擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4及其制備方法與應(yīng)用，該抗脂多糖因子的基因序列為SEQ?ID?NO1，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO2。通過構(gòu)建擬穴青蟹抗脂多糖因子SpALF4的重組表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)，獲得含SpALF4的表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)分離純化后，獲得重組蛋白，即SpALF4。所述抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4蛋白不但對多種水生動物細(xì)菌具有明顯的抑制作用，可以應(yīng)用于水產(chǎn)動物抗微生物新藥和抗病原微生物飼料添加劑，且對高等哺乳動物的真菌病原如白色念珠球菌也具有明顯抑制效果，可用于高等哺乳動物抗真菌藥物的開發(fā)。
【專利說明】擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)甲殼動物抗真菌型抗菌肽，尤其涉及到一種擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]抗脂多糖因子(Ant1-lipopolysaccharide factor, ALF)首次發(fā)現(xiàn)于當(dāng)體內(nèi)，因該因子具有抗凝血作用，能夠抑制細(xì)菌脂多糖(LPS)引發(fā)的凝集反應(yīng)，故命名為抗脂多糖因子。最早發(fā)現(xiàn)的鱟LALF對R-型革蘭氏陰性菌具有強(qiáng)烈的抑制作用。隨后對ALF的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)一步研究表明，ALF對LPS具有高親和力，能夠結(jié)合LPS類脂A并中和其生物學(xué)活性。此外，研究表明，ALF對于抵抗內(nèi)毒素血癥和內(nèi)毒素休克具有重要的治療作用。目前，多種甲殼動物ALF在對蝦、螯蝦、蟹等動物體內(nèi)相繼被鑒定。研究顯示，在受到不同病原或病原分子模式刺激時，該類分子在轉(zhuǎn)錄水平上呈現(xiàn)不同的上調(diào)表達(dá)模式，并且通過表達(dá)或合成的ALF蛋白常具有廣譜的抗微生物活性，對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌、真菌及WSSV等具有不同程度的殺滅或抑制作用。由此表明，ALF是動物體內(nèi)重要的免疫效應(yīng)因子。因而對來源于不同動物不同類型類的ALF進(jìn)行功能研究，鑒定其各自特異的抗微生物功能，能進(jìn)一步揭示甲殼動物抗感染免疫的機(jī)理，豐富抗感染免疫理論；同時，研究結(jié)果亦有利于新型抗微生物藥物或飼料添加劑的開發(fā)，為甲殼類乃至高等動物疾病的防治提供新的防治方法。
[0003]跟據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)結(jié)果，目前全世界甲殼動物(蝦蟹為主)的產(chǎn)值占到整個水產(chǎn)產(chǎn)值的近1/4，而甲殼動物每年因疾病造成的損失為5-10%。針對我國蝦蟹養(yǎng)殖面臨嚴(yán)峻疾病威脅的挑戰(zhàn)，要實(shí)現(xiàn)蝦蟹健康養(yǎng)殖和生態(tài)養(yǎng)殖的目的，開展蝦蟹免疫系統(tǒng)及其功能研究，挖掘具有重要免疫功能的免疫效應(yīng)因子(如抗菌肽)替代目前大量使用化學(xué)藥品治療疾病的方法，成為目前一個可行且有效地控制疾病的方法。擬穴青蟹Scylla paramamosain是我國乃至世界重要的海水經(jīng)濟(jì)蟹類。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的提供了一種擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4的成熟肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0005]本發(fā)明還提供了一種編碼基因，其編碼如SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列。
[0006]本發(fā)明還提供了一種擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4的全長氨基酸，其序列如SEQ ID N0:2所示。
[0007]本發(fā)明還提供了一種擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4的全長cDNA，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本發(fā)明還提供了一種擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
[0009](a)根據(jù)成熟肽序列SEQ ID NO: 6，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增成熟肽序列片段；[0010](b)構(gòu)建擬穴青蟹抗脂多糖因子SpALF4的重組表達(dá)載體；
[0011](c)將步驟(b)所獲得重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)，獲得含SpALF4的表達(dá)產(chǎn)物；
[0012](d)將步驟(C)所獲得表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)分離純化后，獲取重組蛋白，即SpALF4。
[0013]本發(fā)明還提供了擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4在制備抗真菌藥物中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明還提供了擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4在制備動物抗病原微生物飼料添加劑中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明在鑒定出擬穴青蟹的抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4的基礎(chǔ)上，根據(jù)獲得的SpALF4序列成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體并在大腸桿菌Rosetta (DE3)中表達(dá)，最后通過親和柱純化獲得重組蛋白SpALF4,該重組蛋白對真菌白色念珠球菌Candida albicans和多種革蘭氏陰性和陽性病原菌具有明顯的抑制和殺傷作用，因此，SpALF4在抗微生物感染新藥和新型抗病飼料添加劑的開發(fā)方面具有非常誘人的應(yīng)用前景。
[0016]附圖簡要說明
[0017]圖1為PGEX-4T-1載體雙酶切前后電泳圖譜。I為酶切前電泳條帶；2為酶切后電泳條帶；M為DNA Marker。
[0018]圖2為擴(kuò)增SpALF4成熟肽對應(yīng)DNA序列全長。M為DNA Marker, I為擴(kuò)增片段。
[0019]圖3為含pGEX-4T-l/SpALF4重組表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后及純化SpALF4的蛋白電泳圖譜。I為誘導(dǎo)前大腸桿`菌Rosetta(DE3)蛋白表達(dá)情況；2為誘導(dǎo)后大腸桿菌Rosetta(DE3)蛋白表達(dá)情況；3為純化后SpALF4蛋白樣品；M為蛋白Marker。
【具體實(shí)施方式】:
[0020]以下通過實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0021]實(shí)施例1:擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4全長cDNA序列的獲得
[0022]提取擬穴青蟹血細(xì)胞和肝胰腺混合組織樣品總RNA，經(jīng)檢測符合要求后，由上海南方基因中心利用二代測序技術(shù)進(jìn)行RNA樣品的轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析，獲得了大量基因的cDNA序列。利用在線生物信息學(xué)在線軟件blastx對序列其中一個全長756bp序列分析，發(fā)現(xiàn)該序列與據(jù)庫Genbank中ALF家族基因相似性最高，其中與三疣梭子蟹PtALF5的同源性高達(dá)72%，表明該序列為存在于擬穴青蟹體內(nèi)的ALF家族的新成員，命名為SpALF4，其核苷
酸序列及由其推導(dǎo)出的氨基酸序列如下所示。
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4成熟肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.一種編碼基因，其編碼權(quán)利要求1所述的成熟肽。
3.一種擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4全長氨基酸，其序列如SEQ ID N0:2所/Jn ο
4.一種擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4的全長cDNA，其堿基序列如SEQ IDNO:1所示。
5.擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (a)根據(jù)成熟肽序列SEQID N0:6，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增成熟肽序列片段； (b)構(gòu)建擬穴青蟹抗脂多糖因子SpALF4的重組表達(dá)載體； (c)將步驟(b)所獲得重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)，獲得含SpALF4的表達(dá)產(chǎn)物；及 (d)將步驟(c)所獲得表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)分離純化后，獲取重組蛋白，即SpALF4。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其中，在步驟(b)中，所述表達(dá)載體選用PGEX-4T-1；步驟(C)中，所述宿主菌為大腸桿菌Rosetta (DE3)。
7.如權(quán)利要求5或6所述的制備方法，其中，獲得所述成熟肽序列包括如下步驟:對擬穴青蟹血細(xì)胞和肝胰腺組織混樣`進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并對測定序列進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過與已有ALF家族比對，得到擬穴青蟹的抗真菌型抗脂多糖因子的cDNA序列SEQ ID NO: 1，確定其開放閱讀框SEQ ID N0:5，編碼SpALF4蛋白序列SEQ ID NO: 2，并推測其中的成熟肽序列SEQ ID NO:6。
8.擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4在制備抗真菌藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所示應(yīng)用，其中所述真菌為白色念珠球菌。
10.擬穴青蟹抗真菌型抗脂多糖因子SpALF4在制備動物抗病原微生物飼料添加劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/12GK103601795SQ201310552464
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】李新蒼, 房文紅, 周俊芳, 仉曉文, 朱磊 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所