一種提高植物長(zhǎng)鏈脂肪酸含量的人工定向調(diào)控方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高植物長(zhǎng)鏈脂肪酸含量的人工定向調(diào)控方法，通過同時(shí)增加植物中長(zhǎng)鏈脂肪酸合成中調(diào)控基因AKR2A和被調(diào)控基因KCS1的表達(dá)量，達(dá)到提高植物長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成量的目的。本發(fā)明能夠改良食用型油料植物（油茶、油菜、芝麻、大豆等）脂肪酸代謝途徑，提高植物含油量和長(zhǎng)鏈脂肪酸所占比例。
【專利說明】一種提高植物長(zhǎng)鏈脂肪酸含量的人工定向調(diào)控方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種提高植物長(zhǎng)鏈脂肪酸含量的人工定向調(diào)控方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人類消費(fèi)的油脂中，植物油正被越來越重視，與動(dòng)物油以中鏈飽和脂肪酸為主不同，許多植物油長(zhǎng)鏈脂肪酸含量豐富。長(zhǎng)鏈脂肪酸中有很多為不飽和脂肪酸，是人體必需的脂肪酸，膳食中不飽和脂肪酸不足時(shí)，易產(chǎn)生各種病癥。植物油的飽和脂肪酸主要有棕櫚酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、月桂酸(12:0)，花生酸(20:0)，不飽和脂肪酸根據(jù)雙鍵個(gè)數(shù)的不同，分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。單不飽和脂肪酸有油酸(C 18:1)，多不飽和脂肪酸有亞油酸(C 18:2)、亞麻酸(C 18:3)、花生四烯酸(C 20:4)、二十碳五烯酸(C20:5)、二十二碳六烯酸(C22:6)等。另外，多不飽和脂肪酸是生物活性物質(zhì)的前體，而許多天然的活性物質(zhì)在普通植物中含量很少甚至沒有，這些物質(zhì)對(duì)人體健康具有重要意義。大多數(shù)植物油含有較高的油酸和亞油酸，但18C以上的多不飽和長(zhǎng)脂肪酸的含量較低。木本植物油普遍有含較高的不飽和脂肪酸，如油茶的不飽和脂肪酸含量可達(dá)90%，高于草本植物油，并含有其他有益成分，且不含膽固醇和芥酸(菜籽油中的一種有害成分，22C)，被認(rèn)為是高檔食物油。中國(guó)高檔食物油的人均消費(fèi)量為0.1kg，而西方一些國(guó)家高達(dá)20kg，市場(chǎng)缺口極大。我國(guó)一直以來非常重視國(guó)產(chǎn)高檔油的生產(chǎn)。如通過品種改良、擴(kuò)大油茶種植面積，低產(chǎn)地改造等措施增加油茶油的供應(yīng)量。隨著基因工程和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程的發(fā)展，提高其他油料植物中長(zhǎng)鏈脂肪酸含量和比例的技術(shù)已成為可能。
[0003]由于傳統(tǒng)的木本植物育種技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)，基礎(chǔ)研究薄弱、研究深度不夠，導(dǎo)致高速發(fā)展種植產(chǎn)業(yè)所需的技術(shù)供給脫節(jié)?；蚬こ毯头肿佑N無疑是人工改良油脂產(chǎn)質(zhì)量的有效途徑。研究表明，植物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)?；D(zhuǎn)移酶，二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶等基因能提高種子的油脂含量。但是，目前大部分研究的基因是根據(jù)mRNA表達(dá)量克隆而來，理論上這些基因很少是調(diào)控基因或處于上游的基因，所以，基`因轉(zhuǎn)化植株后的實(shí)際表型往往不理想。揭示遺傳調(diào)控是實(shí)施基因工程的前提，研究脂代謝的網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控途經(jīng)、尤其是上游的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，鑒定和克隆新的基因，為植物油等產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供前沿的理論和成果支撐，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)改良油料植物種植價(jià)值，具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。
[0004]植物長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成途徑已基本明確，即由脂肪酰-CoA延長(zhǎng)酶催化16C/18C的脂肪酸延長(zhǎng)產(chǎn)生不同類型的超長(zhǎng)鏈脂肪酸。所以18C脂肪酸是一個(gè)重要的延伸點(diǎn)。月旨肪酰-CoA延長(zhǎng)酶為一個(gè)多酶復(fù)合體，其中酮脂酰-CoA合酶3-ketoacy1-CoA synthase,KCS)是多酶復(fù)合體的關(guān)鍵性亞體。KCSl催化(超)長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的第一步縮合反應(yīng)，是脂肪酸延長(zhǎng)反應(yīng)的限速酶。KCS1、KCS2等在酵母中異源表達(dá)后，各種C20-C30脂肪酸的含量均有不同程度地提高。而知^7擬南芥突變體中長(zhǎng)鏈脂類含量明顯降低。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種提高植物長(zhǎng)鏈脂肪酸含量的人工定向調(diào)控方法，能夠改良食用型油料植物(油茶、油菜、芝麻、大豆等)脂肪酸代謝途徑，提高植物含油量和長(zhǎng)鏈脂肪酸所占比例。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種提高植物長(zhǎng)鏈脂肪酸含量的人工定向調(diào)控方法，包括以下步驟:
(1)利用酵母雙雜交技術(shù)，證明AKR2A與KCSl有互作關(guān)系；
(2)用RT-PCR技術(shù)證明AKR2A過量表達(dá)的擬南芥植株中KCSl基因的表達(dá)量增加，AKR2A對(duì)KCSl的調(diào)控呈現(xiàn)出正調(diào)控關(guān)系；
(3)構(gòu)建雙基因表達(dá)重組質(zhì)粒:
根據(jù)擬南芥Ta i r生物信息庫(kù)中基因c d s序列設(shè)計(jì)引物，以擬南芥cDNA文庫(kù)為模板，用PCR的方法，擴(kuò)增基因AKR2A和KCSl的cDNA ；利用35S啟動(dòng)子和雙35S啟動(dòng)子分別啟動(dòng)AKR2A和KCSl基因，用質(zhì)粒PB1-121構(gòu)建雙基因植物表達(dá)載體，命名為?m\2l-35S-AKR2A-dual?,^-KCSl ；
(4)雙基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物:
將構(gòu)建好的PBI121U5S^7(^-1/ffi^35STKy7載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，真空抽濾法通過花粉管轉(zhuǎn)化擬南芥；
(5)轉(zhuǎn)化后的擬南芥培養(yǎng)后收獲種子，經(jīng)誘導(dǎo)和篩選后，獲得AKR2A與KCSl兩個(gè)基因均為高表達(dá)的株系，收獲AKR2A與KCSl兩個(gè)基因均為高表達(dá)的植株的種子，色譜法測(cè)定表明AKR2A與KCSl兩個(gè)基因過量表達(dá)植株的種子含油量中各種長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量和在總油脂中的比例明顯提高。
[0007]作為優(yōu)選，步驟(3)中所述引物包括AKR2A-3 (SEQ ID NO:1)、AKR2A-4 (SEQ IDNO:2)、KCSl-F (SEQ ID NO:3)和 KCSl-R (SEQ ID NO:4)，其中 AKR2A-3 和 AKR2A-4 用于AKR2A基因擴(kuò)增，KCSl-F和KCSl-R用于KCSl基因擴(kuò)增。
[0008]作為優(yōu)選，步驟(4)中所述農(nóng)桿菌的菌種為GV3101。
[0009]本發(fā)明是在發(fā)現(xiàn)擬南芥AKR2A是一種伴侶蛋白，并與含有特定疏水域序列的基因有互作關(guān)系的基礎(chǔ)上(shen, 2010: Guoxin Shen, Sundaram Kuppu, SujathaVenkataramani, et al.AKR2A is an essential molecular chaperone forperoxisomal membrane-bound ascorbate peroxidase 3 in Arabidopsis.[ j] PlantCe 11.2010，22:811-831)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)AKR2A與植物中(超)長(zhǎng)鏈脂肪酸合成途中的關(guān)鍵合成酶有互作關(guān)系，并在基因網(wǎng)絡(luò)上游調(diào)控長(zhǎng)鏈脂肪酸合成。本發(fā)明正是利用這種調(diào)控基因和被調(diào)控基因之間的關(guān)系，通過雙基因表達(dá)的手段，提出人為提高植物長(zhǎng)鏈脂肪酸合成量的基因工程技術(shù)。為改良食用型油料植物(油茶、油菜、芝麻、大豆等)脂肪酸代謝途徑，獲得更多的符合人們需要的植物長(zhǎng)鏈脂肪酸提供一個(gè)實(shí)用的分子操作技術(shù)。
[0010]本發(fā)明通過同時(shí)增加植物中長(zhǎng)鏈脂肪酸合成中調(diào)控基因AKR2A和被調(diào)控基因KCSl的表達(dá)量，達(dá)到提高植物長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成量的目的。
[0011]本發(fā)明的有 益效果是:能夠改良食用型油料植物(油茶、油菜、芝麻、大豆等)脂肪酸代謝途徑，提高植物含油量和長(zhǎng)鏈脂肪酸所占比例。
【專利附圖】

【附圖說明】[0012]圖1是酵母雙雜交技術(shù)證明AKR2A與KCSl有相互作用，且這種互作方式在KCSl的疏水區(qū)域(藍(lán)色克隆表明在酵母菌中有互作關(guān)系，不變色克隆表明沒有互作關(guān)系)。
[0013]圖2是KCSl基因在AKR2A過量表達(dá)植株中的表達(dá)量。WT，野生型植株；0A1，0A2，2個(gè)獨(dú)立的AKR2A過量表達(dá)株系；ACTIN，內(nèi)參基因。
[0014]圖3是本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因載體示意圖。上:PBI121-35S_池恐兒中:PBI121-35StK^7，下:RB 和 LB:T_DNA 左邊和右邊的邊界順序;mopaline合成酶基因的啟動(dòng)子;MT//:卡鈉酶素抗性基因；J妨和dual35S:35S啟動(dòng)子及雙35S啟動(dòng)子。
[0015]圖4是RT-PCR方法來分析轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的表達(dá)。AKl和AK2兩個(gè)獨(dú)立的AKR2A/KCS1轉(zhuǎn)基因株系；WT，野生型植株;ACTIN，對(duì)照基因。
[0016]圖5是AKR2A和KCSl雙基因表達(dá)植株中不同鏈長(zhǎng)脂肪酸比值。長(zhǎng)鏈脂肪酸/中、短鏈脂肪酸:(C20:0+ C20:l+ C20:2+ C20:3+ C22:0+ C22:l)/ (C16:0+ C18:0+ C18:l+C18:2+ C18:3) ;AK1-AK7，7個(gè)獨(dú)立的池TPM/從M轉(zhuǎn)基因株系；WT,野生型植株。圖中WT、AK1、AK2的數(shù)值為8個(gè)重復(fù)的平均值，其他為4個(gè)重復(fù)的平均值。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面通過具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0018]本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0019]實(shí)施例:
1、AKR2A與KCSl在酵母中相 互作用。
[0020]以PEG202為質(zhì)粒(市售)，構(gòu)建PEG202-AKR2A (試驗(yàn)時(shí)用AKR2A的前207個(gè)氨基酸，以避免假陽性，其它同)重組誘餌質(zhì)粒；以PJG4-5為質(zhì)粒(市售)，構(gòu)建PJG4-5-KCS1、PJG4-5-KCS1的疏水區(qū)域片段、PJG4-5-KCS1的非疏水區(qū)域片段的重組獵物質(zhì)粒。將PEG202-AKR2A質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入酵母，菌種為EGY48 (市售)，陽性克隆制成感受態(tài)細(xì)胞，再將PJG4-5-KCSUPJG4-5-KCS1疏水區(qū)域片段、PJG4-5-KCS1的非疏水區(qū)域質(zhì)粒DNA和一個(gè)陰性質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入上述感受態(tài)細(xì)胞中。獲得的陽性克隆轉(zhuǎn)涂到含半乳糖的酵母培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)化子呈現(xiàn)出藍(lán)色，說明相對(duì)應(yīng)的兩種蛋白(片段)在酵母菌中有互作關(guān)系，而KCSl非疏水區(qū)域片段和陰性對(duì)照沒有變藍(lán)色，說明相對(duì)應(yīng)的兩種蛋白在酵母菌中沒有互作關(guān)系(見圖1)。
[0021]2、AKR2A正調(diào)控KCSl基因的表達(dá)。
[0022]用AKR2A過量表達(dá)的擬南芥植株的葉片為材料(20天生長(zhǎng)期)，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)該植株中KCSl基因的表達(dá)量，結(jié)果表明AKR2A過量表達(dá)植株中KCSl基因的表達(dá)量增加(圖
2)，AKR2A對(duì)KCSl的調(diào)控呈現(xiàn)出正調(diào)控關(guān)系。
[0023]3、構(gòu)建AKR2A、KCS1單基因過量表達(dá)和雙基因(AKR2A和KCSl)過量表達(dá)載體。
[0024]根據(jù)擬南芥Tair生物信息庫(kù)中基因cds序列設(shè)計(jì)引物:
引物包括 AKR2A-3 (SEQ ID NO:1)、AKR2A-4 (SEQ ID NO:2)、KCS1_F (SEQ ID NO:3)和 KCS1-R(SEQ ID NO:4)，其中 AKR2A-3 和 AKR2A-4 用于 AKR2A基因擴(kuò)增，KCS1-F和 KCSl-R用于KCSl基因擴(kuò)增。
[0025]AKR2A-3:5’ -AGCTTCTAGAATGGCTTCCAATTCGGAGAA-3’ (SEQ ID NO:1)。[0026]AKR2A-4:5，-AGCTGAGCTCTTAAAGGAAAGCATCCTTCTC-3’ (SEQ ID NO:2)。
[0027]KCSl-F:5’ -TAGCGAATTCATGGAGAGAACAAACAGCAT-3’ (SEQ ID NO:3)。
[0028]KCSl-R:5，-TGACCTCGAGTCATTGCACAACTTTAACCGGA-3’ (SEQ ID NO:4)。
[0029]以擬南芥cDNA文庫(kù)為模板，用PCR的方法，擴(kuò)增基因AKR2A和KCSl的cDNA ;利用35S啟動(dòng)子和雙35S啟動(dòng)子分別啟動(dòng)AKR2A和KCSl基因，用質(zhì)粒PB1-121構(gòu)建表達(dá)載體:構(gòu)建AKR2A單基因過量表達(dá)、KCSl單基因過量表達(dá)、同時(shí)表達(dá)兩個(gè)基因的雙基因表達(dá)重組載體，分別定名為 PBI 121-35S-^7?iM，PBI121-35STf^7，^\\2\-35S-AKR2A~dual^-KCSl(圖3)。用PCR的方法鑒定確認(rèn)表達(dá)載體的準(zhǔn)確性。
[0030]4、創(chuàng)建AKR2A、KCSl單基因過量表達(dá)植株和雙基因過量表達(dá)植株。
[0031]將構(gòu)建好的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌(菌種為GV3101，市售)，真空抽濾法通過花粉管轉(zhuǎn)化擬南芥(生態(tài)型Columbia，Col-Ο,市售)。
[0032]用農(nóng)桿菌Floral dip法分別獲得擬南芥單基因過量表達(dá)和雙基因過量表達(dá)植株，RT-PCR方法選擇和確定轉(zhuǎn)化基因過量表達(dá)的株系，其中雙基因過量表達(dá)植株的驗(yàn)證結(jié)果見圖4。
[0033]本發(fā)明以上3 種質(zhì)粒(PBI121-35S-^7?M，PBI 121-35S-J^7,PBI121-J仍-池7[?-?Λ^353τΚ?7)分別獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株35株、23株、25株(Ttl代)，經(jīng)過篩選檢測(cè)，其中34株、23株、17株分別為陽性單株。而后經(jīng)過兩到三代自交，選擇后得到純系，RT-PCR方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)入基因的過量表達(dá)。
[0034]5、轉(zhuǎn)化后的擬南芥培養(yǎng)后收獲種子，將收獲的種子播種到含有卡那霉素50mg/L，利福平100 mg/L,慶大霉素20mg/L的MS培養(yǎng)基上，放置于4冰箱內(nèi)誘導(dǎo)3d，然后轉(zhuǎn)移到人工氣候箱中培養(yǎng)(22°C，晝夜光照時(shí)間為16/8 h d，光照強(qiáng)度為6000 lax)，15 d后將抗性苗移栽到土壤中，篩選陽性植株，繼續(xù)篩選2代獲得純系，分子鑒定驗(yàn)證。選取AKR2A與KCSl兩個(gè)基因均為高表達(dá)的株系2個(gè)做進(jìn)一步研究。
[0035]AKR2A和KCSl雙基因轉(zhuǎn)基因植株種子的含油量高于AKR2A轉(zhuǎn)基因植株、KCSl轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株。
[0036]純系植株種子的含油量:收獲轉(zhuǎn)基因植株的種子，測(cè)定種子的含油率。表明雙基因過量表達(dá)植株種子含油量高于AKR2A單基因轉(zhuǎn)基因表達(dá)植株、KCSl單基因轉(zhuǎn)基因表達(dá)植株種子，而且這3種轉(zhuǎn)基因植株的種子含油量均不同程度地高于野生型(表1)。
[0037]表1轉(zhuǎn)基因植株種子的含油量
【權(quán)利要求】
1.一種提高植物長(zhǎng)鏈脂肪酸含量的人工定向調(diào)控方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)利用酵母雙雜交技術(shù)，證明AKR2A與KCSl有互作關(guān)系； (2)用RT-PCR技術(shù)證明AKR2A過量表達(dá)的擬南芥植株中KCSl基因的表達(dá)量增加，AKR2A對(duì)KCSl的調(diào)控呈現(xiàn)出正調(diào)控關(guān)系； (3)構(gòu)建雙基因表達(dá)重組質(zhì)粒: 根據(jù)擬南芥Ta i r生物信息庫(kù)中基因c d s序列設(shè)計(jì)引物，以擬南芥cDNA文庫(kù)為模板，用PCR的方法，擴(kuò)增基因AKR2A和KCSl的cDNA ；利用35S啟動(dòng)子和雙35S啟動(dòng)子分別啟動(dòng)AKR2A和KCSl基因，用質(zhì)粒PB1-121構(gòu)建雙基因植物表達(dá)載體，命名為?m\2l-35S-AKR2A-dual?,^-KCSl ； (4)雙基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物: 將構(gòu)建好的PBI121U5S^7(^-1/ffi^35STKy7載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，真空抽濾法通過花粉管轉(zhuǎn)化擬南芥； (5)轉(zhuǎn)化后的擬南芥培養(yǎng)后收獲種子，經(jīng)誘導(dǎo)和篩選后，獲得AKR2A與KCSl兩個(gè)基因均為高表達(dá)的株系，收獲AKR2A與KCSl兩個(gè)基因均為高表達(dá)的植株的種子，色譜法測(cè)定表明AKR2A與KCSl兩個(gè)基因過量表達(dá)植株的種子含油量中各種長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量和在總油脂中的比例明顯提聞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高植物長(zhǎng)鏈脂肪酸含量的人工定向調(diào)控方法，其特征在于:步驟(3)中所述引物包括 AKR2A-3 (SEQ ID NO:1 )、AKR2A_4 (SEQ ID NO:2)、KCS1_F(SEQ ID NO:3)和 KCSl-R (SEQ ID NO:4)，其中 AKR2A-3 和 AKR2A-4 用于 AKR2A 基因擴(kuò)增，KCSl-F和KCSl-R用于KCSl基因擴(kuò)增。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種提高植物長(zhǎng)鏈脂肪酸含量的人工定向調(diào)控方法，其特征在于:步驟(4)中所述農(nóng)桿菌的菌種為GV3101。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK103667341SQ201310615170
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】裘曉云, 沈國(guó)新, 魏佳, 胡紅旗, 陳琳, 陳小龍 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 浙江佰帆果木種植有限公司