0ug,然后分別反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 第一鏈(PrimeScript? Reverse Transcriptasekit, Takara)0根據(jù)前述的核苷酸序列SEQ ID NO:1,設(shè)計(jì)Real-time PCR引物來擴(kuò)增其特異區(qū)段，PhEFPl-F:5，-TCCTCCCCGACATCATCACC-3，〈SEQ ID N0:5> 和 PhEFPl-R:5’ -ACTTCTTCCCCAAATCTCCA-3’ 〈SEQ ID N0:6>,目的片段長為 186bp。以 GenBank登錄的蝴蝶蘭的actin (AY134752.1)作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異引物actin_F:5’ -CAGTGTTTGGATTGGAGGTT-3’〈SEQ ID N0:7> 和 actin-R:5’-TCTCGGGTTCCATTTCCATC-3’〈SEQID N0:8>,目的片段長為139bp。將前述的第一鏈cDNA稀釋10倍作為Real-time PCR反應(yīng)的模板；Real-time PCR反應(yīng)體系為:SYBR premix Ex taq?(2X) 10.0 μ 1，正反向引物(10 μ Μ)各 0.5 μ 1，滅菌 ddH207.0 μ 1，稀釋的第一鏈 cDNA2.0 μ I。利用 Light Cycler480熒光定量 PCR 儀(Roche)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?95°C 30s; 95°C 5s, 59°C 15s，72。。30s，40個(gè)循環(huán)，72°C讀取熒光值；循環(huán)結(jié)束后65°C 60s，進(jìn)行熔解曲線分析；最后40°C冷卻10s。分別使用PhEFPl和actin基因的4個(gè)濃度梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，用作標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的PCR模版。將待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到待測樣品中PhEFPl和actin基因的濃度，然后用待測樣品中的PhEFPl基因濃度值去除actin基因的濃度值，得到一個(gè)相對值。每份樣品3次PCR重復(fù)。用Excel2007錄入相對值數(shù)據(jù)和繪圖。根據(jù)Real-time PCR試驗(yàn)結(jié)果，如圖5所示，判斷PhEFPl基因在蝴蝶蘭不同組織和器官中的表達(dá)量。從圖5可看出，PhEFPl基因在所檢測的組織中都有不同豐度的表達(dá)。與在營養(yǎng)生長階段的根和葉中的表達(dá)量相比，PhEFPl基因在40mm大小的花梗芽中的表達(dá)量明顯上升，而在花蕾發(fā)育后期(FS2-FS5 )、整花Fs6及花器官中的表達(dá)量均顯著下降(圖5)。根據(jù)這些結(jié)果，推測PhEFPl基因既參與蝴蝶蘭的營養(yǎng)生長，又參與蝴蝶蘭的生殖生長，且其與花梗芽發(fā)育關(guān)系密切。
[0054]實(shí)施例6PhEFPl基因在擬南芥中的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定
[0055]以pCAMBIA1303 (CAMBIA, Canberra)為基礎(chǔ)，構(gòu)建 35S 啟動子驅(qū)動 PhEFPl 基因的植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，具體步驟如下:
[0056]根據(jù)PhEFPl 基因的 cDNA序列，設(shè)計(jì)引物PhEFPl.5’Nco 1: 5?-CCATGGATGGCTTCCAACTGGTCGGTA-3’(下劃線為Nco I 酶切位點(diǎn))〈SEQ ID NO:9>和PhEFPl.3’Spe 1: 5，-ACTAGTTGCATAGGTTCCAGGATTGG-3’(下劃線為Spe I酶切位點(diǎn)XSEQ ID NO: 10>。以實(shí)施例2合成的第二鏈cDNA為模板，以PhEFPl.5’ Nco I和PhEFPl.3’ Spe I為引物，擴(kuò)增PhEFPl基因的不含終止密碼子的編碼區(qū)片段。然后，電泳PCR產(chǎn)物、割膠回收連接到pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化DH5 a菌株，挑取陽性克隆經(jīng)菌液PCR和測序鑒定正確后，提取質(zhì)粒獲得pMD_18T_PhEFPl。
[0057]取20 μ I pMD-18T-PhEFPl 用 Nco I 和 Spe I 在 37°C雙酶切 4h，酶切產(chǎn)物在 1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，回收編碼區(qū)片段；將PCAMBIA1303載體同樣用Nco I和Spe I在37°〇雙酶切411，651:水浴IOmin后，加入堿性磷酸酶CIP37°C放置0.5h，65°C水浴lOmin，酶切產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳并回收大片段；分別取回收的收編碼區(qū)片段和酶切處理PCAMBIA1303回收的片段進(jìn)行連接，連接體系為20 μ 1，各組份如下:10ΧΤ4連接緩沖液2 μ 1，酶切PCAMBIA1303處理的片段6μ 1，回收的編碼區(qū)片段11 μ 1，T4DNA連接酶1μ 1，連接反應(yīng)于4°C條件下過夜。然后，取8μ1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a菌株，并涂于含有50 μ g/ml Kan (卡那霉素)的LB平板上，37°C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑取單菌落于液體LB培養(yǎng)液(含50μ g/ml Kan)中，37°C進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，選擇陽性克隆提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，并進(jìn)一步測序確認(rèn)收編碼區(qū)序列的正確性，并命名為pCAMBIA1303-35S-PhEFPl。
[0058]將構(gòu)建的由35S啟動的PhEFPl基因植物表達(dá)載體(pCAMBIA1303_35S_PhEFPl)采用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105,具體方法參照Cui W等[Rapid, high efficienttransformation of foreign DNA to Agrobacterium tumefaciens.Chinese Journal ofBiotechnology, 1995，11 ⑷:350-355] 0
[0059]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的改良花序侵染法對擬南芥(Ler型)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體方法參照 Logemann 等[An improved method for preparing agrobacterium cells thatsimplifies the Arabidopsis transformation protocol.Plant Methods, 2006，2:16]。經(jīng)過潮霉素抗性篩選后，獲得轉(zhuǎn)基因候選擬南芥株系。提取候選轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的葉片基因組DNA，以其為模板，未轉(zhuǎn)化植株為對照，以PhEFPl.5’ Nco I和PhEFPl.3’ Spe I為引物，進(jìn)行PCR檢測。然后，在長日照條件(16-h light/8-h dark，濕度60-80%，溫度22°C )下種植轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(T2代)和野生型(Ler型)，用于形態(tài)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在開花時(shí)間上，轉(zhuǎn)PhEFPl基因的植株比野生型提前開花，20株轉(zhuǎn)化株的平均開花時(shí)間為22天，而野生型的平均開花時(shí)間為27天。
[0060]由上述結(jié)果分析表明，PhEFPl基因在擬南芥中超量表達(dá)能縮短開花時(shí)間；PhEFPl基因具有調(diào)控開花時(shí)間的功能。
[0061]實(shí)施例7PhEFPl基因啟動子的克隆及分析
[0062]根據(jù)Genome Walker? Universal Kit操作說明，基因組DNA用平末端限制酶EcoRV、Dra 1、Stu I和Pvu II酶切過夜，分別純化回收；回收產(chǎn)物與Genome Walker Adaptor連接，16°C連接過夜，連接產(chǎn)物稀釋10倍，置于-20°C保存，作為步移PCR的擴(kuò)增模板。根據(jù)PhEFPl基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)兩條巢式引物(PhEFPl.GSPl，PhEFPl.GSP2)，與接頭上的兩個(gè)引物AP1、AP2形成兩對引物。Genome Walking至少要經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增。第一輪，以連接產(chǎn)物為模板，APl和GSPl為引物進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)?94°C 25s，72°C 3min，7個(gè)循環(huán)；94°C 25s，67°C 3min，32個(gè)循環(huán)；67°C延伸7min。以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板，AP2和GSP2為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，程序?yàn)?94°C25s，72°C3min，5 個(gè)循環(huán);94°C 25s，67°C 3min，21 個(gè)循環(huán)；67°C延伸7min。第2次PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖6所示。電泳分離后回收合適片段，然后連接到PMD18-T載體中，16°C連接過夜。連接產(chǎn)物用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂于含Amp (氨芐青霉素)50 μ g/mL的LB平板，37°C培養(yǎng)16_20h，挑取單克隆菌落于含Amp50 μ g/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)16h，菌液PCR鑒定陽性克隆，然后送測序公司測序。
[0063]APl:5’ GTAATACGACTCACTATAGGGC3’ ；AP2:5’ ACTATAGGGCACGCGTGGT3’ ；
[0064]PhEFPl.GSPl: 5’ TTGATCTGTCTGATGCTCCCTGGATTACC3’〈SEQ ID N0:11> ；
[0065]PhEFPl.GSP2:5’ GCTCCCTGGATTACCATCGCCGGAAAGTG3’〈SEQ ID N0:12>。
[0066]通過測序，確定PCR擴(kuò)增出PhEFPl基因起始密碼子ATG上游2961bp的DNA片段。應(yīng)用PLACE (http://www.dna.affrc.g0.jp/PLACE/)在線啟動子元件預(yù)測分析。分析發(fā)現(xiàn)，PhEFPl基因轉(zhuǎn)錄可能位于翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游35bp的堿基(ATCCACACC)處，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游_33bp處有I個(gè)TATA-box，-99bp處含有I個(gè)CAAT_box順式作用元件，說明PhEFPl基因起始密碼子ATG上游2961bp的DNA序列具有明顯的啟動子特征(圖7)。
[0067]分析還發(fā)現(xiàn)，該DNA序列中含花分生組織特異基因LEAFY和AGAM0US響應(yīng)單元CCAATGTI個(gè)，與花發(fā)育相關(guān)的MADS類AGL15基因響應(yīng)元件CffffffffffffffffG有5個(gè)(表1)。此外，還含有多個(gè)光強(qiáng)、脫水、黃化、傷害、金屬離子、低溫、植物激素、抗[0068]表1應(yīng)用PLACE在線預(yù)測蝴蝶蘭PhEFPl基因啟動子區(qū)順式作用元件
[0069]
【權(quán)利要求】
1.一種蝴蝶蘭PhEFPl基因，它具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.一種如權(quán)利要求1所述的蝴蝶蘭PhEFPl基因編碼的多肽，其特征在于，具有如SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
3.一種用于引導(dǎo)如權(quán)利要求1所述的蝴蝶蘭PhEFPl基因進(jìn)行表達(dá)的啟動子，它具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
4.一種含有權(quán)利要求1所述的PhEFPl基因編碼區(qū)序列的重組植物表達(dá)載體。
5.一種含有權(quán)利要求1所述的PhEFPl基因編碼區(qū)序列的植物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織或個(gè)體。
6.一種含有權(quán)利要求3所述的啟動子序列的重組植物表達(dá)載體。
7.一種含有權(quán)利要求3所述的啟動子序列的植物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織或個(gè)體。
8.一種用于檢測PhEFPl基因在蝴蝶蘭不同組織器官中的表達(dá)量的方法，其特征在于包括如下步驟: 分別提取了蝴蝶蘭不同組織器官的總RNA，再將不同組織器官的RNA分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈；根據(jù)核苷酸序列SEQ ID NO: 1，設(shè)計(jì)如下引物作為Real-time PCR的引物來擴(kuò)增目的片段長為186bp的特異區(qū)段:
PhEFPl-F:5’ -TCCTCCCCGACATCATCACC-3’，
PhEFPl-R:5’ -ACTTCTTCCCCAAATCTCCA-3’， 根據(jù)Real-time PCR試驗(yàn)結(jié)果，獲得PhEFPl基因在蝴蝶蘭不同組織和器官中的表達(dá)量。
【文檔編號】C12N15/82GK103642821SQ201310636685
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】李冬梅, 呂復(fù)兵, 朱根發(fā), 孫映波 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所