一種l-蘋果酸提取新工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于氨基酸生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明涉及一種通過酸解、中和、分級(jí)膜過濾與離子交換技術(shù)在生物發(fā)酵液中提取高品質(zhì)L-蘋果酸的工藝。本發(fā)明使用磷酸進(jìn)行酸化，經(jīng)微濾膜、超濾膜過濾后除去了菌體蛋白、其他大分子雜質(zhì)以及磷酸鈣等固體；使用氫氧化鈣和碳酸鈣中和發(fā)酵液，經(jīng)磷酸酸化，再經(jīng)微濾膜、超濾膜過濾，為L(zhǎng)-蘋果酸在離子交換和冷卻蒸發(fā)器濃縮結(jié)晶創(chuàng)造了決定性條件；通過本發(fā)明工藝，一次提取L-蘋果酸產(chǎn)品純度＞99%，總體收率在90%以上，使用的磷酸為中等強(qiáng)度酸，且膜過濾設(shè)備自動(dòng)化程度高、操作穩(wěn)定、便于產(chǎn)業(yè)化推廣，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益、環(huán)境效益和應(yīng)用前景。
【專利說明】一種L-蘋果酸提取新工藝
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于氨基酸生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明涉及一種L-蘋果酸發(fā)酵液下游提取技術(shù)的新工藝，具體為一種L-蘋果酸提取新工藝。
【背景技術(shù)】
[0003]蘋果酸，又名2 —羥基丁二酸，由于分子中有一個(gè)不對(duì)稱碳原子，有L 一蘋果酸、D 一蘋果酸和DL-蘋果酸3種異構(gòu)體。天然存在的蘋果酸都是L型的，幾乎存在于一切果實(shí)中，以仁果類中最多。它可以從山楂、蘋果和葡萄果實(shí)的漿汁中提取，也可由延胡索酸經(jīng)生物發(fā)酵制得。它是人體內(nèi)部循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，易被人體吸收，因此作為性能優(yōu)異的食品添加劑和功能性食品廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)療和保健品等領(lǐng)域。外消旋體可由延胡索酸或馬來酸在催化劑作用下于高溫高壓條件和水蒸氣作用制得。
[0004]L一蘋果酸為天然果汁之重要成份，味道柔和，具特殊香味，不損害口腔與牙齒，代謝上有利于氨基酸吸收，不積累脂肪，是新一代的食品酸味劑，被生物界和營(yíng)養(yǎng)界譽(yù)為“最理想的食品酸味劑”。目前在老年及兒童食品中正取代檸檬酸。L一蘋果酸是人體必需的一種有機(jī)酸，也是一種低熱量的理想食品添加劑。
[0005]L 一蘋果酸是生物體三羧酸的循環(huán)中間體，口感接近天然果汁并具有天然香味，與檸檬酸相比，產(chǎn)生的熱 量更低，口味更好，因此廣泛應(yīng)用于酒類、飲料、果醬、口香糖等多種食品中，并有逐漸替代檸檬酸的勢(shì)頭。是目前世界食品工業(yè)中用量最大和發(fā)展前景較好的有機(jī)酸之一。
[0006]L 一蘋果酸中含有天然的潤(rùn)膚成分，能夠很容易地溶解粘結(jié)在干燥鱗片狀的死細(xì)胞之間的“膠粘物”，從而可以清除皮膚表面皺紋，使皮膚變得嫩白、光潔而有彈性，因此在化妝品配方中備受青睞。
[0007]L 一蘋果酸可用于藥物制劑、片劑、糖漿中，還可以配入氨基酸溶液中，能明顯提高氨基酸的吸收率山一蘋果酸可以用于治療肝病、貧血、免疫力低下、尿毒癥、高血壓、肝衰竭等多種疾病，并能減輕抗癌藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒害作用；還可用于制備和合成驅(qū)蟲劑、抗牙垢劑等。另外L 一蘋果酸還可以作為工業(yè)清洗劑、樹脂固化劑、合成材料增塑劑、飼料添加劑等。
[0008]L-蘋果酸的生產(chǎn)最初是在培養(yǎng)黃曲霉時(shí)有少量蘋果酸伴隨琥珀酸和富馬酸產(chǎn)生。后來，由糖類物質(zhì)發(fā)酵來生產(chǎn)L-蘋果酸，但是傳統(tǒng)的發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、能耗大、產(chǎn)酸率低，糖的利用率不高，很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。隨著氨基酸行業(yè)逐步發(fā)展，發(fā)酵法生產(chǎn)技術(shù)L-蘋果酸也有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是L-蘋果酸的工業(yè)平均轉(zhuǎn)化率為70%-80%，尚有20%-30%富馬酸殘留，反應(yīng)液中L-蘋果酸的含量較低，僅為100-120g/L，目前國(guó)內(nèi)尚無規(guī)?；腖-蘋果酸生產(chǎn)方法。本發(fā)明提供了一種L-蘋果酸發(fā)酵液下游提取技術(shù)，為L(zhǎng)-蘋果酸規(guī)?；a(chǎn)提供了一種新的提取工藝，對(duì)促進(jìn)氨基酸行業(yè)發(fā)展具有非常重要的意義；同樣，在L-蘋果酸用途廣泛和市場(chǎng)緊俏的形勢(shì)下，該工藝方法表現(xiàn)出巨大的經(jīng)濟(jì)效益和發(fā)展?jié)摿Α?br> [0009]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供了一種L-蘋果酸提取新工藝，其具體涉及L-蘋果酸發(fā)酵液下游提取技術(shù)；使L-蘋果酸在實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的同時(shí)，確保產(chǎn)品品質(zhì)和生產(chǎn)與環(huán)境的和諧。
[0011]本發(fā)明提供一種L-蘋果酸提取新工藝，是通過以下技術(shù)步驟實(shí)現(xiàn)的:
I發(fā)酵液的制備:將L-蘋果酸產(chǎn)生菌株接種到種子罐培養(yǎng)，然后發(fā)酵培養(yǎng)；
2發(fā)酵液的酸解和過濾:將制備的L-蘋果酸發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到帶有攪拌的儲(chǔ)存罐中，在55-75°C下，邊攪拌邊加入磷酸，調(diào)節(jié)PH至1.5左右，停止添加，酸解后，靜置6h以上；將酸解液經(jīng)微濾膜、超濾膜過濾除去菌體和磷酸鈣，得到L-蘋果酸母液；
3蘋果酸母液的中和與酸解:在50-80°C下，將得到的L-蘋果酸母液先加入石灰乳中和80%-90%的酸，再加入碳酸鈣進(jìn)行中和，調(diào)節(jié)PH至4.1-4.4，過濾，得到蘋果酸鈣；加1_3倍體積水將L-蘋果酸鈣調(diào)成漿狀，加入磷酸，調(diào)節(jié)PH至1.5，酸解得到酸解液；過濾，除去磷酸鈣，對(duì)濾液進(jìn)行脫色處理，得到L-蘋果酸的洗脫液。
[0012]4離子交換與低溫濃縮結(jié)晶:將(3)步驟中獲得的L-蘋果酸洗脫液，經(jīng)離子交換樹脂后，收取流出液；將流出液經(jīng)冷卻式蒸發(fā)器低溫濃縮至有白色晶體出現(xiàn)后，將料液迅速轉(zhuǎn)入結(jié)晶器中，緩慢降溫結(jié)晶。
`[0013]5、結(jié)晶后的料液經(jīng)離心分離、洗滌、烘干后，獲得L-蘋果酸成品，純度達(dá)99%以上。
[0014]L-蘋果酸離心分離和洗滌產(chǎn)生的母液和洗滌水，可經(jīng)過步驟(4)濃縮結(jié)晶和步驟
(5)進(jìn)行多次提取，獲得不同純度的產(chǎn)品和末次母液。
[0015]所述發(fā)酵液制備優(yōu)選為:將霉菌混合菌液(米曲霉(Aspergillus oryzae),黃曲霉(Aspergillus flavus)兩種菌液體積比為3: 1，兩種菌液中菌體的濃度均約為lX108CFU/mL)按照10% (體積比)的接種量接入種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，在溫度為34°C，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)16小時(shí)得到液體A，其中，種子罐的培養(yǎng)基組分為:鹿糖3g，NaN03
0.2g, (NH4)2S04 0.5g, FeS04.7H20 0.01g, MnS04.H20 0.02g，MgS04 0.02g, KH2P04
0.lg，pH值6.0。然后按照液體A:發(fā)酵罐培養(yǎng)基為1: 10的體積比例轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，溫度34°C，培養(yǎng)6d，所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基組分為:葡萄糖80g/L，加玉米漿10g/L，碳酸鈣75g/L, KH2P04 0.lg/L, K2HP04 0.lg/L, (NH4)2S04 2g/L, MgS04 2 g/L, NaCl 0.2g/L, pH值 6.0 ;
所述微濾膜過濾中使用無機(jī)陶瓷材質(zhì)微濾膜，其截留分子量為500(T20000(MW，孔徑
0.1~100 μ m，操作溫度為25~50°C，工作壓力:進(jìn)壓為2~4bar，出壓為0~2bar。
[0016]所述超濾過濾，選用PAN、PC、PP、PE復(fù)合膜中的一種，其截留分子量為1000~5000麗，孔徑5~200nm，操作溫度為25~45°C，工作壓力:進(jìn)壓為7~9bar，出壓為I~4bar。
[0017]本發(fā)明具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明提供了 L-蘋果酸發(fā)酵液，使用磷酸進(jìn)行酸化，酸化后過濾得到的磷酸鈣可被硫酸酸解后，再次使用，還可防止L-蘋果酸被硫酸碳化。[0018]2、本發(fā)明提供了發(fā)酵液經(jīng)微濾膜、超濾膜過濾后除去了菌體蛋白和其他大分子雜質(zhì)，再次經(jīng)少許活性炭脫色后，獲得了無色透明的L-蘋果酸透析液，避免了過多的雜質(zhì)在離子交換過程中的負(fù)面影響。
[0019]2、膜過濾設(shè)備自動(dòng)化程度高、可控性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便；發(fā)酵液膜過濾參數(shù)穩(wěn)定，透析液性能穩(wěn)定；為高品質(zhì)L-蘋果酸提取創(chuàng)造了基礎(chǔ)條件。
[0020]3、經(jīng)過離子交換的料液，使用冷卻式蒸發(fā)器5(T60°C低溫短時(shí)間濃縮即可達(dá)到結(jié)晶濃度，有效避免了雜質(zhì)的再次產(chǎn)生。
[0021]4、本發(fā)明最終L-蘋果酸產(chǎn)品為白色結(jié)晶粉末，純度可達(dá)99%以上，比旋光度、透光率、氯化物含量等相關(guān)指標(biāo)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。
[0022]5、本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上,通過大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),采用米曲霉(Aspergillusoryzae),黃曲霉(Aspergillus flavus)兩種菌液按照一定比例混合,二者之間具備一定的協(xié)同作用，比常規(guī)的米曲霉發(fā)酵方法，能夠大大提高蘋果酸的產(chǎn)量，采用最優(yōu)比例3: I混合，其他條件不變的前提下，產(chǎn)量可提高30%左右，針對(duì)兩種霉菌的種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)，摸索最佳的培養(yǎng)成分配方，能夠獲得最佳的生產(chǎn)效率，最終獲得L-蘋果酸產(chǎn)量為150.3 g/L，且殘?zhí)呛孔钚?.7g/L。
[0023]
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1 1.發(fā)酵液酸解:制備L-蘋果酸發(fā)酵液150L:將霉菌混合菌液(米曲霉(Aspergillusoryzae),黃曲霉(Aspergillus flavus)兩種菌液體積比為3: I,兩種菌液中菌體的濃度均約為lX108CFU/mL)按照10% (體積比)的接種量接入種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，在溫度為34°C，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)16小時(shí)得到液體A，其中，種子罐的培養(yǎng)基組分為:蔗糖 3g，NaN03 0.2g, (NH4) 2S04 0.5g, FeS04.7H20 0.01g, MnS04.H20 0.02g，MgS04
0.02g，KH2P04 0.lg, pH值6.0。然后按照液體A:發(fā)酵罐培養(yǎng)基為1: 10的體積比例轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，溫度34°C，培養(yǎng)6d，所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基組分為:葡萄糖80g/L，加玉米漿10g/L，碳酸鈣 75g/L，KH2P04 0.lg/L，K2HP04 0.lg/L, (NH4) 2S04 2g/L，MgS04 2 g/L，NaCl 0.2g/L, pH 值 6.0 ;
所述米曲霉優(yōu)選為米曲霉(Aspergillus oryzae) ACCC30584 (例如參見CN2011102578402)，所述黃曲霉優(yōu)選為黃曲霉(Aspergillus flavus)ATCC 13697 (參見參考文獻(xiàn):Organic acids: old metabolites, new themes Israel Goldberg ET AL,Journal of Chemical Technology and Biotechnology);
在60°C下，邊攪拌邊加入磷酸，調(diào)節(jié)PH至1.5左右，然后經(jīng)微濾膜、超濾膜過濾，微濾膜過濾中使用無機(jī)陶瓷材質(zhì)微濾膜，其截留分子量為500(T200000MW，孔徑0.1-100 μ m,操作溫度為25~50°C，工作壓力:進(jìn)壓為3bar，出壓為lbar。超濾過濾，選用PAN復(fù)合膜，其截留分子量為100(T5000MW，孔徑5~200nm，操作溫度為30°C，工作壓力:進(jìn)壓為8bar，出壓為3bar。
[0025]除去發(fā)酵液中的菌體蛋白、大分子生物多糖、發(fā)酵過程產(chǎn)生的色素、磷酸鈣以及其他大分子或固態(tài)雜質(zhì)；獲得超濾透析蘋果酸母液，用石灰乳和碳酸鈣進(jìn)行中和，調(diào)節(jié)PH至4.3，過濾，得到蘋果酸鈣，再用2倍的水將L-蘋果酸鈣調(diào)成漿狀，再進(jìn)行過濾得到L-蘋果酸的透析濾液；對(duì)濾液進(jìn)行活性炭脫色處理，得到無色透明的L-蘋果酸透析液。
[0026]2、離子交換與低溫濃縮結(jié)晶:將(I)步驟中濃縮的L-蘋果酸透析液，經(jīng)離子交換樹脂后，收取流出液；將流出液經(jīng)蒸發(fā)器低溫濃縮至有白色晶體出現(xiàn)后，將料液迅速轉(zhuǎn)入結(jié)晶器中，緩慢降溫結(jié)晶；所述離子交換樹脂為強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂、強(qiáng)堿性陰離子交換樹月旨，粒徑為0.8mm ;所述蒸發(fā)器，蒸發(fā)溫度控制55°C，蒸發(fā)量lm3/h，蒸發(fā)濃縮臨界點(diǎn)判斷為少許有白色結(jié)晶出現(xiàn)后即刻停止蒸發(fā)；降溫結(jié)晶過程溫度下降速度0.5°C /min，最終結(jié)晶溫度8 °C，恒溫結(jié)晶0.5h。
[0027]3、結(jié)晶后的料液經(jīng)離心分離、烘干后，獲得一次提取L-蘋果酸成品19.29Kg ;一次提取母液經(jīng)降膜蒸發(fā)器再次濃縮后，離心、洗滌、干燥，獲得二次提取成品3.21Kg和末次母液。
[0028]上述L-蘋果酸產(chǎn)品經(jīng)檢測(cè)，一次提提取產(chǎn)品純度99.5%，二次提取產(chǎn)品純度98.2%，；折純后制備L-蘋果酸22.5Kg，熔點(diǎn)為90 — 100°C，比旋光度為一 2.19、硫酸鹽含量(以S04計(jì)算)小于0.03%，氯化物含量小于0.005%，透光率、重金屬含量等相關(guān)指標(biāo)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。
[0029]以上列舉的僅是本發(fā)明的最佳具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。`
【權(quán)利要求】
1.一種L-蘋果酸提取新工藝，包括如下步驟: (1)蘋果酸發(fā)酵液用磷酸進(jìn)行酸化，調(diào)節(jié)PH為1.5，酸化后靜置6h，經(jīng)微濾膜和超濾膜過濾除去雜質(zhì)得到L-蘋果酸母液； (2)將步驟(1)得到的L-蘋果酸母液用碳酸鈣中和至pH為4.1-4.4，過濾得到蘋果酸鈣；加1-3倍體積水將L-蘋果酸鈣調(diào)成漿狀，加入磷酸，調(diào)節(jié)pH至1.5左右，酸解得到酸解液；過濾，對(duì)濾液進(jìn)行脫色處理，得到L-蘋果酸洗脫液； (3)將步驟(2)獲得的L-蘋果酸洗脫液，經(jīng)離子交換樹脂后，再經(jīng)冷卻式蒸發(fā)器低溫濃縮至有白色晶體出現(xiàn)后，將料液迅速轉(zhuǎn)入結(jié)晶器中，緩慢降溫結(jié)晶；所述離子交換樹脂為強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂、強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，粒徑為0.3-1.2mm ;所述蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度控制5(T60°C，蒸發(fā)量0.5^1.5m3/h ;降溫結(jié)晶過程溫度下降速度0.2^1°C /min，最終結(jié)晶溫度(T20°C，恒溫結(jié)晶0.5~Ih; (4)產(chǎn)品分尚洗漆干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于:所述步驟(1)微濾膜過濾中使用無機(jī)陶瓷材質(zhì)微濾膜，其截留分子量為5000~200000麗，孔徑0.1~100μπι，操作溫度為25~50°C，工作壓力:進(jìn)壓為2~4bar，出壓為(T2bar ;所述超濾過濾，選用PAN、PC、PP、PE復(fù)合膜中的一種，其截留分子量為100(T5000MW，孔徑5~200nm，操作溫度為25~45°C，工作壓力:進(jìn)壓為7~9bar,出壓為I~4bar。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的工藝，其特征在于:所述步驟(4)產(chǎn)品分離洗滌干燥產(chǎn)生的母液和洗滌水，可再次經(jīng)過低溫濃縮結(jié)晶進(jìn)行多次提取，獲得不同純度的產(chǎn)品和末次母液；末次母液加入菌體蛋白濃縮液，干燥制備含有L-蘋果酸的營(yíng)養(yǎng)蛋白飼料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的工藝，其特征在于步驟(1)中發(fā)酵液的制備方法為:霉菌混合菌液按照10% (體積比)的接種量接入種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度34°C，轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)16小時(shí)得到液體A，其中，種子罐的培養(yǎng)基組分為:蔗糖3g，NaN03 0.2g，(NH4) 2S040.5g，F(xiàn)eS04.7Η20 0.01g,MnS04.Η20 0.02g ,MgS04 0.02g,KH2P04 0.1g，pH 值 6.0;然后按照液體A:發(fā)酵罐培養(yǎng)基為1: 10的體積比例轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，溫度34°C，培養(yǎng)6d，所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基組分為:葡萄糖80g/L，加玉米漿10g/L，碳酸鈣75g/L，KH2P04 0.1g/L, K2HP04 0.lg/L, (NH4)2S04 2g/L, MgS04 2 g/L, NaCl 0.2g/L, pH 值 6.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的工藝，其特征在于，所述霉菌混合菌液為:米曲霉(Aspergillus oryzae)和黃曲霉(Aspergillus flavus)兩種菌液體積比為3:1,兩種菌液中菌體的濃度均為IX 108CFU/mL ;所述米曲霉優(yōu)選為米曲霉(Aspergillus oryzae)ACCC30584，所述黃曲霉優(yōu)選為黃曲霉(Aspergillus flavus)ATCC 13697。
【文檔編號(hào)】C12P7/46GK103642853SQ201310630634
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】李德衡, 嚴(yán)紀(jì)文, 李樹標(biāo), 劉建陽, 張文麗, 賈召鵬, 魯守斌 申請(qǐng)人:山東阜豐發(fā)酵有限公司