一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法。通過模板制備、引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、公司測(cè)序等過程，獲得了該基因的完整cDNA序列，其核苷酸序列具有177bp，編碼的氨基酸序列具有58個(gè)氨基酸殘基。研究淡水小龍蝦的金屬硫蛋白基因有助于進(jìn)一步了解無脊椎動(dòng)物對(duì)抗重金屬離子脅迫的機(jī)制，以及解決目前水體環(huán)境重金屬污染帶來的養(yǎng)殖問題。
【專利說明】一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]無脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)與脊椎動(dòng)物的獲得性免疫系統(tǒng)不同，被稱為先天免疫系統(tǒng)。因此，無脊椎動(dòng)物防御病原微生物入侵的免疫系統(tǒng)，都是源于自身遺傳繼承的固定的免疫模式，主要包括物理屏障、細(xì)胞免疫和體液免疫。當(dāng)病原微生物入侵的時(shí)候，無脊椎動(dòng)物首先是通過自己的體表以及消化道來進(jìn)行物理防御，通過一個(gè)天然的物理屏障來阻擋病原微生物的侵染，但是，當(dāng)特異的病原微生物通過這層物理屏障之后，進(jìn)入到宿主體內(nèi)的時(shí)候，就會(huì)激發(fā)宿主自身的細(xì)胞免疫與體液免疫作用，而且，這兩種免疫形式幾乎是同時(shí)發(fā)揮功能的。如果入侵的病原微生物體積較小，那么，宿主會(huì)通過細(xì)胞免疫中的吞噬作用來將其吞噬，從而達(dá)到清除的目的。當(dāng)入侵的病原微生物體積較小，但是，數(shù)目較多的情況下，宿主就會(huì)通過細(xì)胞免疫中結(jié)節(jié)的形成以及包囊作用，將其大規(guī)模清除。當(dāng)入侵的病原微生物體積較大的時(shí)候，宿主就會(huì)啟動(dòng)體液免疫相關(guān)的黑化作用，將其固定并且瓦解，從而達(dá)到清除的目的。此外，體液免疫還包括宿主細(xì)胞表面存在的模式受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑關(guān)聯(lián)的抗菌肽的產(chǎn)生。通過物理屏障、細(xì)胞免疫和體液免疫三種形式的免疫作用，無脊椎動(dòng)物防范著病原微生物的入侵。
[0003]除了病原微生物的侵染是無脊椎動(dòng)物生存環(huán)境中需要面對(duì)的強(qiáng)大危險(xiǎn)源之外，水產(chǎn)類的無脊椎動(dòng)物(以 十足目中的甲殼類動(dòng)物為例)生存環(huán)境中的重金屬離子也是一個(gè)較為危險(xiǎn)的刺激源。重金屬離子對(duì)于甲殼類動(dòng)物的脅迫作用主要是通過重金屬離子在宿主體內(nèi)的多個(gè)器官的積累，造成器官功能的喪失，從而使宿主死亡。同樣，在這樣的環(huán)境中生存的甲殼類動(dòng)物體內(nèi)也存在著一些可以對(duì)抗這樣的刺激的基因與蛋白質(zhì)，研究表明金屬硫蛋白基因就是小龍蝦體內(nèi)存在的一個(gè)可以對(duì)抗重金屬脅迫的免疫基因。金屬硫蛋白基因是一類結(jié)構(gòu)較為保守的基因，廣泛存在于低等的無脊椎動(dòng)物體內(nèi)，其表達(dá)的產(chǎn)物是金屬硫蛋白分子，這一類蛋白質(zhì)的顯著特點(diǎn)就是分子中富含半胱氨酸殘基，這樣就造成了對(duì)于金屬離子具有較為強(qiáng)烈的親和性，因此，金屬硫蛋白分子的作用就是可以結(jié)合宿主體內(nèi)的金屬與重金屬離子，從而達(dá)到清除金屬與重金屬離子的作用。目前，相關(guān)的體外試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，金屬硫蛋白具有抗輻射、抗衰老、抗重金屬中毒、清除自由基、提高機(jī)體的免疫能力、提高機(jī)體的應(yīng)急能力、調(diào)節(jié)機(jī)體微量元素平衡的作用。
[0004]淡水小龍蝦是我國主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，隨著工業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展的加快，出現(xiàn)了水體環(huán)境被頻繁污染的情況，淡水小龍蝦體內(nèi)積累超量的金屬離子甚至重金屬離子，一方面會(huì)造成淡水小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)在經(jīng)濟(jì)方面的損失，另一方面會(huì)給相關(guān)消費(fèi)者帶了身體健康方面的隱患。因此，研究淡水小龍蝦的金屬硫蛋白基因有助于進(jìn)一步了解無脊椎動(dòng)物對(duì)抗重金屬離子脅迫的機(jī)制，以及解決目前水體環(huán)境重金屬污染帶來的養(yǎng)殖問題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT的核苷酸序列，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1，具有177bp。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼的氨基酸序列，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2，具有58個(gè)氨基酸殘基。
[0007]同時(shí)，本發(fā)明還提供該淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT的克隆方法。 [0008]本發(fā)明所提供的金屬硫蛋白基因Pc-MT來源于淡水小龍奸(Procambarusclarkii)，命名為Pc-MT基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1，具有177bp。
[0009]上述金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼的蛋白質(zhì)來源于淡水小龍蟲下(Procambarusclarkii)，命名為Pc-MT蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2，具有58個(gè)氨基酸殘基。
[0010]上述淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT的克隆方法，包括如下步驟:
[0011](I)選用淡水小龍蝦作為實(shí)驗(yàn)材料，利用動(dòng)物總RNA提取試劑盒提取各組織總RNA,獲得淡水小龍蝦各個(gè)組織的總RNA樣品；
[0012](2)以步驟(1)獲得的總RNA樣品作為模板，利用一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，獲得淡水小龍蝦各個(gè)組織的cDNA樣品；
[0013](3)設(shè)計(jì)擴(kuò)增淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼區(qū)的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
[0014]Pc-MT-F: 5' -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3'
[0015]Pc-MT-R: 5' ~TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG~3'
[0016]以步驟(2)中的淡水小龍蝦各個(gè)組織的cDNA樣品作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
[0017](4)將步驟(3)獲得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，之后進(jìn)行EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切，并且與經(jīng)過EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切處理的pET-28a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細(xì)胞之后，進(jìn)行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，獲得淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT的基因序列。
[0018](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學(xué)Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進(jìn)行氨基酸序列的翻譯,獲得對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0020]本發(fā)明涉及一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法。該基因在淡水小龍蝦體內(nèi)過量表達(dá)可以提高淡水小龍蝦先天免疫系統(tǒng)中金屬硫蛋白的表達(dá)量，從而可以提高淡水小龍蝦對(duì)抗生存的水體環(huán)境中重金屬離子的能力，提高繁殖與生存能力。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述
[0022]實(shí)施例1淡水小龍蝦肝胰腺組織中金屬硫蛋白基因Pc-MT的克隆
[0023](I)選用淡水小龍蝦肝胰腺組織作為實(shí)驗(yàn)材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動(dòng)物總RNA快速抽提試劑盒進(jìn)行總RNA的提取，獲得淡水小龍蝦肝胰腺組織的總RNA樣品；
[0024](2)以步驟(1)獲得的淡水小龍蝦肝胰腺組織的總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，獲得淡水小龍蝦肝胰腺組織的cDNA樣品；
[0025](3)設(shè)計(jì)擴(kuò)增淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼區(qū)的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
[0026]Pc-MT-F:5/ -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3;
[0027]Pc-MT-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3'
[0028]以步驟(2)中的淡水小龍蝦肝胰腺組織的cDNA樣品作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
[0029](4)將步驟(3)獲得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，之后進(jìn)行EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切，并且與經(jīng)過EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切處理的pET-28a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細(xì)胞之后，進(jìn)行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，獲得淡水小龍蝦肝胰腺組織中金屬硫蛋白基因Pc-MT的基因序列。
[0030](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學(xué)Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進(jìn)行氨基酸序列的翻譯,獲得對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0031]實(shí)施例2淡水小龍蝦血淋巴組織中金屬硫蛋白基因Pc-MT的克隆
[0032]( I)選用淡水小龍蝦作為實(shí)驗(yàn)材料，利用淡水小龍蝦血淋巴抗凝劑作為佐劑，使用醫(yī)用注射器從淡水小龍蝦腹節(jié)中部抽取血淋巴組織液，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動(dòng)物總RNA快速抽提試劑盒進(jìn)行總RNA的提取，獲得淡水小龍蝦血淋巴組織的總RNA樣品；
[0033](2)以步驟(1)獲得的淡水小龍蝦血淋巴組織的總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，獲得淡水小龍蝦血淋巴組織的cDNA樣品；
[0034](3)設(shè)計(jì)擴(kuò)增淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼區(qū)的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
[0035]Pc-MT-F:5/ -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3;
[0036]Pc-MT-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3'
[0037]以步驟(2)中的淡水小龍蝦血淋巴組織的cDNA樣品作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
[0038](4)將步驟(3)獲得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，之后進(jìn)行EcoR I核酸內(nèi)切酶和Xho I核酸內(nèi)切酶的雙酶切處理，并且與經(jīng)過EcoR I核酸內(nèi)切酶和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切處理的pET_28a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細(xì)胞之后，進(jìn)行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子·送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，獲得淡水小龍蝦血淋巴組織中金屬硫蛋白基因Pc-MT的基因序列。[0039](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學(xué)Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進(jìn)行氨基酸序列的翻譯,獲得對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0040]實(shí)施例3淡水小龍蝦腮組織中金屬硫蛋白基因Pc-MT的克隆
[0041](I)選用淡水小龍蝦腮組織作為實(shí)驗(yàn)材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動(dòng)物總RNA快速抽提試劑盒進(jìn)行總RNA的提取，獲得淡水小龍蝦腮組織的總RNA樣品；
[0042](2)以步驟(1)獲得的淡水小龍蝦腮組織的總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，獲得淡水小龍蝦腮組織的cDNA樣品；
[0043](3)設(shè)計(jì)擴(kuò)增淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼區(qū)的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
[0044]Pc-MT-F:5/ -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3;
[0045]Pc-MT-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3'
[0046]以步驟(2)中的淡水小龍蝦腮組織的cDNA樣品作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
[0047](4)將步驟(3)獲得 的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，之后進(jìn)行EcoR I核酸內(nèi)切酶和Xho I核酸內(nèi)切酶的雙酶切處理，并且與經(jīng)過EcoR I核酸內(nèi)切酶和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切處理的pET_28a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細(xì)胞之后，進(jìn)行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，獲得淡水小龍蝦腮組織中金屬硫蛋白基因Pc-MT的基因序列。
[0048](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學(xué)Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進(jìn)行氨基酸序列的翻譯,獲得對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0049]序列表
[0050]SEQ ID N0.1
[0051]內(nèi)蒙古科技大學(xué)
[0052]一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法
[0053]2013-10-22
[0054]2
[0055]I
[0056]177
[0057]cDNA
[0058]淡水小龍蝦
[0059]淡水小龍蟲下金屬硫蛋白基因
[0060](1)...(177)
[0061 ] atgccgggtccctgttgtaaagacaagtgcgagtgtgccgagggcgggtgcaagactggc 60
[0062]tgtgtgtgcacctcatgccgctgtgcacgctgcgacaagtgtacgtcgcggtgcaagtgt 120
[0063]ccatccagggaggagtgtgccgagacctgctccaagccctgcaagtgctgtccctag 177
[0064]SEQ ID N0.2[0065]2
[0066]58
[0067]PRT
[0068]淡水小龍蝦金屬硫蛋白
[0069](1)...(58)
[0070]MPGPCCKDVCECAEGGCKTQCVCTSCRCAP
[0071]151015202530
[0072]CDKCTSGCKCPSKEECAKTCSKPCRCCP
[0073]31354045505558 。`
【權(quán)利要求】
1.一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT，其特征在于，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT，其特征在于，淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼的蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為SEQ ID N0.2。
3.—種權(quán)利要求1所述的淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT的克隆方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)選用淡水小龍蝦作為實(shí)驗(yàn)材料，利用動(dòng)物總RNA提取試劑盒提取各組織總RNA，獲得淡水小龍蝦各個(gè)組織的總RNA樣品； (2)以步驟(1)獲得的總RNA樣品作為模板，利用一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，獲得淡水小龍蝦各個(gè)組織的cDNA樣品； (3 )設(shè)計(jì)擴(kuò)增淡水小龍蝦金屬硫蛋白基因Pc-MT編碼區(qū)的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
Pc-MT-F: 5' -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3'
Pc-MT-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3' 以步驟(2)中的淡水小龍蝦各個(gè)組織的cDNA樣品作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應(yīng)產(chǎn) 物； (4)將步驟(3)獲得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，之后進(jìn)行EcoRI核酸內(nèi)切酶和Xho I核酸內(nèi)切酶的雙酶切處理，并且與經(jīng)過EcoR I核酸內(nèi)切酶和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切處理的pET_28a大腸桿菌質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態(tài)細(xì)胞之后，進(jìn)行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，獲得淡水小龍蟲下金屬硫蛋白基因Pc-MT基因序列。 (5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學(xué)Expasy在線軟件(http://au.expasy.0rg)進(jìn)行氨基酸序列的翻譯,獲得對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103667302SQ201310534813
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】杜志強(qiáng), 李新蒼, 任乾 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古科技大學(xué)