一種基于液相分子雜交原理的高通量低成本snp分型方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，包括如下步驟：提取生物基因組DNA，并對(duì)其進(jìn)行生物素標(biāo)記；設(shè)計(jì)位點(diǎn)特異性雜交引物L(fēng)SP1和LSP2，并將LSP2進(jìn)行5’磷酸化；將LSP1混合物和LSP2混合物與基因組DNA雜交獲得雜交吸附產(chǎn)物；進(jìn)行延伸連接反應(yīng)獲得目的DNA片段；通用引物一輪PCR擴(kuò)增；對(duì)回收的目的片段進(jìn)行Barcode特異性引物PCR擴(kuò)增；高通量測(cè)序；分析得到SNP位點(diǎn)分型信息。本發(fā)明所述方法將液相雜交技術(shù)的位點(diǎn)選擇靈活性和高通量測(cè)序技術(shù)通量高、成本低的優(yōu)勢(shì)結(jié)合在一起，在SNP的大規(guī)模篩查、全基因組關(guān)聯(lián)分析、群體多樣性評(píng)價(jià)、基因功能分析等研究領(lǐng)域具有重大的應(yīng)用價(jià)值和廣泛的推廣前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA遺傳標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法。
【背景技術(shù)】
[0002]單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)主要指在基因組水平上，由于單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性。SNP具有分布廣泛、數(shù)量巨大，信息豐富，易于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已成為繼RFLP和SSR之后的第三代遺傳標(biāo)記。目前SNP被廣泛用于遺傳圖譜的構(gòu)建、群體遺傳學(xué)和親緣關(guān)系、關(guān)聯(lián)分析和基因功能分析等領(lǐng)域。
[0003]目前對(duì)于已知SNP位點(diǎn)的分型，根據(jù)不同研究需要和實(shí)驗(yàn)條件，已建立了眾多檢測(cè)方法，主要的分析原理包括限制性?xún)?nèi)切酶酶切技術(shù)、等位基因特異性寡核苷酸(allelespecific oligonucleotid, ASO)雜交、等位基因特異性引物延伸(allele specificprimer extension, ASPE)、單喊基延伸(single base extension, SBE)、寡核苷酸連接反應(yīng)(oligonucleotid ligation assay, OLA)等。主要的信號(hào)檢測(cè)方法有基于凝膠電泳的檢測(cè)、基于微陣列技術(shù)的檢測(cè)、飛行質(zhì)譜檢測(cè)和直接測(cè)序法等。其中以基于微陣列技術(shù)的分型方法通量最高，目前已有多種商業(yè)化的SNP分型技術(shù)。例如ABI公司利用OLA與微陣列技術(shù)結(jié)合建立了 SNPlex Genotyping System ;Affymetrix公司利用ASO與高密度DNA微陣列技術(shù)相結(jié)合也開(kāi)發(fā)了 SNP分型平臺(tái)；Illumina公司開(kāi)發(fā)的GoldenGate Genotyping Assay, 一次實(shí)驗(yàn)可對(duì)96個(gè)樣本的1536個(gè)SNP位點(diǎn)分型。而隨著全基因組擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展和超高密度磁珠微陣列的出現(xiàn)，I次對(duì)幾萬(wàn)甚至幾十萬(wàn)個(gè)SNP分型也成為可能。
[0004]然而目前這些基 于微陣列技術(shù)的高通量SNP分型方法在基因組信息豐富、芯片平臺(tái)相對(duì)完善的人類(lèi)和模式生物中應(yīng)用較多。對(duì)于遺傳信息相對(duì)匱乏的非模式生物，尤其是那些基因組較大，雜合性較高的物種，其芯片造價(jià)昂貴；且一次定制的芯片僅對(duì)固定位點(diǎn)分型，位點(diǎn)選擇靈活性不高；一張芯片只用于一個(gè)個(gè)體使用，對(duì)樣本量較大的群體分析和關(guān)聯(lián)分析仍存在較大挑戰(zhàn)。因而亟需一種靈活方便、成本低廉、高通量的SNP分型技術(shù)解決現(xiàn)有技術(shù)的局限性。
[0005]隨著新一代測(cè)序技術(shù)通量不斷提高和成本持續(xù)下降，借助測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)生物高通量SNP分型成為可能。借助已知基因組信息的重測(cè)序、以簡(jiǎn)化基因組測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的RAD、2bRAD等高通量技術(shù)目前已成功用于全基因組SNP的開(kāi)發(fā)。然而對(duì)于已知SNP位點(diǎn)的定點(diǎn)分型，現(xiàn)有測(cè)序分型的方法并沒(méi)有充分發(fā)揮高通量測(cè)序的優(yōu)勢(shì)，仍屬于中低通量分型方法，無(wú)法實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多位點(diǎn)、多樣本的高通量分型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于開(kāi)發(fā)一種新型生物高通量、高準(zhǔn)確性、高靈活性、低成本、方便快捷的SNP分型方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):[0008]一種基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，所述方法包括以下步驟:
[0009]I)提取生物基因組DNA，并對(duì)其進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0010]2)根據(jù)生物已知SNP位點(diǎn)的側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)引物L(fēng)SPl和LSP2，分別混合后得到引物L(fēng)SPl混合物和引物L(fēng)SP2混合物，并將引物L(fēng)SP2混合物進(jìn)行5’磷酸化；
[0011]3)將所述引物L(fēng)SPl混合物和引物L(fēng)SP2混合物與生物基因組DNA雜交，并進(jìn)行磁珠吸附獲得雜交吸附產(chǎn)物；
[0012]4)所述雜交吸附產(chǎn)物進(jìn)行延伸連接反應(yīng)獲得目的DNA片段；
[0013]5)第一輪PCR擴(kuò)增及目的DNA片段擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物為測(cè)序平臺(tái)通用配對(duì)引物5SLD 和 3SLD，或 Slx-1ST-MpPrimer-1 和 Slx-1 ST-MpPrimer-2 ；
[0014]6)對(duì)目的DNA片段進(jìn)行Barcode特異性引物二輪PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物為Mult1-Pl 和 Barcode_P2,或 Slx-2ND-MpPrimer 和 Slx-1ndex-Barcode ；
[0015]7)高通量測(cè)序；
[0016]8)測(cè)序數(shù)據(jù)分析得到SNP位點(diǎn)分型信息。
[0017]對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(2)中引物L(fēng)SPl包括3’端的位點(diǎn)特異性引物SPl和5’端的5SLD兩部分，3’端的引物SPl為與SNP位點(diǎn)鄰近的22個(gè)堿基互補(bǔ)的序列，5 ’ 端為通用弓 I物 5SLD5’ -CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’ ；
[0018]引物L(fēng)SP2包括5’端的位點(diǎn)特異性引物SP2和3’端的3SLD-RC兩部分，5’端的引物SP2為與SNP位點(diǎn)另一側(cè)第4個(gè)堿基后的22個(gè)堿基互補(bǔ)的序列，3’端為通用引物3SLD的反向互補(bǔ)序列 5’ -TTCGCCTTGGC`CGTACAGCAG-3’。
[0019]對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(2)中位點(diǎn)特異性引物SPl和SP2設(shè)計(jì)原則如下:1)、SP1和SP2所在的位置不能含有其他SNP位點(diǎn)或插入缺失；2)、SP1和SP2所在的位置序列不能出現(xiàn)5個(gè)以上連續(xù)的相同堿基；3)、SPl和SP2的Tm值在55_65°C之間；4)、SPl和SP2的長(zhǎng)度定為20-24nt。
[0020]對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(3)中所述雜交及磁珠吸附方法如下:位點(diǎn)特異性引物與基因組DNA雜交反應(yīng)總體積為50uL，包含IX雜交液，250nM LSPl引物混合物，250nM5’磷酸化的LSP2引物混合物，200ng生物素標(biāo)記的基因組DNA，經(jīng)平衡后懸浮于IOul Wash/Binding Buffer 的磁珠；
[0021]雜交反應(yīng)條件為:70°C 12分鐘，以后每個(gè)循環(huán)減2°C;69°C 12分鐘，以后每個(gè)循環(huán)減2°C，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)后，保持30°C，整個(gè)雜交反應(yīng)進(jìn)行至少16小時(shí)。
[0022]對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(4)中延伸連接反應(yīng)的體系為50uL，包含經(jīng)洗滌得到的雜交吸附產(chǎn)物，IU DNA聚合酶，80U DNA連接酶，I XHF Buffer, ImM NAD,5mMdNTPs ;45°C 反應(yīng) 15 分鐘。
[0023]對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(5)中所述PCR擴(kuò)增引物序列如下:
[0024]5SLD:5’ CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3’
[0025]3SLD:5’ CTGCTGTACGGCCAAGGCGAA3’
[0026]Slx-1ST-MpPrimer-1:5’ACACTCTTTCCCTACACGACGCT3’ ；
[0027]SIX-1ST-MpPrimer-2:5’ GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT3’。
[0028]對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(5)中所述第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為 50uL,包含 30uL 反應(yīng)模板，5uM5SLD 或 SIx-1ST-MpPrimer-1 引物，5uM3SLD 或Slx-lST-MpPrimer-2 引物，15mM dNTPs, IU DNA 聚合酶，IXHF buffer ;PCR 反應(yīng)條件為98°C變性5s，60。。退火20s，72。。延伸10s，進(jìn)行17-20個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。
[0029]對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(6)中所述PCR擴(kuò)增引物序列如下:
[0030]Mult1-Pl:
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述方法包括以下步驟: 1)提取生物基因組DNA，并對(duì)其進(jìn)行生物素標(biāo)記； 2)根據(jù)生物已知SNP位點(diǎn)的側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)引物L(fēng)SPl和LSP2，分別混合后得到引物L(fēng)SPl混合物和引物L(fēng)SP2混合物，并將引物L(fēng)SP2混合物進(jìn)行5’磷酸化； 3)將所述引物L(fēng)SPl混合物和引物L(fēng)SP2混合物與生物基因組DNA雜交，并進(jìn)行磁珠吸附獲得雜交吸附產(chǎn)物； 4)所述雜交吸附產(chǎn)物進(jìn)行延伸連接反應(yīng)獲得目的DNA片段； 5)第一輪PCR擴(kuò)增及目的DNA片段擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物為測(cè)序平臺(tái)通用配對(duì)引物5SLD和 3SLD，或 Slx-1ST-MpPrimer-1 和 Slx-lST-MpPrimer-2 ； 6)對(duì)目的DNA片段進(jìn)行Barcode特異性引物二輪PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物為Mult1-Pl和 Barcode_P2,或 Slx-2ND-MpPrimer 和 Slx-1ndex-Barcode ； 7)高通量測(cè)序； 8)測(cè)序數(shù)據(jù)分析得到SNP位點(diǎn)分型信息。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步驟(2)中引物L(fēng)SPl包括3’端的位點(diǎn)特異性引物SPl和5’端的5SLD兩部分，3’端的引物SPl為與SNP位點(diǎn)鄰近的22個(gè)堿基互補(bǔ)的序列，5’端為通用引物5SLD5’-CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’ ； 引物L(fēng)SP2包括5’端的位點(diǎn)特異性引物SP2和3’端的3SLD-RC兩部分，5’端的引物SP2為與SNP位點(diǎn)另一側(cè)第4個(gè)堿基后的22個(gè)堿基互補(bǔ)的序列，3’端為通用引物3SLD的反向互補(bǔ)序列 5’- TTCGCCTTGGCCGTACAGCAG-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步驟(2)中位點(diǎn)特異性引物SPl和SP2設(shè)計(jì)原則如下:I)、SP1和SP2所在的位置不能含有其他SNP位點(diǎn)或插入缺失；2)、SPl和SP2所在的位置序列不能出現(xiàn)5個(gè)以上連續(xù)的相同堿基；3)、SPl和SP2的Tm值在55_65°C之間；4)、SPl和SP2的長(zhǎng)度定為20_24ntο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步驟(3)中所述雜交及磁珠吸附方法如下:位點(diǎn)特異性引物與基因組DNA雜交反應(yīng)總體積為501^，包含1父雜交液，2501^ LSPl引物混合物，250nM 5’磷酸化的LSP2引物混合物，200ng生物素標(biāo)記的基因組DNA,經(jīng)平衡后懸浮于IOul Wash/Binding Buffer的磁珠； 雜交反應(yīng)條件為:70°C 12分鐘，以后每個(gè)循環(huán)減2V ；69V 12分鐘，以后每個(gè)循環(huán)減2°C，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)后，保持30°C，整個(gè)雜交反應(yīng)進(jìn)行至少16小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步驟(4)中延伸連接反應(yīng)的體系為50uL，包含經(jīng)洗滌得到的雜交吸附產(chǎn)物，IUDNA 聚合酶，80U DNA 連接酶，IXHF Buffer, ImM NAD, 5mM dNTPs ;45°C反應(yīng) 15 分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步驟(5)中所述PCR擴(kuò)增引物序列如下:
5SLD:5’ CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3’
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步驟(5)中所述第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50uL，包含30uL反應(yīng)模板，5uM5SLD 或Slx-1ST-MpPrimer-1 引物，5uM 3SLD或 Slx-lST-MpPrimer-2 引物，15mM dNTPs, IUDNA聚合酶，IX HF buffer ;PCR反應(yīng)條件為98°C變性5 s，60°C退火20 s，72°C延伸10 s,進(jìn)行17-20個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步驟(6)中所述PCR擴(kuò)增引物序列如下:

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于液相分子雜交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步驟(6)中所述Barcode特異性引物二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20uL，包含25ng第一輪 PCR 擴(kuò)增純化產(chǎn)物，2uM Mult1-Pl 或 Slx-2ND_MpPrimer 引物，2uM Barcode_P2 或Slx-1ndex-Barcode 引物，6mM dNTPs, IU Phusion 超保真 DNA 聚合酶，IX HF buffer ；反應(yīng)條件為98°C變性5 s，60°C退火20 s，72°C延伸10 S，進(jìn)行17-20個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸 5min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103555846SQ201310549040
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】包振民, 王師, 焦文倩, 竇錦壯, 于茜, 荀小罡, 張玲玲, 胡曉麗, 陸維 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)