一種維生素c第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法，該方法將生產(chǎn)用大小菌混合菌經(jīng)過三代鐘液活化培養(yǎng)后涂布平板培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)，挑取飽滿、光滑、邊緣整齊的單個小菌在平板培養(yǎng)基上劃線增殖培養(yǎng)，之后選取生長厚實、無雜菌污染的小菌接種入斜面培養(yǎng)基內(nèi)增殖培養(yǎng)，再將大菌接入該斜面培養(yǎng)基中與小菌一起混合培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后依次將斜面混合菌種接入種瓶，經(jīng)二代種液活化培養(yǎng)后進行發(fā)酵培養(yǎng)，將在酸性環(huán)境下能穩(wěn)定產(chǎn)酸，產(chǎn)酸量高的菌株留種保藏。通過本發(fā)明的方法，可選育出在酸性環(huán)境下能正常、穩(wěn)定產(chǎn)酸，且生長周期短、糖酸轉(zhuǎn)化率高的耐酸性小菌，節(jié)省了原材料，可使生產(chǎn)成本降低1.8%，工藝得到簡化。
【專利說明】一種維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，維生素C第二步發(fā)酵是將L-山梨糖氧化生成2-酮基-L-古龍酸，由一組大、小混合菌配合進行，其中氧化葡萄糖桿菌(俗稱小菌)是產(chǎn)酸菌，直接負責(zé)山梨糖生物氧化；另一種微生物俗稱大菌，包括巨大芽孢桿、蠟狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌等，作為伴生菌起到輔助古龍酸桿菌生長和產(chǎn)酸的作用，待2-酮基-L-古龍酸生成后，再經(jīng)內(nèi)酯化和烯醇化生成維生素C。
[0003]在上述混菌發(fā)酵中，兩種菌的生物學(xué)特性不同，它們間既有共生又有拮抗作用，且因環(huán)境因子的影響而導(dǎo)致培養(yǎng)過程中混合菌菌群狀態(tài)的多樣化?；旌暇籂顟B(tài)不同，其發(fā)酵過程中菌群活力及生理行為即不同，其積累 2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的能力亦有所差別。在現(xiàn)有搖瓶發(fā)酵工藝中，中后期靠基礎(chǔ)料中磷酸二氫鉀、碳酸鈣的緩沖作用和尿素來維持適宜的PH范圍；在現(xiàn)有大生產(chǎn)發(fā)酵工藝中，通過流加濃度為25%的碳酸鈉溶液來控制適宜的pH范圍，且大量生產(chǎn)結(jié)果表明，在12~48h內(nèi)，2-KLG的形成速率與堿液流加的速率呈線性關(guān)系。碳酸鈉溶液屬于強堿弱酸鹽，如若補料控制不得當，會造成培養(yǎng)液局部過堿從而破壞2-KLG的形成；同時也會因生產(chǎn)工序的繁瑣而帶來用工成本、原材料成本的增加。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種不用堿性物質(zhì)調(diào)pH的條件下也能正常生長的維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法。
[0005]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為:
[0006]一種維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法，其特征是:將生產(chǎn)用大小菌混合菌經(jīng)過三代鐘液活化培養(yǎng)后涂布平板培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)，挑取飽滿、光滑、邊緣整齊的單個小菌在平板培養(yǎng)基上劃線增殖培養(yǎng)，之后選取生長厚實、無雜菌污染的小菌接種入斜面培養(yǎng)基內(nèi)增殖培養(yǎng)，再將大菌接入該斜面培養(yǎng)基中與小菌一起混合培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后依次將斜面混合菌種接入種瓶，經(jīng)二代種液活化培養(yǎng)后進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測發(fā)酵液中古龍酸含量及殘?zhí)?，在酸性環(huán)境下能穩(wěn)定產(chǎn)酸，且篩選株產(chǎn)古龍酸比對照株產(chǎn)古龍酸含量提高在5%以上的耐酸性菌株，留種保藏。
[0007]所述種液活化培養(yǎng)條件為在28~32°C溫度條件下培養(yǎng)20~24h，其所用種液培養(yǎng)基重量體積比為:山梨糖1.5%、玉米漿0.3%、尿素0.4%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.02%、碳酸鈣 0.4%ο
[0008]所述分離培養(yǎng)是將混合大小菌3代種子液稀釋至10-7~10-8，涂布于平板上，28~32°C培養(yǎng)3~4天。
[0009]所述劃線增殖培養(yǎng)是在經(jīng)28~32°C下培養(yǎng)3~4天。[0010]所述分離培養(yǎng)和劃線增殖培養(yǎng)培養(yǎng)所用平板培養(yǎng)基重量體積比為:L_山梨糖
1.0%、酵母膏0.5%、玉米漿0.5%、尿素0.3%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.03%、碳酸鈣0.5%、瓊脂粉1.8~2.0%。
[0011]所述小菌的增值培養(yǎng)條件為在28~32°C培養(yǎng)18~20hr。
[0012]所述大小菌混合培養(yǎng)是在28~32°C培養(yǎng)2~3天。
[0013]所述小菌的增值培養(yǎng)和大小菌的混合培養(yǎng)所用斜面培養(yǎng)基重量體積比為:山梨糖
1.0%、酵母膏0.5%、玉米漿0.5%、尿素0.3%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.03%、碳酸鈣0.5%、瓊脂粉1.8~2.0%。
[0014]所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為在28~32°C、200r/min下震蕩培養(yǎng)3~4天，其所用培養(yǎng)基重量體積比為:山梨糖10%、酵母膏0.01%、玉米漿1.5%、尿素0.1%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.01%、碳酸鈣0.5%。
[0015]所述經(jīng)過三代種液活化培養(yǎng)的種子液，檢測2-酮基-L-古龍酸大于5mg/ml時，才能用于分離培養(yǎng)。
[0016]通過本發(fā)明的方法，可選育出在酸性環(huán)境下能正常、穩(wěn)定產(chǎn)酸，且生長周期短、糖酸轉(zhuǎn)化率高的耐酸性小菌，將該耐酸性小菌用于維生素C第二步發(fā)酵，可使產(chǎn)酸量平均提高5%，糖酸轉(zhuǎn)化率平均提高4%，且在 發(fā)酵工段，不需再用25%碳酸鈉去調(diào)發(fā)酵過程中的料液pH，節(jié)省了原材料，可使生產(chǎn)成本降低1.8%，工藝也獲得了簡化。
【具體實施方式】
[0017]按下述流程進行選育:
[0018]挑選優(yōu)良生產(chǎn)株一接種種液活化I代一接種種液活化2代一接種種液活化3代一分離涂平板一平板增殖一斜面劃線接種一接種種液活化I代一接種種液活化2代一接種發(fā)酵一搖瓶考察一篩選留種。
[0019]實施例:
[0020]1、配制種子培養(yǎng)基重量體積比:
[0021]山梨糖1.5%、玉米漿0.3%、尿素0.4%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.02%、碳酸鈣
0.4%，經(jīng) 121°C 滅菌 30min。
[0022]2、種液活化:
[0023]2.1種液活化I代:取生產(chǎn)用菌種凍存管I支，用Iml吸管將冷凍液全部轉(zhuǎn)入I裝有20ml培養(yǎng)基的三角瓶中28~32°C，培養(yǎng)20~24h，為I代種子液。
[0024]2.2活化2代:吸取5ml的I代種子液接種于裝量20ml/250ml種子培養(yǎng)基中，28~32°C，震蕩培養(yǎng)20~24h，即為2代種子液。
[0025]2.3活化3代:吸取5ml的2代種子液接種于裝量20ml/250ml種子培養(yǎng)基中，28~32 0C (優(yōu)選29.5 土 TC)，震蕩培養(yǎng)20~24h，即為3代種子液。此時，檢測2-KLG產(chǎn)酸在5mg/ml以上方可使用。
[0026]3分離涂平板及平板增殖:
[0027]3.1配制平板培養(yǎng)基重量體積比:
[0028]L-山梨糖1.0%、酵母膏0.5%、玉米漿0.5%、尿素0.3%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂
0.03%、碳酸鈣 0.5%、瓊脂粉:1.8 ~2.0%，經(jīng) 121°C 滅菌 30min。[0029]3.2分離涂平板:
[0030]將處于對數(shù)生長期的混合大小菌3代種子液稀釋至10_7~10_8，涂布于平板上，28~32°C培養(yǎng)3~4天。
[0031]3.3平板增殖:
[0032]挑取飽滿、光滑、邊緣整齊的單個小菌，將其在平板上劃線增殖，再經(jīng)28~32°C培養(yǎng)3~4天。
[0033]4、斜面劃線接種:
[0034]4.1、選取生長厚實、無雜菌污染、經(jīng)過增殖的小菌，劃線法接種入斜面內(nèi)增殖，28~32°C培養(yǎng)18~20hr，再將大菌接于斜面培養(yǎng)基與小菌一起混合培養(yǎng)，28~32°C培養(yǎng)2~3天結(jié)束培養(yǎng)。
[0035]4.2配制斜面培養(yǎng)基重量體積比:
[0036]山梨糖1.0%、酵母膏0.5%、玉米漿0.5%、尿素0.3%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂
0.03%、碳酸鈣0.5%、瓊脂粉1.8~2.0%,經(jīng)121°C滅菌30min。
[0037]5、種液活化
[0038]5.1接種種液活化I代:
[0039]將生長成熟的斜面菌種劃下約l*lcm2，接入裝量20ml/250ml種子培養(yǎng)基中，經(jīng)28 ~32°C 培養(yǎng) 20 ~24hr。
[0040]5.2接種種液活化2代
[0041]吸取5ml的I代種子液接種于裝量20ml/250ml種子培養(yǎng)基中，28~32°C，震蕩培養(yǎng)20~24h，即為2代種子液。
[0042]6、接種發(fā)酵
[0043]6.1配制發(fā)酵培養(yǎng)基重量體積比:
[0044]山梨糖10%、酵母膏0.01%、玉米漿1.5%、尿素0.1%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂
0.01%、碳酸鈣 0.5%，經(jīng) 121°C 滅菌 30min。
[0045]6.2發(fā)酵接種:以10%的接種量將上述5.2的2代種子液移入發(fā)酵搖瓶中，經(jīng)28~32°C、200r/min，震蕩培養(yǎng)3~4天，結(jié)束培養(yǎng)。
[0046]7、搖瓶考察:分別用滴定法和蒽酮法檢測發(fā)酵液古龍酸含量及殘?zhí)恰?br> [0047]8、篩選留種:對實驗考察所得數(shù)據(jù)進行分析，選出在酸性環(huán)境下能穩(wěn)定產(chǎn)酸，且篩選株產(chǎn)古龍酸比對照株產(chǎn)古龍酸含量提高在5%以上的耐酸性菌株，留種保藏。
[0048]9、搖瓶結(jié)果如下:
【權(quán)利要求】
1.一種維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法，其特征是:將生產(chǎn)用大小菌混合菌經(jīng)過三代鐘液活化培養(yǎng)后涂布平板培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)，挑取飽滿、光滑、邊緣整齊的單個小菌在平板培養(yǎng)基上劃線增殖培養(yǎng)，之后選取生長厚實、無雜菌污染的小菌接種入斜面培養(yǎng)基內(nèi)增殖培養(yǎng)，再將大菌接入該斜面培養(yǎng)基中與小菌一起混合培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后依次將斜面混合菌種接入種瓶，經(jīng)二代種液活化培養(yǎng)后進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測發(fā)酵液中古龍酸含量及殘?zhí)?，在酸性環(huán)境下能穩(wěn)定產(chǎn)酸，且篩選株產(chǎn)古龍酸比對照株產(chǎn)古龍酸含量提高在5%以上的耐酸性菌株，留種保藏。
2.按照權(quán)利要求1所述的維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法，其特征在于所述種液活化培養(yǎng)條件為在28~32°C溫度條件下培養(yǎng)20~24h，其所用種液培養(yǎng)基重量體積比為:山梨糖1.5%、玉米漿0.3%、尿素0.4%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.02%、碳酸鈣 0.4%ο
3.按照權(quán)利要求1所述的維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法，其特征在于所述分離培養(yǎng)是將混合大小菌3代種子液稀釋至10_7~10_8，涂布于平板上，28~32°C培養(yǎng)3~4天。
4.按照權(quán)利要求1所述的維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法，其特征在于所述劃線增殖培養(yǎng)是在經(jīng)28~32°C下培養(yǎng)3~4天。
5.按照權(quán)利要求1或3或4所述的維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法，其特征在于所述分離培養(yǎng)和劃線增殖培養(yǎng)培養(yǎng)所用平板培養(yǎng)基重量體積比為:L-山梨糖1.0%、酵母膏0.5%、玉米漿0.5%、尿素0.3%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.03%、碳酸鈣0.5%、瓊脂粉1.8~2.0%。
6.按照權(quán)利要求1所述的維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法，其特征在于所述小菌的增值培養(yǎng)條件為在28~32°C培養(yǎng)18~20hr。
7.按照權(quán)利要求1所述的維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法，其特征在于所述大小菌混合培養(yǎng)是在28~32°C培養(yǎng)2~3天。
8.按照權(quán)利要求1或6或7所述的維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法，其特征在于所述小菌的增值培養(yǎng)和大小菌的混合培養(yǎng)所用斜面培養(yǎng)基重量體積比為:山梨糖1.0%、酵母膏0.5%、玉米漿0.5%、尿素0.3%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.03%、碳酸鈣0.5%、瓊脂粉1.8~2.0%。
9.按照權(quán)利要求1所述的維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為在28~32°C、200r/min下震蕩培養(yǎng)3~4天，其所用培養(yǎng)基重量體積比為:山梨糖10%、酵母膏0.01%、玉米漿1.5%、尿素0.1%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.01%、碳酸鈣 0.5%O
10.按照權(quán)利要求1所述的維生素C第二步發(fā)酵法中耐酸性小菌的選育方法，其特征在于所述經(jīng)過三代種液活化培養(yǎng)的種子液，檢測2-酮基-L-古龍酸大于5 mg/ml時，才能用于分離培養(yǎng)。
【文檔編號】C12N1/00GK103555581SQ201310594005
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】馬學(xué)霞, 李學(xué)兵, 崔莉, 張志
申請人:寧夏啟元藥業(yè)有限公司