一種棗樹(shù)抗病基因轉(zhuǎn)化的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種棗樹(shù)抗病基因轉(zhuǎn)化的方法，屬于植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體步驟包括：(1)預(yù)培養(yǎng)受體材料；(2)制備侵染液：包括：①農(nóng)桿菌菌液制備；②MS母液的制備；(3)侵染受體材料；(4)共培養(yǎng)；(5)抑菌及卡那霉素篩選培養(yǎng)；(6)分子檢測(cè)。本發(fā)明采用雙層培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)，既有效保證了受體的充足營(yíng)養(yǎng)，又克服了共培養(yǎng)期間因農(nóng)桿菌過(guò)度繁殖對(duì)受體材料正常生長(zhǎng)的抑制作用，并減輕了后期抑菌困難的問(wèn)題；具有較高的可重復(fù)性，在一定程度上縮短了棗樹(shù)遺傳育種的周期，使木本植物寧陽(yáng)大棗難于進(jìn)行基因介導(dǎo)的難題和因受體材料原因?qū)е碌那秩拘实拖聠?wèn)題得以改善，為進(jìn)一步的遺傳育種研究提供一種新的途徑。
【專利說(shuō)明】一種棗樹(shù)抗病基因轉(zhuǎn)化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種棗樹(shù)抗病基因轉(zhuǎn)化的方法，屬于植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]自古以來(lái)，棗因具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健和藥用價(jià)值，受到人們廣泛歡迎，這也使棗產(chǎn)業(yè)成為一些地方經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)之一，但棗瘋病的蔓延卻嚴(yán)重制約了棗產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，影響了人們對(duì)棗果的旺盛需求，限制了棗產(chǎn)區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展步伐。
[0003]1983年來(lái)，植物基因工程發(fā)展很快，但是在果樹(shù)上應(yīng)用的研究還很少，由于果樹(shù)育種周期長(zhǎng)，不斷地摸索試驗(yàn)快速有效的育種方法是很有意義的。對(duì)于棗瘋病的防治，多采用化學(xué)防治和物理防治等方法，但效果都難以持久。因此，利用基因工程技術(shù)，尋找一種以棗樹(shù)本身為基礎(chǔ)，從根本上解決問(wèn)題的方法，提高棗樹(shù)自身抵抗棗瘋病病毒的能力，成為解決此問(wèn)題的一種有效途徑。
[0004]本項(xiàng)技術(shù)發(fā)明采用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法是目前應(yīng)用最廣的基因轉(zhuǎn)化方法，具有操作簡(jiǎn)便、成本低、`轉(zhuǎn)化率高的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。但其也具有一定局限性，即基因介導(dǎo)的效率易受到很多因素的影響，如受體材料的部位、年齡、生長(zhǎng)狀態(tài)等，這就需要尋找最適合的搭配組合，最大限度地提高轉(zhuǎn)化效率。
[0005]在實(shí)際操作中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法要求先建立較完善的植物受體系統(tǒng)，一般采用的植物受體材料是葉盤或愈傷組織，這樣可以大大提高轉(zhuǎn)化效率，但對(duì)于很多難于建立高效再生體系的木本植物的基因轉(zhuǎn)化就有了很大限制。在棗樹(shù)等木本植物基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中還存在基因轉(zhuǎn)化困難，效率低、周期長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化后嵌合體現(xiàn)象嚴(yán)重等問(wèn)題，因此，如何解決棗樹(shù)等木本植物基因轉(zhuǎn)化困難并進(jìn)一步提高基因轉(zhuǎn)化效率成為當(dāng)前一個(gè)亟需解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)的缺陷，提供一種以棗樹(shù)組培苗莖段為受體材料，以pH6.2~7.0的MS母液與農(nóng)桿菌菌液的混合液為侵染液，受體轉(zhuǎn)化后共培養(yǎng)采用雙層培養(yǎng)基，抗生素篩選分3個(gè)階段進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)化方法，以解決木本植物棗樹(shù)基因轉(zhuǎn)化困難的問(wèn)題。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]一種棗樹(shù)抗病基因轉(zhuǎn)化的方法，具體步驟如下:
[0009](I)預(yù)培養(yǎng)受體材料:選擇大棗組培苗進(jìn)行取材，組培苗應(yīng)生長(zhǎng)健壯，無(wú)玻璃化及枯黃現(xiàn)象，高度I~3cm，貼近培養(yǎng)基的莖基部粗度目測(cè)高于1mm，每段莖段長(zhǎng)度為I~
1.5cm，至少保留一個(gè)芽，將剪取的莖段淺嵌于分化培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基厚度I~2cm，每瓶培養(yǎng)基體積約15~20ml,每瓶培養(yǎng)基可放6~8個(gè)莖段；將嵌入培養(yǎng)基的莖段置于黑暗環(huán)境下暗培養(yǎng)2~6d,培養(yǎng)溫度25°C左右。
[0010](2)制備侵染液:包括:①農(nóng)桿菌菌液制備:挑取農(nóng)桿菌菌株LBA4404(由中科院遺傳所提供)的單菌落接種到5ml含有50mg / L卡那霉素(Kanamycin)的YEP液體培養(yǎng)基中，在溫度25~30°C，震蕩轉(zhuǎn)速160~200rpm條件下培養(yǎng)12~48h，然后取I~5ml轉(zhuǎn)接于100ml含有50mg / L卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中，在溫度25~30°C、轉(zhuǎn)速160~200rpm的條件下培養(yǎng)12~24h，菌液0D6000.3~0.7時(shí)作為備用菌液；@MS母液的制備:本發(fā)明所用MS母液為MS培養(yǎng)基常用量的全量MS母液，按每升培養(yǎng)基常規(guī)用量配制，為包括大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)物四類溶液的混合液，母液混勻后高壓滅菌備用。[0011](3)侵染受體材料:先將制備好的農(nóng)桿菌菌液和MS母液按I / 3~I / 2體積比混合,將混合液倒入空的無(wú)菌培養(yǎng)瓶并調(diào)節(jié)PH6.2~6.7，備用；再將已預(yù)培養(yǎng)的受體材料莖段取出，置于無(wú)菌空培養(yǎng)皿中，立即用配制好的侵染液濡濕受體莖段，再在無(wú)菌條件下進(jìn)行適當(dāng)刻傷，對(duì)照材料同時(shí)進(jìn)行同樣刻傷處理?？虃幚砗?，將受體材料轉(zhuǎn)移至已盛有侵染液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)侵染15~20min，侵染液體積以沒(méi)過(guò)侵染材料為宜，侵染期間用手間歇搖動(dòng)侵染瓶，以使材料與侵染液充分接觸。
[0012](4)共培養(yǎng):侵染結(jié)束，取出受體莖段，用無(wú)菌濾紙吸干表面多余液體，轉(zhuǎn)接于表面加蓋一層用MS母液潤(rùn)濕的無(wú)菌濾紙的雙層培養(yǎng)基上，仍按每瓶培養(yǎng)基6~8個(gè)莖段放置。將封好口的培養(yǎng)瓶置于黑暗條件下共培養(yǎng)2~4d，培養(yǎng)溫度23~28°C左右。對(duì)照同樣處理。
[0013](5)抑菌及卡那霉素篩選培養(yǎng):共培養(yǎng)結(jié)束，將受體材料轉(zhuǎn)接于含有卡那霉素(kanamycin)和抑菌素Cef (頭孢霉素)的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，分3個(gè)階段進(jìn)行,各階段的培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)為PH6.2~7.0。第一階段卡那霉素20mg / L，抑菌素Cef (頭孢霉素)400mg / L,培養(yǎng)6~IOd ;第二階段卡那霉素40mg / L,抑菌素Cef (頭孢霉素)400mg /L，培養(yǎng)15~20d ;第三階段卡那霉素60mg / L，抑菌素Cef (頭孢霉素)200mg / L，培養(yǎng)20 ~30d。
[0014](6)分子檢測(cè):經(jīng)過(guò)上述兩個(gè)階段的Cef抑菌和卡那霉素篩選培養(yǎng)，20d后，受體莖段表現(xiàn)出明顯分離生長(zhǎng)狀態(tài)，超過(guò)I / 3的莖段出現(xiàn)由黃化至枯死的變化，約2 / 3莖段萌發(fā)出綠色的抗性新芽，抗性芽長(zhǎng)度大約0.5~1cm。對(duì)存活的抗性芽苗進(jìn)行采樣，提取抗性芽的DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA的方法是CTAB法，采用CcRIPII~2基因序列資料,設(shè)計(jì)引物:
[0015]引物1:5，~TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT ~3，；
[0016]引物2:5 ’ ~TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA ~3 ’。
[0017]通過(guò)采用上述基因轉(zhuǎn)化技術(shù)方案，以棗樹(shù)組培苗莖段為受體材料，以MS母液與農(nóng)桿菌菌液配伍的混合液為侵染液，受體轉(zhuǎn)化后共培養(yǎng)采用雙層培養(yǎng)基，抗生素篩選分3個(gè)階段進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)化方法，可以明顯提高基因轉(zhuǎn)化效率，經(jīng)PCR初次檢測(cè)，陽(yáng)性條帶檢出率可達(dá)100%，對(duì)檢出的抗性芽Kan純化培養(yǎng)，連續(xù)繼代6次，抗性苗檢出率穩(wěn)定在50%以上。本實(shí)驗(yàn)方案具有轉(zhuǎn)化材料易得，轉(zhuǎn)化過(guò)程簡(jiǎn)單易行，周期短，可重復(fù)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，為木本植物寧陽(yáng)大棗在基因轉(zhuǎn)化技術(shù)方面提供了新的突破。
[0018]該發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明方案找到了適合寧陽(yáng)大棗基因轉(zhuǎn)化的材料部位為莖段，材料易得，只要建立快繁無(wú)菌體就可以進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，突破了基因轉(zhuǎn)化對(duì)受體材料高效再生狀態(tài)的限制；采用雙層培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)，既有效保證了受體的充足營(yíng)養(yǎng)，又克服了共培養(yǎng)期間因農(nóng)桿菌過(guò)度繁殖對(duì)受體材料正常生長(zhǎng)的抑制作用，并減輕了后期抑菌困難的問(wèn)題；在抑菌及卡那霉素篩選培養(yǎng)階段，分別以3種篩選培養(yǎng)基逐步進(jìn)行，改善了脫離母體瓶苗莖段的營(yíng)養(yǎng)狀況，減低和緩解了抑菌篩選藥劑對(duì)受體材料的毒害作用。本發(fā)明方案為難于在短時(shí)間內(nèi)獲得高效再生體系的棗樹(shù)等木本植物提供了一種簡(jiǎn)單有效的基因轉(zhuǎn)化方法，具有較高的可重復(fù)性，在一定程度上縮短了棗樹(shù)遺傳育種的周期，使木本植物寧陽(yáng)大棗難于進(jìn)行基因介導(dǎo)的難題和因受體材料原因?qū)е碌那秩拘实拖聠?wèn)題得以改善，為進(jìn)一步的抗病遺傳育種研究提供一種新的途徑。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為本發(fā)明中抗性芽PCR產(chǎn)物電泳圖譜(M:DNA marker, DL2000 ；28:未轉(zhuǎn)基因植株；1~27:轉(zhuǎn)基因植株；CK+:陽(yáng)性對(duì)照，質(zhì)粒DNA ;CK~:陰性對(duì)照，水)。
[0020]圖2為本發(fā)明實(shí)施例中抗病性試驗(yàn)PCR檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述該發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
[0022]實(shí)施例1:
[0023]選擇泰山林科院自主培養(yǎng)的寧陽(yáng)大棗組培苗進(jìn)行取材，組培苗應(yīng)生長(zhǎng)健壯，無(wú)玻璃化及枯黃現(xiàn)象，高度1cm，貼近培養(yǎng)基的莖基部粗度目測(cè)應(yīng)不低于1mm，每段莖段長(zhǎng)度應(yīng)為1cm，至少保留一個(gè)芽，將剪取的莖段淺嵌于分化培養(yǎng)基表面。每瓶培養(yǎng)基可放8個(gè)莖段。將嵌入培養(yǎng)基的莖段置于黑暗環(huán)境下暗培養(yǎng)2d，培養(yǎng)溫度25°C左右。
[0024]挑取農(nóng)桿菌菌株LBA4404(由中科院遺傳所提供)的單菌落接種到5ml含有50mg / L Kan (kanamycin,卡那霉素)的YEP液體培養(yǎng)基中，在溫度28°C，震蕩轉(zhuǎn)速170rpm條件下培養(yǎng)24h，然后取Iml轉(zhuǎn)接于100ml含有50mg / L Kan的YEP液體培養(yǎng)基中，在溫度28°C、轉(zhuǎn)速180rpm的條件下 震蕩培養(yǎng)16h，至0D6000.4時(shí)作為備用菌液。
[0025]以MS培養(yǎng)基常用量的全量MS母液，按每升培養(yǎng)基常規(guī)用量配制，為包括大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)物四類溶液的混合液。母液混勻后高壓滅菌備用。
[0026]先將制備好的農(nóng)桿菌菌液和MS母液按I / 2體積比混合，并將混合液倒入空的無(wú)菌培養(yǎng)瓶，并調(diào)節(jié)PH6.7備用；再將已預(yù)培養(yǎng)的受體材料莖段取出，置于無(wú)菌空培養(yǎng)皿中，立即用配制好的侵染液濡濕受體莖段，再在無(wú)菌條件下進(jìn)行適當(dāng)刻傷對(duì)照材料同時(shí)進(jìn)行同樣刻傷處理?？虃幚砗螅瑢⑹荏w材料轉(zhuǎn)移至盛有侵染液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)侵染20min，侵染液體積以沒(méi)過(guò)侵染材料為宜，侵染期間用手間歇搖動(dòng)侵染瓶，以使材料與侵染液充分接觸；侵染結(jié)束，取出受體莖段，用無(wú)菌濾紙吸干表面多余液體，轉(zhuǎn)接于雙層培養(yǎng)基上，仍按每瓶培養(yǎng)基8個(gè)莖段放置。將封好口的受體材料培養(yǎng)瓶置于黑暗條件下共培養(yǎng)2d，培養(yǎng)溫度24°C左右。對(duì)照同樣處理。
[0027]共培養(yǎng)結(jié)束,將受體材料轉(zhuǎn)接于含有Kan (kanamycin,卡那霉素)和抑菌素Cef (頭孢霉素)的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，分3個(gè)階段進(jìn)行，各階段的培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)為pH6.2~7.0。3個(gè)不同階段不同設(shè)置分別為，第一階段Kan濃度20mg / L，抑菌素Cef (頭孢霉素)400mg / L，培養(yǎng)時(shí)間7d ;第二階段Kan濃度50mg / L，抑菌素Cef (頭孢霉素)400mg /L，培養(yǎng)時(shí)間28d。第三階段卡那霉素60mg / L，抑菌素Cef (頭孢霉素)200mg / L，培養(yǎng)20 ~30d。
[0028]經(jīng)過(guò)上述3個(gè)階段的Cef抑菌和Kan篩選培養(yǎng)，28d后，受體莖段表現(xiàn)出明顯分離生長(zhǎng)狀態(tài)，超過(guò)I / 3的莖段出現(xiàn)由黃化至枯死的變化，約2 / 3莖段萌發(fā)出綠色的抗性新芽，抗性芽長(zhǎng)度大約1cm。本發(fā)明方案試驗(yàn)中對(duì)存活的抗性芽苗進(jìn)行采樣，提取抗性芽的DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA的方法是CTAB法，采用CcRIP II~2基因序列資料，設(shè)計(jì)引物:
[0029]引物1:5'~TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT ~3'；
[0030]引物2:5'~TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA ~3'；
[0031]PCR反應(yīng)體系:
[0032]ddH20(16y L)
[0033]10 XBuffer (內(nèi)含 20mmol / LMgC12) (2 μ L)
[0034]Primerl (0.8 μ L)
[0035]Primer2 (0.8 μ L)
[0036]Template DNA(I μ L)
[0037]TaqE (0.3 μ L)
[0038]Totel (21 μ L)反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 45s ;55°C復(fù)性 40s ;72°C擴(kuò)增 Imin ;共 34cycle ;72°C延伸 5min。
[0039]對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色觀察。
[0040]GeneGenius全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照留存。
[0041]對(duì)抗性芽的PCR檢測(cè)結(jié)果表明，陽(yáng)性條帶檢出率為76%，經(jīng)對(duì)檢出的抗性芽Kan純化培養(yǎng)，連續(xù)繼代6次，抗性苗檢出率穩(wěn)定在55%以上，表明此方法有利于促進(jìn)棗樹(shù)基因轉(zhuǎn)化效率，見(jiàn)附圖1。
[0042]實(shí)施例2:
[0043]選擇泰山林科院自主培養(yǎng)的寧陽(yáng)大棗組培苗進(jìn)行取材，組培苗應(yīng)生長(zhǎng)健壯，無(wú)玻璃化及枯黃現(xiàn)象，高度2cm，貼近培養(yǎng)基的莖基部粗度目測(cè)應(yīng)不低于2_，每段莖段長(zhǎng)度應(yīng)為2cm，至少保留一對(duì)芽，將剪取的莖段淺嵌于分化培養(yǎng)基表面。每瓶培養(yǎng)基可放6個(gè)莖段。將嵌入培養(yǎng)基的莖段置于黑暗環(huán)境下暗培養(yǎng)4d，培養(yǎng)溫度25°C左右。
[0044]挑取農(nóng)桿菌菌株LBA4404(由中科院遺傳所提供)的單菌落接種到5ml含有50mg / L Kan (kanamycin,卡那霉素)的YEB液體培養(yǎng)基中，在溫度28°C，震蕩轉(zhuǎn)速190rpm條件下培養(yǎng)20h，然后取2ml轉(zhuǎn)接于100ml含有50mg / L Kan的YEP液體培養(yǎng)基中，在溫度28°C、轉(zhuǎn)速170rpm的條件下培養(yǎng)20h，至0D6000.6時(shí)作為備用菌液。
[0045]以MS培養(yǎng)基常用量的全量MS母液，按每升培養(yǎng)基常規(guī)用量配制，為包括大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)物四類溶液的混合液。母液混勻后高壓滅菌備用。
[0046]先將制備好的農(nóng)桿菌菌液和MS母液按I / 3體積比混合，將混合液倒入空的無(wú)菌培養(yǎng)瓶并調(diào)節(jié)PH6.4，備用；再將已預(yù)培養(yǎng)的受體材料莖段取出，置于無(wú)菌空培養(yǎng)皿中，立即用配制好的侵染液濡濕受體莖段，再在無(wú)菌條件下進(jìn)行適當(dāng)刻傷，對(duì)照材料同時(shí)進(jìn)行同樣刻傷處理。刻傷處理后，先將經(jīng)刻傷處理的對(duì)照轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基，再將受體材料轉(zhuǎn)移至盛有侵染液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)侵染15min，侵染液體積以沒(méi)過(guò)侵染材料為宜，侵染期間用手間歇搖動(dòng)侵染瓶，以使材料與侵染 液充分接觸；
[0047]侵染結(jié)束，取出受體莖段，用無(wú)菌濾紙吸干表面多余液體，轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上，仍按每瓶培養(yǎng)基6個(gè)莖段放置。將封好口的培養(yǎng)瓶置于黑暗條件下共培養(yǎng)3d，培養(yǎng)溫度25°C左右。對(duì)照同樣處理。共培養(yǎng)結(jié)束，將受體材料轉(zhuǎn)接于含有Kan (kanamycin，卡那霉素)的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，分3個(gè)階段進(jìn)行。各階段的培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)為pH6.2~7.0。3個(gè)不同階段不同設(shè)置分別為，第一階段Kan濃度20mg / L，抑菌素Cef (頭孢霉素)400mg /L，培養(yǎng)時(shí)間7d ;第二階段Kan濃度50mg / L，抑菌素Cef (頭孢霉素)300mg / L，培養(yǎng)時(shí)間28d。第三階段卡那霉素60mg / L，抑菌素Cef (頭孢霉素)200mg / L，培養(yǎng)20~30d。
[0048]經(jīng)過(guò)上述兩個(gè)階段的Cef抑菌和Kan篩選培養(yǎng)，21d后，受體莖段表現(xiàn)出明顯分離生長(zhǎng)狀態(tài)，超過(guò)I / 3的莖段出現(xiàn)由黃化至枯死的變化，約2 / 3莖段萌發(fā)出綠色的抗性新芽，抗性芽長(zhǎng)度大約0.7cm。本發(fā)明方案試驗(yàn)中對(duì)存活的抗性芽苗進(jìn)行采樣，提取抗性芽的DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA的方法是CTAB法，采用CcRIP II~2基因序列資料，設(shè)計(jì)引物:
【權(quán)利要求】
1.一種棗樹(shù)抗病基因轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于:所述方法具體步驟如下: (1)預(yù)培養(yǎng)受體材料:選擇大棗組培苗進(jìn)行取材，組培苗應(yīng)生長(zhǎng)健壯，無(wú)玻璃化及枯黃現(xiàn)象，高度I~3cm，貼近培養(yǎng)基的莖基部粗度目測(cè)高于1mm，每段莖段長(zhǎng)度為I~1.5cm,至少保留一個(gè)芽，將剪取的莖段淺嵌于分化培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基厚度I~2cm，每瓶培養(yǎng)基體積約15~20ml，每瓶培養(yǎng)基可放6~8個(gè)莖段；將嵌入培養(yǎng)基的莖段置于黑暗環(huán)境下暗培養(yǎng)2~6d，培養(yǎng)溫度25°C左右； (2)制備侵染液:包括:①農(nóng)桿菌菌液制備:挑取農(nóng)桿菌菌株LBA4404(由中科院遺傳所提供)的單菌落接種到5ml含有50mg / L卡那霉素(Kanamycin)的YEP液體培養(yǎng)基中，在溫度25~30°C，震蕩轉(zhuǎn)速160~200rpm條件下培養(yǎng)12~48h，然后取I~5ml轉(zhuǎn)接于.100ml含有50mg / L卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中，在溫度25~30°C、轉(zhuǎn)速160~200rpm的條件下培養(yǎng)12~24h，菌液0D6000.3~0.7時(shí)作為備用菌液?，②MS母液的制備:本發(fā)明所用MS母液為MS培養(yǎng)基常用量的全量MS母液，按每升培養(yǎng)基常規(guī)用量配制，為包括大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)物四類溶液的混合液，母液混勻后高壓滅菌備用； (3)侵染受體材料:先將制備好的農(nóng)桿菌菌液和MS母液按I/ 3~I / 2體積比混合，將混合液倒入空的無(wú)菌培養(yǎng)瓶并調(diào)節(jié)PH6.2~6.7，備用；再將已預(yù)培養(yǎng)的受體材料莖段取出，置于無(wú)菌空培養(yǎng)皿中，立即用配制好的侵染液濡濕受體莖段，再在無(wú)菌條件下進(jìn)行適當(dāng)刻傷，對(duì)照材料同時(shí)進(jìn)行同樣刻傷處理；刻傷處理后，將受體材料轉(zhuǎn)移至已盛有侵染液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)侵染15~20min，侵染液體積以沒(méi)過(guò)侵染材料為宜，侵染期間用手間歇搖動(dòng)侵染瓶，以使材料與侵染液充分接觸； (4)共培養(yǎng):侵染結(jié)束，取出受體莖段，用無(wú)菌濾紙吸干表面多余液體，轉(zhuǎn)接于表面加蓋一層用MS母液潤(rùn)濕的無(wú)菌濾紙的雙層培養(yǎng)基上，仍按每瓶培養(yǎng)基6~8個(gè)莖段放置；將封好口的培養(yǎng)瓶置于黑暗條件下共培養(yǎng)2~4d，培養(yǎng)溫度23~28°C左右；對(duì)照組同樣處理； (5)抑菌及卡那霉素篩選培養(yǎng):共培養(yǎng)結(jié)束，將受體材料轉(zhuǎn)接于含有卡那霉素(kanamycin)和抑菌素Cef (頭孢霉素)的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，分3個(gè)階段進(jìn)行,各階段的培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)為PH6.2~7.0 ;第一階段卡那霉素20mg / L，抑菌素Cef (頭孢霉素)400mg / L,培養(yǎng)6~IOd ;第二階段卡那霉素40mg / L,抑菌素Cef (頭孢霉素)400mg /L，培養(yǎng)15~20d;第三階段卡那霉素60mg / L，抑菌素Cef (頭孢霉素)200mg / L，培養(yǎng).20 ~30d ； (6)分子檢測(cè):經(jīng)過(guò)上述兩個(gè)階段的Cef抑菌和卡那霉素篩選培養(yǎng)，20d后，受體莖段表現(xiàn)出明顯分離生長(zhǎng)狀態(tài)，超過(guò)I / 3的莖段出現(xiàn)由黃化至枯死的變化，約2 / 3莖段萌發(fā)出綠色的抗性新芽，抗性芽長(zhǎng)度大約0.5~Icm ;對(duì)存活的抗性芽苗進(jìn)行采樣，提取抗性芽的DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA的方法是CTAB法，采用CcRIP II~.2基因序列資料，設(shè)計(jì)引物:
引物 1:5，~TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT ~3，；
引物 2:5’ ~TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA ~3’。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103525863SQ201310532582
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】馮殿齊, 黃艷艷, 劉靜, 羅磊, 趙進(jìn)紅, 張虹, 王玉山 申請(qǐng)人:泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院