預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效的生物標(biāo)記物及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效的生物標(biāo)記物及其用途。一種預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效的生物標(biāo)記物，為一種長(zhǎng)非編碼RNA，序列如SEQIDNO：１所示，或者其對(duì)應(yīng)的DNA序列。生物標(biāo)記物的用途，制備用于預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效、臨床診斷、篩選藥物、治療評(píng)估中的一種或多種的試劑盒。試劑盒為定量或定性檢測(cè)所述長(zhǎng)非編碼RNA的RT-qPCR試劑盒或測(cè)序試劑盒。本發(fā)明明確了預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效的生物標(biāo)記物的用途，顯示該生物標(biāo)記物在pCR組和NpCR組新鮮乳腺癌組織中存在差異（P<0.05）,在NpCR組乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于pCR組，提示該生物標(biāo)記物可以用來預(yù)測(cè)新輔助化療療效，避免新輔助化療盲目性。
【專利說明】預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效的生物標(biāo)記物及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效的生物標(biāo)記物及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7_10%，位居女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位。乳腺癌新輔助化療又稱術(shù)前化療或初始化療，本質(zhì)屬于輔助化療，但其可能的作用機(jī)制又不同于一般的術(shù)后輔助化療，它是指對(duì)非轉(zhuǎn)移性腫瘤在局部治療前進(jìn)行的全身性、系統(tǒng)性的細(xì)胞毒性藥物治療。目前，諸多新輔助化療方案不但可以用于晚期乳腺癌患者，而且還能讓越來越多的早期乳腺癌患者受益，取得了良好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
[0003]新輔助化療對(duì)可手術(shù)治療的乳腺癌患者具有以下3個(gè)優(yōu)點(diǎn):(I)達(dá)到病理完全緩解(pathologic complete remission, pCR),使患者的長(zhǎng)期生存率明顯提高。pCR是作為乳腺癌新輔助化療療效評(píng)估的一個(gè)有效指標(biāo)，根據(jù)國(guó)際專家委員會(huì)推薦PCR定義為:新輔助化療后，術(shù)后標(biāo)本中在原發(fā)腫瘤組織及腋窩淋巴結(jié)均無惡性的組織學(xué)證據(jù)，或僅存原位癌成分。而新輔助化療后，只要原發(fā)腫塊或/和轉(zhuǎn)移病灶仍有浸潤(rùn)性癌組織殘留即劃分為非 pCR (Non-pathologic complete remission, NpCR)組。NSABP B-18 試驗(yàn)最新公布的中位隨訪16年的研究結(jié)果顯示:新輔助化療和術(shù)后輔助化療的無病生存率(disease-freesurvival, DFS)和總生存率(overall survival, OS)并無明顯差異,但是新輔助化療組中PCR患者的DFS和OS明顯較非pCR患者長(zhǎng)。另外，NSABP B-27比較了新輔助化療后pCR患者和有腫瘤殘留患者的生存期，發(fā)現(xiàn)前者的生存期明顯延長(zhǎng)，HR為0.33 (P< 0.0001)o
(2)降低腫瘤分期，局部進(jìn)展`期乳腺癌經(jīng)過新輔助化療后可以提高切除率，并能增加保乳手術(shù)的機(jī)會(huì)。NSABP B-18研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)新輔助化療后67.8%的患者獲得保乳機(jī)會(huì)，而先手術(shù)者保乳率為59.8%，兩組有明顯差異(P=0.002)。(3)新輔助化療可以進(jìn)行體內(nèi)藥敏試驗(yàn)，防止耐藥克隆的出現(xiàn)，為化療方案的選擇提供參考依據(jù)。
[0004]雖然，新輔助化療的臨床運(yùn)用已有30多年的歷史，近年來取得了較大進(jìn)步，但隨著研究的深入，也發(fā)現(xiàn)了不少亟待解決的問題和缺點(diǎn):(I) 8%-10%的患者在接受新輔助化療后出現(xiàn)疾病進(jìn)展(progression disease, PD)，甚至失去局部治療的時(shí)機(jī)。(2)另外，約20%的乳腺癌患者對(duì)新輔助化療不敏感。對(duì)于這部分患者來說，如果新輔助化療不敏感而療程過長(zhǎng)，也可能會(huì)延誤局部治療的時(shí)機(jī)。正是這些原因，可能使部分醫(yī)生和患者在開展新輔助化療時(shí)過于保守，導(dǎo)致PCR率一般低于10%。在B-18和B-27這兩項(xiàng)大型臨床試驗(yàn)中的pCR率也僅有13%和26%。因此，需要一種有效的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，在化療前就能夠預(yù)測(cè)新輔助化療的療效，避免治療的盲目性。
[0005]MALATl 基因(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript I)即人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本子I基因，最初是在研究人非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移中通過減除雜交法篩選鑒定出的一個(gè)新的長(zhǎng)非編碼RNA (long non-coding RNA, LncRNA),它是定位于人類llql3染色體上，長(zhǎng)約8 700 bp的非編碼RNA，缺乏有意義的開放性編碼框，在體外無法翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì).普遍表達(dá)于人類和鼠的組織細(xì)胞中，尤以神經(jīng)系統(tǒng)突出。在早期非小細(xì)胞肺癌具有后期轉(zhuǎn)移傾向的細(xì)胞株中，其表達(dá)水平對(duì)于無轉(zhuǎn)移傾向細(xì)胞株顯著上調(diào)，與患者生存率負(fù)相關(guān)。之后諸多研究顯示，MALATl與乳腺、胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺和肝臟等組織惡性腫瘤均顯著相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，MALATl可調(diào)控宮頸癌細(xì)胞株CaSKi腫瘤細(xì)胞凋亡通路中半胱天冬酶(Caspase) -3、_8，Ba, Bcl-2和Bcl_xL等，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效的生物標(biāo)記物及其用途。
[0007]—種預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效的生物標(biāo)記物，它為一種長(zhǎng)非編碼RNA，序列如SEQ ID NO: I所示，或者其對(duì)應(yīng)的DNA序列。
[0008]一種所述的生物標(biāo)記物的用途，制備用于預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效、臨床診斷、篩選藥物、治療評(píng)估中的一種或多種的試劑盒。
[0009]所述的試劑盒為定量或定性檢測(cè)所述長(zhǎng)非編碼RNA的RT-qPCR試劑盒或測(cè)序試劑盒。
[0010]一種所述的生物標(biāo)記物的差異性分析方法，乳腺癌新輔助化療前新鮮組織，PCR組和NpCR組均為15例，將pCR和NpCR提取的RNA進(jìn)行混合，進(jìn)行測(cè)序文庫構(gòu)建，將制備好的DNA文庫采用邊合成邊測(cè)序法進(jìn)行深度測(cè)序，然后把測(cè)序的Reads與人類基因組進(jìn)行比對(duì)，通過RPKM值計(jì)算，獲得每個(gè)基因的表達(dá)量。
[0011]本發(fā)明的有益效果:明確了預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效的生物標(biāo)記物的用途，乳腺癌新輔助化療pCR組和NpCR組基因表達(dá)差異進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該生物標(biāo)記物在pCR組和NpCR組新鮮乳腺癌組織中存在差異(P〈0.05)，在NpCR組乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于PCR組。提示該生物標(biāo)記物可以用來預(yù)測(cè)新輔助化療療效，避免新輔助化療盲目性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1 為 NpCR VS pCR MA Plot 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0014]本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的基因MALATl用于預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效的具體方法如下: 一、實(shí)驗(yàn)樣本
本發(fā)明所使用的腫瘤組織樣本來自浙江省腫瘤醫(yī)院，乳腺癌組織樣本來自30例接受新輔助化療的患者，pCR組和NpCR組均為15例患者。粗針穿刺取組織樣本后轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，立即放入液氮凍存，后保存于_80°C冰箱待用。
[0015]二、實(shí)驗(yàn)試劑
RNA提取及PCR產(chǎn)物檢測(cè)過程中所用試劑，如酸性酚(pH4.5)，氯仿，異丙醇，乙醇，
DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑等常規(guī)生化試劑，均購于上海生工公司。PCR擴(kuò)增試劑(含10Xbuffer、dNTPs mixture)及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所用試劑,如RNase抑制劑、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、5XM-MuLV緩沖液以及反轉(zhuǎn)錄用dNTP混合物(各10 mM, RNase-free)，均購自TaKaRa公司。基于DNA染料法的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(含real-time PCR Master Mix,50 XROX reference)為TOYOBO產(chǎn)品。所有引物委托(miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、PCR正向引物、PCR反向引物)上海生物工程有限公司合成。RNA提取及PCR產(chǎn)物檢測(cè)過程中所用試劑及采購如下表1、2、3所列:
表1 total RNA提取所用試劑及其來源
【權(quán)利要求】
1.一種預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效的生物標(biāo)記物，其特征是，它為一種長(zhǎng)非編碼RNA，序列如SEQ ID NO: I所示,或者其對(duì)應(yīng)的DNA序列。
2.一種如權(quán)利要求1所述的生物標(biāo)記物的用途，其特征是，制備用于預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效、臨床診斷、篩選藥物、治療評(píng)估中的一種或多種的試劑盒。
3.如權(quán)利要求1所述的生物標(biāo)記物的用途，其特征是，所述的試劑盒為定量或定性檢測(cè)所述長(zhǎng)非編碼RNA的RT-qPCR試劑盒或測(cè)序試劑盒。
4.一種如權(quán)利要求1所述的生物標(biāo)記物的差異性分析方法，其特征是，乳腺癌新輔助化療前新鮮組織，PCR組和NpCR組均為15例，將pCR和NpCR提取的RNA進(jìn)行混合，進(jìn)行測(cè)序文庫構(gòu)建，將制備好的DNA文庫采用邊合成邊測(cè)序法進(jìn)行深度測(cè)序，然后把測(cè)序的Reads與人類基因組進(jìn)行比對(duì)，通過RPKM值計(jì)算，獲得每個(gè)基因的表達(dá)量。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103602746SQ201310605932
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】孟旭莉 申請(qǐng)人:浙江省腫瘤醫(yī)院