專利名稱：制備維生素b12的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterinm)制備維生素B12的方法。
早在本世紀三十年代，George Minot和William Murphy通過維生素B12在人體中的作用而間接發(fā)現(xiàn)了維生素B12(Stryer，L.，1988，生物化學(Biochemie)，第四版，528-531頁，Spektrum Akademi scher VerlagGmbH，Heidelberg，柏林，紐約)。在1948年，維生素B12首次得到純化和分離，而直到八年后的1956年，Dorothy Hodgkin才闡明了維生素B12復雜的三維晶體結構(Hodgkin，D.C.等人，1956，維生素B12的結構(Structure of Vitamin B12)，自然(Na ture)，176，325-328和自然，178，64-70)。維生素B12生物合成的天然最終產(chǎn)物是5’-脫氧腺苷鈷胺素(輔酶B12)和甲基鈷胺素(MeCb1)，然而維生素B12被定義為氰鈷胺素，這是工業(yè)上制備和處理的主要形式。在本發(fā)明中，除非專門指出，維生素B12總是指所有這三種類似分子。
100多年前(1884)De Bary首次對巨大芽孢桿菌這一物種進行了描述。盡管通常將巨大芽孢桿菌歸類于土壤細菌，但在多種其它生境如海水、沉積物、水稻、干肉、牛奶或蜂蜜中也可檢測到巨大芽孢桿菌。巨大芽孢桿菌通常與假單胞菌屬(pseudomonads)和放線菌屬(actinomyces)相關聯(lián)。象它的近親枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)一樣，巨大芽孢桿菌是革蘭氏陽性細菌，并且可以通過，特別是通過其相對明顯的個體大小2×5μm，據(jù)此而得名巨大芽孢桿菌，約38％的G+C含量和很強的芽孢形成能力辨別出來。在生長培養(yǎng)基中即便是微量的錳也足以使巨大芽孢桿菌進行完全的芽孢形成，這種能力只有一些嗜熱細菌(thermophilic bacilli)的芽孢形成效率能比得上。正是由于它的大小和非常有效的芽孢形成和發(fā)芽能力，針對巨大芽孢桿菌中這些過程的分子基礎開展了不同的研究，以至于目前已有150多個涉及芽孢形成和發(fā)芽的巨大芽孢桿菌基因得以闡述。
關于巨大芽孢桿菌的生理學方面的研究(Priest，F(xiàn).G.等人，1988，芽胞桿菌屬的一種數(shù)值分類法(A Numerical Classification of the GenusBacillus)，普通微生物學雜志(J.Gen.Microbiol.)，134，1847-1822)將這一物種歸類于專性需氧的芽孢形成菌，該類細菌為尿素酶陽性和伏-波試驗陰性，且不能夠還原硝酸鹽。巨大芽孢桿菌最顯著的特征之一是它利用大量碳源的能力。因此它可以利用大量的糖并且發(fā)現(xiàn)存在于如玉米糖漿、肉類加工業(yè)的廢棄物甚至石油化學廢棄物中。鑒于其能夠代謝極廣泛碳源的能力，巨大芽孢桿菌可以不受限地等同于假單胞菌屬(Vary，P.S.，1994，微生物學(Microbiology)，40，1001-1013，研究巨大芽孢桿菌的全盛期(Prime time for Bacillus megaterium))。
在各種各樣的酶、維生素等的工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用巨大芽孢桿菌的優(yōu)點是多樣的。這些優(yōu)點包括，其中首要且確定的優(yōu)點是轉化進巨大芽孢桿菌的質粒的環(huán)境證明是很穩(wěn)定的。這被認為是與迄今已建立起來的例如用聚乙二醇處理來轉化這一物種的可行性有直接關系。直到幾年前，轉化的可行性仍然是利用巨大芽孢桿菌作為生產(chǎn)菌株的一個主要障礙。認為相對充分研發(fā)的遺傳學的優(yōu)勢與轉化的可行性相關聯(lián)，在芽孢桿菌屬中這一點只有枯草芽孢桿菌超過了它。第二，巨大芽孢桿菌沒有堿性蛋白酶，所以在產(chǎn)生異源蛋白質時幾乎不發(fā)生降解作用。另外我們還知道巨大芽孢桿菌可高效分泌一些具有商業(yè)價值的產(chǎn)物，如利用它生產(chǎn)α-和β-淀粉酶。而且，巨大芽孢桿菌的大小使它能夠在達到致死的過密種群密度之前積累大量的生物量。在用巨大芽孢桿菌進行工業(yè)生產(chǎn)中一個更有利且非常重要的情況是該物種能夠從廢棄物和低質量物質中制備高價值和非常高質量的產(chǎn)品。巨大芽孢桿菌的這種能夠代謝極廣泛底物的能力也反映在它可以作為土壤解毒菌的用途上，它甚至可以分解各種氰化物、除草劑和殘留性農(nóng)藥。最后，巨大芽孢桿菌完全是非病原性的且不產(chǎn)生毒素，這是非常重要的，尤其是在生產(chǎn)食品和化妝品方面。正是由于以上這些優(yōu)點，巨大芽孢桿菌已經(jīng)廣泛應用于大量工業(yè)生產(chǎn)，如生產(chǎn)α-和β-淀粉酶、青霉素酰胺酶、有毒廢棄物的處理或需氧維生素B12的生產(chǎn)(總結見Vary，P.S.，1994，微生物學，40，1001-1013，研究巨大芽孢桿菌的全盛期(Prime time forBacillus megaterium))。
由于在用生物技術生產(chǎn)各種具有工業(yè)利益的產(chǎn)品時，巨大芽孢桿菌具有大量優(yōu)點，因此巨大芽孢桿菌的使用就具有了巨大的經(jīng)濟利益。因此，在用巨大芽孢桿菌制備維生素B12時，優(yōu)化發(fā)酵條件和進行分子遺傳學改造就具有巨大的商業(yè)利益。
本發(fā)明的一個目的是用巨大芽孢桿菌優(yōu)化維生素B12的制備。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過使用一種含有巨大芽孢桿菌的培養(yǎng)物制備維生素B12的方法可以達到這個目的，其中發(fā)酵作用在需氧條件下進行，并且培養(yǎng)基中至少含有鈷和/或至少含有鈷和5-氨基乙酰丙酸。
為了本發(fā)明的目的，原則上可使用所有適于作為維生素B12的生產(chǎn)菌的普通巨大芽孢桿菌。為了本發(fā)明的目的維生素B12的生產(chǎn)菌是指巨大芽孢桿菌菌株或同源微生物，它們已經(jīng)用經(jīng)典方法和/或分子遺傳學方法進行了改造，使它們的代謝流向在生物合成維生素B12或其衍生物的方向上得以增加(代謝工程)。例如，在這些生產(chǎn)菌中將一個或多個位于代謝途徑關鍵位置上的基因和/或相應的酶進行調(diào)節(jié)上修飾或甚至去調(diào)節(jié)，其中所述的基因和/或相應的酶是至關重要的并受到相應的復雜的調(diào)節(jié)作用(瓶頸)。在這方面本發(fā)明包含了所有以前已知的維生素B12生產(chǎn)菌，優(yōu)選地為芽孢桿菌屬或同源生物。根據(jù)本發(fā)明這些具優(yōu)勢的菌株包括，特別是包括巨大芽孢桿菌的DSMZ 32菌株和DSMZ 509菌株。
在制備維生素B12的本發(fā)明方法的一個改變形式中，以從約200-750μM之間的濃度范圍加入鈷，優(yōu)選地從約250-500μM之間。
在本發(fā)明方法的一個進一步改變形式中，加入了5-氨基乙酰丙酸，其濃度范圍從約200-400μM，優(yōu)選地約300μM。
根據(jù)本發(fā)明，通過單一或組合地加入諸如甜菜堿、甲硫氨酸、谷氨酸(gutamate)、二甲基苯并咪唑或膽堿這種優(yōu)化方式使用巨大芽孢桿菌，也可改進維生素B12的制備。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)酵作用發(fā)生在包含以葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基中。在本發(fā)明方法的一個特別有利的改變形式中，發(fā)酵作用發(fā)生在包含以甘油為碳源的培養(yǎng)基中。
以甘油為碳源的巨大芽孢桿菌發(fā)酵作用比以葡萄糖為碳源的發(fā)酵作用通常能夠達到較高的細胞密度。在這方面，令人感興趣的是在需氧發(fā)酵條件下加入鈷和5-氨基乙酰丙酸的培養(yǎng)基比不加這些添加物的相應培養(yǎng)基可以達到較高的維生素B12產(chǎn)量。
根據(jù)本發(fā)明，通過將發(fā)酵巨大芽孢桿菌的生長條件從需氧轉變成厭氧可以進一步提高維生素B12的產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明，使用含有甘油、鈷和5-氨基乙酰丙酸的培養(yǎng)基也證明是特別有利的。在需氧條件下，實施發(fā)酵作用優(yōu)選地加入大約250μM的鈷，而在厭氧條件下加入大約500μM的鈷則有利。
將培養(yǎng)物從需氧轉變成厭氧生長條件使得同時獲得高維生素B12含量和高細胞密度成為可能。
本發(fā)明因此也涉及到這樣一種方法，其中發(fā)酵的第一步在需氧條件下進行，第二步則在厭氧條件下進行。
在本發(fā)明的一個特殊的改變形式中，發(fā)酵作用從需氧到厭氧的轉變發(fā)生在需氧發(fā)酵細胞的指數(shù)生長期。本發(fā)明的進一步改變形式提供了一種方法，這種方法就是使從需氧到厭氧發(fā)酵的轉變發(fā)生在需氧發(fā)酵細胞指數(shù)生長期的中期或末期，優(yōu)選地是在末期。在這方面本發(fā)明優(yōu)選的方法是一旦需氧培養(yǎng)物達到最大的光密度就將發(fā)酵作用轉變成厭氧，但光密度至少要達到約2-3。
為了本發(fā)明的目的，厭氧條件是指將需氧培養(yǎng)后的細菌轉移到厭氧瓶并在其中發(fā)酵時的種種條件。這就意味著在細菌只消耗厭氧瓶里存在的氧，而不再進一步供氧。這些條件也可以說成是半?yún)捬酢Ｏ鄳牟襟E是常規(guī)的實驗室操作并且為技術人員所熟知。起初將細菌在發(fā)酵罐里進行需氧發(fā)酵然后將氧的供應逐漸減少并最終建立起半?yún)捬鯒l件也是一種流行的相似方法。在本發(fā)明的一個特殊改變形式中，例如通過向培養(yǎng)基中加入還原劑建立嚴格的厭氧條件也是可能的。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)酵培養(yǎng)基含有作為碳源的葡萄糖。本發(fā)明方法的一個有利的改變形式包含巨大芽孢桿菌在含甘油的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。另一個更有利的改變方式涉及到一種發(fā)酵培養(yǎng)基，在這種培養(yǎng)基中含有作為碳源的葡萄糖或甘油，并且至少含有鈷和/或鈷和5-氨基乙酰丙酸作為添加物。這種兩階段方法能夠使維生素B12的產(chǎn)量比完全在需氧條件下至少增加2.6倍。如果培養(yǎng)基中含有葡萄糖、鈷和5-氨基乙酰丙酸，則兩階段發(fā)酵有可能使維生素B12的產(chǎn)量比完全需氧條件下增加至少2.2倍。
根據(jù)本發(fā)明，通過使用經(jīng)遺傳學操作的巨大芽孢桿菌菌株，也能進一步提高維生素B12的產(chǎn)量。通過經(jīng)典的誘變或靶向分子生物學技術和恰當?shù)倪x擇方法可產(chǎn)生這種遺傳修飾的細菌菌株。靶向遺傳學操作的令人感興趣的起始點特別是導致維生素B12分支的生物合成途徑的點，通過它可使代謝流向有意地引導到維生素B12最大產(chǎn)量一方。
涉及代謝流向調(diào)節(jié)作用的基因的靶向修飾也包括對結構基因上游和下游調(diào)節(jié)區(qū)的研究和改變，比如對啟動子、增強子、終止子、核糖體結合位點等的優(yōu)化和/或互換。本發(fā)明也包括提高DNA、mRNA或由它們編碼的蛋白質的穩(wěn)定性，例如通過降低或阻止核酸酶或蛋白酶的降解作用。
根據(jù)本發(fā)明，在這方面還包括多肽，與相應的原始蛋白質相比這些多肽的活性已經(jīng)被減弱或增強，例如通過氨基酸互換的方法。該方法同樣應用于細胞內(nèi)的本發(fā)明酶的穩(wěn)定性，這些酶對于蛋白酶降解的敏感性例如有所增強或減弱。
本發(fā)明也涉及到相應的多肽，這些多肽的氨基酸序列已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于它們對具有調(diào)節(jié)活性的化合物，如調(diào)節(jié)它們活性的代謝終產(chǎn)物是不敏感的(反饋脫敏)。
本發(fā)明也涉及到一種制備維生素B12的方法，在這種方法中用于發(fā)酵的巨大芽孢桿菌菌株的cobA基因表達增強和/或拷貝數(shù)增加。因此，使維生素B12的產(chǎn)量增加至少2倍是可能的。
通過增加適當基因的拷貝數(shù)可以提高基因的表達(過表達)。以適當?shù)姆绞叫揎椢挥诮Y構基因上游的啟動子區(qū)和/或調(diào)節(jié)區(qū)和/或核糖體結合位點來增加表達效率也是進一步可能的。整合到結構基因上游的表達盒也能夠以同樣的方式發(fā)揮作用。此外，在維生素B12的生產(chǎn)中，通過誘導型啟動子來增加表達也是可能的。
通過延長mRNA的壽命同樣可以提高表達。這些基因或基因構建體或者以不同拷貝數(shù)存在于質粒上或者整合到染色體上并得到擴增。
通過抑制酶蛋白質的降解作用提高或增強酶自身的活性也是進一步可能的。通過改變培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)物的處理方法也是獲得相應基因過表達的另一種可供選擇的可能方法。
本發(fā)明包括這樣的基因結構，該結構包含巨大芽孢桿菌cobA基因的核苷酸序列或其部分以及與其可操作連接并具有調(diào)節(jié)功能的核苷酸序列，其中所述cobA基因編碼在需氧條件下表達的S-腺苷甲硫氨酸-尿卟啉原III甲基轉移酶(SUMT)。
可操作地連接是指諸如啟動子、編碼序列、終止子和合適時進一步的調(diào)節(jié)元件的按序排列，這種排列使得在編碼序列的表達過程中這些調(diào)節(jié)元件中的每一個都可以發(fā)揮其適當?shù)墓δ?。這些調(diào)節(jié)性核苷酸序列可以是天然來源的，或是通過化學合成獲得的。合適的啟動子原則上是指能在適宜的宿主生物中控制基因表達的任何啟動子。根據(jù)本發(fā)明，啟動子也可能是化學誘導的啟動子，該啟動子能夠控制受其調(diào)控的基因在宿主細胞特定時期表達。β-半乳糖苷酶或阿拉伯糖系統(tǒng)在此作為實例被提到。
通過常規(guī)的重組和克隆技術將合適的啟動子和至少一個本發(fā)明的核苷酸序列融合構建了基因結構，這些重組和克隆技術是由諸如Sambrook，J.等人在分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989)一書中描述。
連接物或接頭可以附加到片段中用于將DNA片段連接起來。
本發(fā)明還包括載體，所述載體包含cobA基因的核苷酸序列或其部分核苷酸序列或包含上述類型的基因結構，還包含一些額外的核苷酸序列，這些額外的核苷酸序列是用于選擇、用于在宿主細胞內(nèi)復制和/或整合到宿主細胞基因組。目的基因在巨大芽孢桿菌中轉化和過表達的適宜體系為諸如pWH1510和pWH1520質粒以及無質粒的過表達巨大芽孢桿菌菌株WH320，這些是由Rygus T.等人描述的(1991，利用木糖操縱子的調(diào)節(jié)元件在巨大芽孢桿菌中誘導異源基因的高效表達(Inducible High-Level Expression ofheterologous genes in Bacillus megaterium using the RegulatoryElements of the Xylose-Utilization Operon)，應用微生物學和生物技術(Appl.Microbiol.Biotechnol.)，35，594-599)。根據(jù)本發(fā)明，巨大芽孢桿菌菌株DSMZ509是有利的。然而，所提到的體系不用于限制本發(fā)明。
本發(fā)明進一步涉及到用于上述類型方法中的已經(jīng)轉化了的巨大芽孢桿菌菌株，這種菌株的不同之處在于它使編碼S-腺苷甲硫氨酸-尿卟啉原III甲基轉移酶的cobA基因的核苷酸序列得到增強的表達和/或拷貝數(shù)得到增加。
根據(jù)本發(fā)明，在這方面還包括這樣的經(jīng)轉化巨大芽孢桿菌菌株，該菌株具有上述類型的基因結構或載體的復制型，其中所述基因結構或載體包含來源于巨大芽孢桿菌的編碼在需氧條件下表達的S-腺苷甲硫氨酸-尿卟啉原III甲基轉移酶的cobA基因。而包含于上述類型的基因構建體或載體中的cobA基因在需氧和厭氧條件下均可表達。
本發(fā)明包括了適宜用于維生素B12生產(chǎn)的所有巨大芽孢桿菌菌株。這些菌株也可能是經(jīng)過遺傳學修飾的細菌菌株，它們通過經(jīng)典誘變方法或靶向分子生物學技術和適合的選擇方法產(chǎn)生。
靶向遺傳學操作的令人感興趣的起始點特別是導致維生素B12分支的生物合成途徑的點，通過它可使代謝流向有意地引導到維生素B12最大產(chǎn)量一方。
本發(fā)明的一種改變形式包括轉化了的巨大芽孢桿菌菌株，該菌株的不同之處在于根據(jù)本發(fā)明它在需氧發(fā)酵條件下顯示出比未轉化的菌株增加維生素B12的產(chǎn)量，未轉化的菌株即它不含有cobA基因、不含有上述類型的基因構建體或載體。
在本發(fā)明方法的一種改變形式中，優(yōu)選地將已經(jīng)轉化了的巨大芽孢桿菌菌株在含葡萄糖的培養(yǎng)基中發(fā)酵。含有甘油作為碳源的培養(yǎng)基是特別優(yōu)選的。本發(fā)明方法的一個進一步有利的改變形式包括在除了含有葡萄糖或甘油以外還至少額外含有鈷和/或鈷和5-氨基乙酰丙酸的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明中制備維生素B12的方法，轉化了的巨大芽孢桿菌菌株的兩階段發(fā)酵也是有利的。
本發(fā)明進一步涉及到編碼巨大芽孢桿菌S-腺苷甲硫氨酸-尿卟啉原III甲基轉移酶的cobA基因核苷酸序列的用途，用于產(chǎn)生上述類型轉化了的巨大芽孢桿菌菌株。本發(fā)明還包括上述類型的已經(jīng)轉化了的巨大芽孢桿菌菌株的用途，用于制備維生素B12。
下面提供示例性的實施方案用于闡明本發(fā)明，并且這些實施方案對本發(fā)明沒有限制作用。
1.細菌菌株和質粒本研究中使用的所有細菌菌株和質粒都列于表1和表2中。
2.緩沖液和溶液2.1基本培養(yǎng)基Mopso基本培養(yǎng)基Mopso(pH7.0) 50.0mMN-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)(pH7.0) 5.0mMMgCl2520.0μMK2SO4276.0μMFeSO450.0μMCaCl21.0mMMnCl2100.0μMNaCl 50.0mMKCl10.0mMK2HPO41.3mM(NH4)6Mo7O2430.0pMH3BO34.0nMCoCl2300.0pMCuSO4100.0pMZnSO4100.0pMD-葡萄糖 20.2mMNH4Cl 37.4mM滴定試劑為KOH溶液。
鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)基本培養(yǎng)基NaCl 8.6mMNa2HPO433.7mMKH2PO422.0mMNH4Cl 18.7mMD-葡萄糖20.2mMMgSO42.0mMCaCl20.1mM固體培養(yǎng)基中加入15g/l瓊脂。
2.2用于巨大芽孢桿菌的原生質體轉化的溶液SMMP緩沖液3號抗生素培養(yǎng)基(Difco) 17.5g/l蔗糖500.0mM馬來酸鈉(pH6.5) 20.0mMMgCl220.0mM滴定試劑為NaOH溶液。
PEG-P溶液PEG 600040.0％(w/v)蔗糖500.0mM馬來酸鈉(pH6.5) 20.0mMMgCl220.0mM滴定試劑為NaOH溶液。
cR5上層瓊脂蔗糖300.0mMMops(pH7.3) 31.1mM
NaOH 15.0mML-脯氨酸 52.1mMD-葡萄糖 50.5mMK2SO41.3mMMgCl2×6H2O45.3mMKH2PO4313.0μMCaCl213.8mM瓊脂 4.0％(w/v)酪蛋白氨基酸 0.2％(w/v)酵母提取物 10.0％(w/v)滴定試劑為NaOH溶液。
2.3用于制備巨大芽孢桿菌染色體DNA的溶液EDTA鹽(S-EDTA)EDTA 80.0mMNaCl 150.0mM0.1×SSC溶液二水合檸檬酸三鈉 1.5mMNaCl 50.0mM用HCl調(diào)至pH7.0。
2.3瓊脂糖凝膠電泳的溶液和標記物TAE緩沖液Tris乙酸(pH＝8.0)40.0mMEDTA 1.0mM樣品緩沖液溴酚蘭 350μM
二甲苯青FF 450μM橘黃G0.25％(w/V)蔗糖水溶液 115.0mM溴化乙錠溶液溴化乙錠水溶液 0.1％(w/v)GeneRuler DNA Ladder混合物標記物包括下列片段(堿基對，bp)10000，8000，6000，5000，4000，3500，3000，2500，2000，1500，1200，1031，900，800，700，600，500，400，300，200，100λDNA/Eco91I(BstEII)標記物用Eco91I完全消化的λ-DNA水溶液。標記物包括下列片段(堿基對，bp)8453，7242，6369，5687，4822，4324，3675，2323，1929，1371，1264，702，224，1172.4SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的溶液和標記物丙烯酰胺貯液丙烯酰胺 39.0％(w/V)N，N’-亞甲雙丙烯酰胺1.0％(w/V)溶劑是水濃縮膠緩沖液SDS 0.4％(w/v)Tris-HCl(pH6.8) 1.5％(w/v)溶劑是水分離膠緩沖液SDS 0.4％(w/v)
Tris-HCl(pH8.8) 1.5％(w/V)溶劑是水APS溶液過硫酸胺(APS)10.0％(w/v)溶劑是水濃縮膠[6％(w/v)5塊微型膠]丙烯酰胺貯液 1.5ml濃縮膠緩沖液 2.5ml去離子水 6.0mlTEMED10.0μlAPS溶液 100.0μl分離膠[12％(w/v)5塊微型膠]丙烯酰胺貯液 6.0ml分離膠緩沖液 5.0ml去離子水 9.0mlTEMED20.0μlAPS溶液 200.0μl電泳緩沖液甘氨酸 385.0mMSDS 0.1％(w/v)Tris-HCl(pH8.8) 50.0mM溶劑是水樣品緩沖液甘油 40％(w/v)β-巰基乙醇 2.0mMSDS 110.0mM溴酚蘭 3.0mMTris-HCl(pH6.8) 100.0mM
染色液醋酸 10.0％(v/v)考馬斯亮蘭(G-250)1.0g/l溶劑是水脫色液乙醇 30.0％(v/v)冰醋酸 10.0％(v/v)溶劑是水道爾頓蛋白質標記物VII(每一個表明的是相對摩爾質量Mr)α-乳清蛋白 14200胰蛋白酶抑制劑 20100胰蛋白酶原 24000碳酐酸酶 290003-磷酸甘油醛脫氫酶 36000卵清蛋白 45000小牛血清白蛋白 660002.5用于蛋白質表達實驗的溶液裂解緩沖液EDTA(pH6.5) 20.0mMNa3PO4100.0mM溶菌酶 5mg/ml滴定試劑為H3PO4溶液。
2.6用于Southern P跡分析的溶液變性液
NaOH 500.0mMNaCl 1.5M中和液Tris-HCl(pH7.2) 400.0mMNaCl 1.5M20×SSC溶液二水合檸檬酸三鈉 300.0mMNaCl 3.0M用HCl調(diào)至pH7.0。
10％封閉試劑奶粉溶于緩沖液1 100g/l緩沖液1(馬來酸緩沖液)馬來酸(pH7.5)100.0mMNaCl 150.0mMNaOH 200.0mM用HCl調(diào)至pH7.0。
緩沖液2溶于緩沖液1的10％強度的封閉液 100g/l緩沖液3(檢測緩沖液)Tris-HCl(pH9.5)77.0mMNaCl 100.0mM洗滌緩沖液吐溫20溶于緩沖液13ml/l預雜交液20×SSC 250ml/lN-月桂基肌氨酸 3.7mM10％強度SDS 2ml/l20％強度封閉液 100ml/l雜交液20×SSC 250ml/lN-月桂基肌氨酸 3.7mM10％強度SDS 2ml/l20％強度封閉液 100ml/l探針溶液 5ml/l3.培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加劑3.1培養(yǎng)基除非特別聲明，均使用Sambrook J.等人(1989，分子克??；實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)所述的Luria-Bertani肉湯(LB)完全培養(yǎng)基。對于固體培養(yǎng)基，需在每升培養(yǎng)基中額外加入15g瓊脂。
3.2添加劑添加劑，諸如碳源、氨基酸、抗生素或鹽，可以加入到培養(yǎng)基中一起高壓滅菌，或者用水配成濃縮貯液滅菌，適當時通過過濾除菌。將這些物質加入到已高壓滅菌并冷卻到50℃以下的培養(yǎng)基中。若含有對光敏感的物質如四環(huán)素，要注意在暗處培養(yǎng)。通常使用的終濃度如下ALA 298μM氨芐青霉素 296μM酪蛋白氨基酸 0.025％(w/v)
CoCl2(在需氧培養(yǎng)物中) 250μMCoCl2(在厭氧培養(yǎng)物中) 500μM半胱氨酸 285μM葡萄糖 22mM甘油 217mM溶菌酶 1mg/ml甲硫氨酸 335μM四環(huán)素(在固體培養(yǎng)基中) 23μM四環(huán)素(在液體培養(yǎng)基中) 68μM木糖 33mM4.微生物學技術4.1滅菌除非特別說明，所有的培養(yǎng)基和緩沖液均在120℃，1巴壓力下，蒸汽滅菌20分鐘。對熱敏感物質需通過過濾除菌(濾器孔徑為0.2μm)，玻璃器具在180℃高熱滅菌至少3小時。
4.2細菌液體培養(yǎng)物的一般生長條件使用無菌接種環(huán)將細菌從LB瓊脂平板或甘油培養(yǎng)物中取出并放入營養(yǎng)培養(yǎng)基中，如果需要，營養(yǎng)培養(yǎng)基中含有抗生素。
需氧細菌培養(yǎng)物在擋板搖瓶中37℃培養(yǎng)，轉速為180轉/分鐘。培養(yǎng)時間根據(jù)預期所要達到得細菌培養(yǎng)物的光密度而有所不同。
4.3巨大芽孢桿菌生長的條件為了盡可能給需氧培養(yǎng)物通氣，巨大芽孢桿菌應在37℃培養(yǎng)于轉速為250轉/分鐘的擋板搖瓶中。厭氧培養(yǎng)物在37℃以150ml的體積培養(yǎng)于150ml的厭氧瓶中，轉速為100轉/分鐘。在這兩種情況下，都應注意以1∶100的比例對過夜培養(yǎng)物進行接種，并要使用同過夜培養(yǎng)一致的條件。為了在厭氧條件下獲得較高的生物量產(chǎn)量，應將巨大芽孢桿菌培養(yǎng)物進行需氧預培養(yǎng)，并且在達到所預期的密度時改為厭氧生長條件。為了實現(xiàn)該目的，在最初應將巨大芽孢桿菌37℃培養(yǎng)于轉速為250轉/分鐘的擋板搖瓶中。在指數(shù)生長期的中期或穩(wěn)定期的起點，將全部培養(yǎng)物轉移到150ml的厭氧瓶中并在37℃，100轉/分鐘的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
4.4細菌平板培養(yǎng)物用無菌的接種環(huán)從含甘油的培養(yǎng)物中挑取細菌并在LB瓊脂平板上劃線接種，如果需要，該平板中含有合適的抗生素，這樣經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后平板上可見單菌落。如果要使用液體培養(yǎng)物中的細菌，需使用Drygalski刮鏟將細菌劃線于LB瓊脂平板上并37℃培養(yǎng)過夜。
4.5細胞密度測定通過測定578nm波長下的光密度(OD)來測定細菌培養(yǎng)物的細胞密度，假定1OD578相當于1×109個細胞。
4.6細菌的貯存制備所謂的甘油培養(yǎng)物用來長期貯存細菌。為此，應將850μl細菌過夜培養(yǎng)物與150μl滅菌的85％甘油完全混合，然后貯存于-80℃。
5.分子生物學方法DNA分離和包括限制性酶切、克列諾酶和堿性磷酸酶處理、測序、PCR等的所有技術都是常規(guī)的實驗室操作，這些均在Sambrook J.等人的關于分子生物學方法的權威著作中有所描述(1989，分子克?。粚嶒炇沂謨?，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)。
5.1將cob A克隆入PWH1520所使用的克隆和表達載體是pWH1520(Rygus等人，1991)。PBR322衍生物具有四環(huán)素抗性和氨芐青霉素抗性，并含有在大腸桿菌(E.coli)和芽孢桿菌亞種(Bacillus spp)中復制至關重要的元件。該體系可適用所有建立在大腸桿菌中的克隆技術并且同時可用于在巨大芽孢桿菌中進行基因的表達。該載體包含巨大芽孢桿菌的帶有相應調(diào)節(jié)序列的xyl操縱子的xylA和xylR基因(Rygus等人，1991)。xylA基因編碼木糖異構酶而xylR基因編碼一種調(diào)節(jié)蛋白質，這種調(diào)節(jié)蛋白質對xylA啟動子進行強轉錄調(diào)控。當缺乏木糖時，xylA基因受到xylR的抑制。當加入木糖時，通過xylA的去抑制作用可以產(chǎn)生約200倍的誘導量。質粒中與xylA具有相同閱讀框的多接頭使得將靶基因與xylA融合在一起成為可能，因此靶基因同樣也處于xylR的強轉錄控制之下。而且，由于位于多接頭上游的xylA閱讀框仍是完整的，所以選擇是形成轉錄融合還是形成翻譯融合也是可能的。
為了構建cobA過表達克隆，已知的序列(Robin等人，1991)獲自巨大芽孢桿菌基因組。用于產(chǎn)生CobA和木糖異構酶翻譯融合的PCR引物也源于巨大芽孢桿菌基因組。因此，在表達載體pWH1520中，利用了xylA基因的核糖體結合序列。在PCR引物中加入了一個Spe I酶切位點和一個BamHI酶切位點，通過PCR從巨大芽孢桿菌基因組DNA中擴增了所需的cobA序列。然后，擴增得到的基因序列和過表達載體pWH1520均用Spe I和BamHI酶切，連接所產(chǎn)生的粘性末端。分離到一些通過Spe I和BamHI消化后能夠產(chǎn)生預期大小插入片段的克隆是可能的。通過全部DNA序列測定檢查克隆的DNA的完整性?？寺〔呗砸詧D表的形式描述于圖5。
5.2感受態(tài)細胞的產(chǎn)生通過用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)500ml液體培養(yǎng)物，直到OD578達到0.5-1，來生產(chǎn)大腸桿菌和巨大芽孢桿菌感受態(tài)細胞。培養(yǎng)物在冰上冷卻并離心(4000×g；15分鐘；4℃)。細胞沉淀物完全重懸于滅菌去離子水，離心(4000×g；8分鐘；4℃)，再用滅菌去離子水洗一遍并再次離心(4000×g；8分鐘；4℃)。沉淀物用10％強度(v/v)的甘油溶液洗，然后離心(4000×g；8分鐘；4℃)，沉淀物重懸于最小量的10％強度(v/v)的甘油溶液中。大腸桿菌和巨大芽孢桿菌感受態(tài)細胞立即用于轉化。
5.3電穿孔法轉化細菌用與脈沖控制儀連接的基因脈沖發(fā)生器(BioRad)進行電穿孔轉化。為了達到該目的，140μl大腸桿菌或巨大芽孢桿菌感受態(tài)細胞與1μg質粒DNA加入到轉化杯，將其置于基因脈沖發(fā)生器中，在25μF和200Ω并聯(lián)電阻條件12kV/cm的場強下脈沖。
為了隨后的恢復，轉化后產(chǎn)生的轉化細胞立即加入到1ml LB培養(yǎng)基中并置于37℃溫度搖床中培養(yǎng)半小時，對于巨大芽孢桿菌則培養(yǎng)1小時。然后，將不同體積的混合物涂布于含有適當抗生素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。
5.4巨大芽孢桿菌的原生質體轉化原生質體制備將1ml巨大芽孢桿菌過夜培養(yǎng)物接種于50ml LB培養(yǎng)基中，置37℃進行培養(yǎng)。當OD578為1時，離心細胞(10000×g；15分鐘；4℃)并重懸于5ml新鮮制備的SMMP緩沖液中。在SMMP緩沖液中加入溶菌酶，接著將懸浮物37℃培養(yǎng)60分鐘，在顯微鏡下監(jiān)測原生質體的形成。離心(3000×g；8分鐘；室溫)收獲細胞，然后將細胞沉淀物小心重懸于5mlSMMP緩沖液中，重復離心和洗滌步驟一次。當加入10％(v/v)甘油后，可以將原生質體懸浮物分裝成小份凍于-80℃。
轉化將500μl的原生質體懸浮物與0.5-1μg在SMMP緩沖液中的DNA進行混合，并加入1.5ml PEG-P溶液。室溫孵育2分鐘后，加入5ml SMMP緩沖液并小心混勻，并將懸浮物離心(3000×g；5分鐘；室溫)。之后，立即去除上清液并且將幾乎看不見的沉淀物重懸于500μl SMMP緩沖液中。懸浮物在37℃輕輕振蕩孵育90分鐘。然后將50-200μl轉化了的細胞與2.5ml cR5上層瓊脂混合，鋪到含有適于選擇的抗生素的LB-瓊脂平板上。37℃培養(yǎng)一天后可見到轉化了的菌落。
5.5維生素B12的定量分析在巨大芽孢桿菌培養(yǎng)物的不同生長期抽取樣本用于維生素B12的定量測定。測定OD578之后，離心(4000×g；15分鐘；4℃)從培養(yǎng)基中分離細胞。用40ml等滲的NaCl溶液洗滌，然后再離心(4000×g；15分鐘；4℃)。隨后，所得到的細胞沉淀物和去除的培養(yǎng)基冷凍干燥。鼠傷寒沙門氏桿菌metE cysG雙突變體接種在含有甲硫氨酸和半胱氨酸的基本培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，然后從平板上刮下來并用40ml等滲的NaCl溶液洗滌。離心后，細胞沉淀物重懸于等滲的鹽溶液。將洗滌后的細菌培養(yǎng)物小心地與400ml含有半胱氨酸的基本培養(yǎng)基瓊脂在47-48℃混合。
已經(jīng)重懸于滅菌去離子水并經(jīng)沸水浴15分鐘后的10μl巨大芽孢桿菌的樣本涂于冷卻的平板上，37℃孵育18小時。長出的沙門氏菌的菌落直徑與所用的巨大芽孢桿菌樣本中的維生素B12含量成比例。通過加入0.01、0.1、1、10和40pmol的維生素B12做出校準圖，通過與此相比較可以推測出所研究的樣本中維生素B12的含量。這種標準方法可對生物材料中小量維生素B12進行快速和可重復性的監(jiān)測。
5.6巨大芽孢桿菌染色體DNA的制備為了得到染色體DNA，將巨大芽孢桿菌接種于150ml LB培養(yǎng)基中，在37℃，250轉/分鐘的條件下培養(yǎng)過夜。離心培養(yǎng)物(4000×g；10分鐘；4℃)并將細菌沉淀物重懸于13ml S-EDTA。取一刮鏟尖的先前溶于1mlS-EDTA內(nèi)的溶菌酶加入到懸浮物中。再向溶液中加入800μl 25％強度的SDS溶液，并在溫度搖床中37℃孵育30分鐘。在65℃孵育1小時后將該溶液與3.5μl 5M的高氯酸鈉和20ml氯仿/異戊醇(24∶1)混合物混合?；旌衔镌?℃振蕩30分鐘，然后離心(12000×g；10分鐘；4℃)。小心取出含有DNA的上層相，轉移到50ml刻度量筒中并在上面慢慢覆蓋一層30ml的乙醇。旋轉玻璃棒使沉淀于界面相的染色體DNA纏繞在玻璃棒上，再將之展開于5ml 0.1×SSC溶液中。
6蛋白質表達6.1S-腺苷-L-甲硫氨酸-尿卟啉原III甲基轉移酶(SUMT)在巨大芽孢桿菌中過表達將1.5ml巨大芽孢桿菌過夜培養(yǎng)物接種于150ml LB培養(yǎng)基中，37℃需氧培養(yǎng)。加入四環(huán)素篩選含有pWH1520-cobA表達質粒的細菌。當OD578達到0.3后，加入0.5％(w/v)的木糖誘導表達質粒的xyl啟動子。在誘導之前和誘導后每小時取相當于2OD578量的樣本。將取出的樣本離心(12000×g；3分鐘；室溫)并將沉淀的細胞重懸于40μl裂解緩沖液中。然后重懸液在37℃孵育30分鐘。將20μl裂解后的物質與5μl SDS-PAGE樣品緩沖液混合，水浴煮沸15分鐘后15000轉/分鐘離心30分鐘(8000×g；10分鐘；室溫)。上清液用于SDS-PAGE分析。
圖表說明所使用的細菌菌株和質粒列于表1和表2中。
表1所使用的細菌菌株表2所使用的質粒用下列圖表進一步解釋本發(fā)明。


圖1顯示在需氧生長條件下于Mopso基本培養(yǎng)基中巨大芽孢桿菌DSM509的維生素B12的產(chǎn)量。維生素B12的含量，以每升細菌培養(yǎng)物中的μg數(shù)表示，分別是在不含添加物的葡萄糖(1)，添加250μM CoCl2的葡萄糖(2)，添加298μM ALA和250μM CoCl2的葡萄糖(3)，不含添加物的甘油(4)，添加250μM CoCl2的甘油(5)，添加298μM ALA和250μM CoCl2的甘油(6)進行培養(yǎng)的含量。
圖2顯示巨大芽孢桿菌DSM509在需氧生長條件下和轉移到厭氧生長條件下的維生素B12產(chǎn)量的比較，在每種情況下均加入298μM ALA和250μMCoCl2(需氧)或500μM CoCl2(厭氧)。維生素B12的含量，以每升細菌培養(yǎng)物中的μg數(shù)表示，分別是在需氧條件下含葡萄糖培養(yǎng)物(1)，在指數(shù)生長期的中期(OD578＝3.0)轉移的含葡萄糖培養(yǎng)物(2)，在指數(shù)生長期的末期(OD578＝5.9)轉移的含葡萄糖培養(yǎng)物(3)，在需氧條件下含甘油培養(yǎng)物(4)，在指數(shù)生長期的中期(OD578＝4.7)轉移的含甘油培養(yǎng)物(5)，在指數(shù)生長期的末期(OD578＝12.0)轉移的含甘油培養(yǎng)物(6)進行培養(yǎng)的含量。
圖3顯示用pWH1520-cobA轉化了的巨大芽孢桿菌菌株DSM509與巨大芽孢桿菌菌株DSM509在需氧生長條件下于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，維生素B12產(chǎn)量的比較。維生素B12的含量，以每升細菌培養(yǎng)物中的μg數(shù)表示，分別為DSM509不含添加物(1)，添加250μM CoCl2(2)，添加298μM ALA和250μM CoCl2(3)。
DSM509-pWH1520-cobA不含添加物(4)，添加250μM CoCl2(5)，添加298μM ALA和250μM CoCl2(6)。
圖4顯示巨大芽孢桿菌DSM509 pWH1520-cobA在需氧(1)和厭氧(2)生長條件下于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并與轉移到厭氧生長條件下(3)培養(yǎng)的維生素B12產(chǎn)量的比較。轉移發(fā)生在OD578為6.9的對數(shù)生長期的末期。所顯示的維生素B12的含量以每升細菌培養(yǎng)物中的μg數(shù)表示。所有的培養(yǎng)物中均含有298μM ALA和250μM CoCl2。
圖5圖示了將來源于巨大芽孢桿菌的cobA基因克隆到過表達載體pWH1520的過程。通過PCR方法擴增的基因和質粒都用Spe I和BamH I酶切，并將所產(chǎn)生的粘性末端連接起來，使在新構建的pWH1520-cobA過表達載體中實現(xiàn)xylA-cobA的翻譯融合。
權利要求
1.用包含巨大芽孢桿菌的培養(yǎng)物制備維生素B12的方法，其中發(fā)酵是在需氧條件下于至少含有鈷和/或至少含有鈷和5-氨基乙酰丙酸的培養(yǎng)基中進行的。
2.如權利要求1所述的方法，其中鈷以約200至750μM的濃度范圍加入，優(yōu)選地以約250至500μM的濃度范圍加入。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中5-氨基乙酰丙酸以約200至400μM的濃度范圍加入，優(yōu)選地以約300μM的濃度加入。
4.如權利要求1至3中任意一項所述的方法，其中發(fā)酵是在含有甘油作為碳源的培養(yǎng)基中進行的。
5.如權利要求1至4中任意一項所述的方法，其中發(fā)酵第一步在需氧條件下進行，且第二步在厭氧條件下進行。
6.如權利要求1至5中任意一項所述的方法，其中從需氧發(fā)酵到厭氧發(fā)酵的轉變發(fā)生在需氧發(fā)酵細胞的指數(shù)生長期。
7.如權利要求1至6中任意一項所述的方法，其中從需氧發(fā)酵到厭氧發(fā)酵的轉變發(fā)生在需氧發(fā)酵細胞指數(shù)生長期的中期或末期，優(yōu)選地在末期。
8.如權利要求1至7中任意一項所述的方法，其中一旦需氧培養(yǎng)物達到其最大光密度或光密度至少在約3至12的范圍時將需氧發(fā)酵轉變?yōu)閰捬醢l(fā)酵。
9.如權利要求1至8中任意一項所述的方法，其中cobA基因顯示增強的表達和/或cobA基因以增加的拷貝數(shù)存在的巨大芽孢桿菌菌株用于發(fā)酵。
10.用于如權利要求1至3或5至9中任意一項所述方法中的經(jīng)轉化巨大芽孢桿菌菌株，它顯示出來自巨大芽孢桿菌的編碼S-腺苷甲硫氨酸-尿卟啉原III甲基轉移酶的cobA基因的核苷酸序列表達增強和/或拷貝數(shù)增加。
11.來自巨大芽孢桿菌的編碼S-腺苷甲硫氨酸-尿卟啉原III甲基轉移酶的、在需氧條件下表達的cobA基因的核苷酸序列的用途，用于產(chǎn)生如權利要求10中所述的經(jīng)轉化巨大芽孢桿菌菌株。
12.如權利要求10所述的經(jīng)轉化巨大芽孢桿菌菌株的用途，用于制備維生素B12。
全文摘要
本發(fā)明涉及用巨大芽孢桿菌制備維生素B12的方法。
文檔編號C12N1/21GK1545556SQ02816355
公開日2004年11月10日 申請日期2002年8月20日 優(yōu)先權日2001年8月22日
發(fā)明者A·金克爾, H·巴爾格, D·耶恩, J－H·馬騰斯, M·瓦倫, A 金克爾, 硤謁 申請人:巴斯福股份公司