專利名稱：：晚疫病抗病基因和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：用于提高作物對晚疫病(lateblight)的抗病性的新基因、組合物和方法。
背景技術(shù)：
：馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)在世界上最重要的作物中名列第四，并且是最重要的非谷類糧食作物。在馬鈴薯栽培中，限制產(chǎn)量的主要自然因素是由卵菌類(oomycete)病原體致病疫霉(Phytophthorainfestans(Mont.)deBary)導(dǎo)致的晚疫病。這種毀滅性的疫病若不加以控制，可導(dǎo)致作物產(chǎn)量絕收(^wieiyAskiandZimnoch-Guzowska2001)。殺真菌劑處理是目前控制晚疫病最常用的方法。然而，使用殺真菌劑的高額成本是一個問題，在發(fā)展中國家尤為如此。而且，因?yàn)槭褂脷⒄婢鷦πl(wèi)生和環(huán)境安全造成影響，所以化學(xué)藥劑的使用正在受到限制。此外，病原體會快速進(jìn)化，一些新的變體對普遍使用的殺真菌劑不敏感(DayandShattock1997；Goodwinetall996)。因此，在栽培型馬鈴薯中引入遺傳抗病性被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)對晚疫病可持續(xù)抵抗的一種有價值的方法。有人已經(jīng)介紹了馬鈴薯中兩種主要的晚疫病抗病類型(UmaerusandUmaerus1994)。第一，一般抗性往往是基于一個主要數(shù)量性狀位點(diǎn)(majorquantitativetraitloci)(QTL)和少數(shù)次要QTL，產(chǎn)生部分的抗病性。第二，特異抗性是基于主要顯性抗性(R)基因。上世紀(jì)前半葉的早期育種項(xiàng)目中，鑒定了11個來源于S.demissum的R基因(Rl-Rll)。9個R基因R3(現(xiàn)已分離為R3a和R3b)和R5-R11，位于11號染色體上(Bradshawetal.2006；El-Kharbotly1994,1996；Huangetal.2004；Huang2005)。其它S.demissum來源的R基因被定位到不同的位置，包括R1位于5號染色體(El-Kharbotlyetal.1994；Leonards-Schippersetal.1992)，R2位于4號染色體(Lietal.，1998)。由于對原本抗病的宿主具有毒力的新菌株很快就進(jìn)化出來，所有從S.demissum滲入到栽培型馬鈴薯的R基因均已經(jīng)被病原體攻克(UmaerusandUmaerus1994)。因此，人們曾認(rèn)為由QTL賦予的部分抗病性比由單個R基因賦予的抗病性更加持久(Turkensteen1993)。然而，部分抗病性與成熟類型(maturitytype)的相關(guān)性強(qiáng)，增大了抗性育種的困難(Wastie1991)。另夕卜，QTL的遺傳位置經(jīng)常相應(yīng)于R基因簇的區(qū)域(GebhartandValkonen2001；Grubeetal.2000)。因此，近來鑒定晚疫病抗病性的努力集中在來源于多種野生茄屬(Solanum)物種的、可提供廣譜抗病性的主要R基因。除了S.demissum之外，其它野生茄屬物種也被報道作為晚疫病抗病性的新資源，例如S.acaule,S.chacoense,S.berthaultii,S.brevidens,S.bulbocastanum,S.microdontum,S.sparsipilum,S.spegazzinii,S.，stoloniferum,S.sucrense,S.toralapanum,S.vernei禾口S.verrucosum(綜述見Jansky2000；Hawkes1990)。迄今為止，來自S.bulbocastanum的三個R基因，RB/Rpi-blbl，Rpi_blb2和Rpi-blb3,已經(jīng)被分別定位于8、6和4號染色體(Nasessetal.2000；Parketal.2005a；vanderVossenetal.2003，2005)。另一個可能來源于S.bulbocastanum的R基因，Rpi-abpt，已經(jīng)被定位在4號染色體上(Parketal.2005b)。還有人報道了位于7號染色體的來源于S.pinnatisectum的Rpil(Kuhletal.2001)，位于9號染色體的來源于S.mochiquense的Rpi-mcql(Smildeetal.2005)禾口來源于S.phureja的Rpi-phul(Sliwkaetal.2006)。通觀本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)，可以明顯地看出，人們對于可賦予晚疫病抗病性的新基因、組合物和方法的仍然存在顯著的需求。在本專利公開中，我們通過篩選野生茄屬物種，并通過克隆新型Rpi抗病基因并將其導(dǎo)入到馬鈴薯中進(jìn)行表達(dá)，滿足了這一需求。發(fā)明概要我們分離、鑒定并表征了數(shù)種不同的晚疫病R基因，它們來源于馬鈴薯野生種S.okadae，以及來自S.mochiquense禾口S.neorossii0本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)作物，特別是，但不僅限于馬鈴薯，針對由卵菌病原體致病疫霉導(dǎo)致的晚疫病的抗病性的新基因序列、組合物和方法。附圖簡述圖1.用于構(gòu)建BAC文庫的基因型世系。(a):K39和(b):K182。圖2.通過脈沖場凝膠電泳分析從兩個BAC文庫Κ39(a)和K182(b)隨機(jī)選出的BAC克隆的插入大小。BAC克隆用NotI消化。7.5Kb處的條帶來自于克隆載體pIndigoBAC-5。由lambda梯級(lambdaladder)(SigmaChemical)提供的分子量大小標(biāo)記在圖的右側(cè)給出ο圖3.晚疫病抗性基因來自S.okadae的Rpi-okal，Rpi_oka2和Rpi_oka3和來自S.neorossii的Rpi-nrsl,的定位位置。圖4.用于篩選兩個BAC文庫的SCAR標(biāo)記圖。用TaqI(a)消化的TG551連接于Rpi-okal，用Mwo1(b)和TG35(c)消化的TG551連接于Rpi_okal，U296361(d)和TG591(e)連接于Rpi-mcql。標(biāo)明了1Kb大小的梯帶(ladder)和親本基因型(A624，A613，A618禾口A988)，其余是通過先后進(jìn)行PCR和限制酶消化鑒定出的對某些標(biāo)記為陽性的BAC池。抗性等位基因在每個圖的右側(cè)用‘<<’標(biāo)明。圖5.從K39BAC文庫鑒定的并且覆蓋含Rpi-okal和Rpi-oka2基因組區(qū)域的BAC克隆重疊群。圖6.來源于Solanumokadae和S.neorossii的Rpi基因的高分辨率精細(xì)尺度(finescale)定位圖。圖7.Rpi-okal、Rpi_oka2和Tm_22的推定蛋白序列的比對。顯示了Rpi-okal的完整氨基酸序列，點(diǎn)指示另外兩個蛋白中相同的殘基。在Rpi-oka2和Tm-22來源的殘基與Rpi-okal不同之處，給出了這兩個蛋白的殘基。Rpi-okal和Rpi_oka2之間的兩個氨基酸差異用粗體標(biāo)明。預(yù)測的卷曲螺旋域(coiledcoildomain)用下劃線標(biāo)出，每個七聯(lián)體重復(fù)Ou5Ptadrepeat)中的第一和第四個疏水殘基用雙下劃線標(biāo)出。NB-ARC域中的保守基序用小寫字母斜體標(biāo)出。推定的富亮氨酸重復(fù)(LRR)在序列行上方標(biāo)出。圖8.Rpi-okal、Rpi-nrsl和Tm_22蛋白序列的比對。CC、NB_ARC禾ΠLRR域分別用紅、綠和桔紅色突出顯示。NB-ARC域內(nèi)的保守基序用斜體下劃線標(biāo)出。圖9.分別在群體7698和7663中圖定位的Rpi-okal(a)和Rpi-nrsl(b)座位在染色體IX上的遺傳連鎖圖。左側(cè)的數(shù)字表示遺傳距離(cM)。被圖定的座位的相對位置用水平線表示。字母η代表每個群體的大小。圖10.來自S.mochiquense的晚疫病抗性基因Rpi-mcql的圖定位置。圖11.從K182BAC文庫鑒定的、覆蓋含Rpi-mcql基因組區(qū)域的BAC克隆重疊群。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案詳細(xì)說明下面的序列作為本文所附的圖12SeaIDRpi序列l(wèi)aokalntlboka2ntIcokal轉(zhuǎn)基因，包括來自pSLJ21152nt的啟動子和終止子2amcql.1nt2bmcql.2nt2cmcql.1轉(zhuǎn)基因，包括來自pSLJ21153nt的啟動子和終止子2dmcql.2轉(zhuǎn)基因，包括來自pSLJ21148nt的啟動子和終止子3nrslnt4aokalaa4boka2aa5amcql.1aa5bmcql.2aa6nrslaa(nt=核苷酸序列，aa=多肽序列)上述序列是相對于本申請要求優(yōu)先權(quán)的GB0714241.7中公開的序列的延長序列。具體地，它們被延長的方式如下SEQIDIa-在起始部延長了99個額外堿基SEQIDIb-在起始部延長了141個額外堿基SEQID3-在起始部延長了相同的141個額外堿基SEQID4a_在起始部延長了33個額外氨基酸SEQID4b-在起始部延長了47個額外氨基酸SEQID6_在起始部延長了相同的47個額外氨基酸盡管如此，在先公開的主題并沒有被放棄。因此，本發(fā)明在上述定義延長序列方面公開的任何方面或?qū)嵤┓桨?，均?yīng)理解為經(jīng)過必要的修正或改變后可適用于在先公開的較短序列。因此，本發(fā)明這些方面或?qū)嵤┓桨傅拿恳粋€均是對如下的必要修正SEQIDIa-核苷酸100-2676SEQIDIb-核苷酸142-2718SEQID3-核苷酸142-2718SEQID4a_氨基酸34-891SEQID4b_氨基酸48_905SEQID6-氨基酸48-905如下序列是包含某些上述序列的表達(dá)盒在SEQIDlc(Rpi-okal)中-Rpi-okal啟動子包含在堿基1-709中，包括從堿基627到709的5，非翻譯區(qū)(UTR)。Rpi-okal開放閱讀框(ORF)位于堿基710-3382，終止子從堿基3383起。將其克隆到pSLJ21152中，然后用于轉(zhuǎn)化馬鈴薯(S.tuberosum)和番茄(S.lycopersicum)，從而賦予針對致病疫霉的抗病性。SEQID2b(Rpi-mcql.1)-Rpi_mcql·1啟動子包含在堿基1-2262中，Rpi-mcql.1開放閱讀框(ORF)位于堿基2263-4848，終止子從堿基4849起。將其克隆到pSLJ21153中，然后用于轉(zhuǎn)化馬鈴薯和番茄，從而賦予針對致病疫霉的抗病性。SEQID2d(Rpi-mcql.2)-Rpi-mcql.2啟動子包含在堿基1-1999中，Rpi-mcql.2開放閱讀框(ORF)位于堿基2000-4567中，終止子從堿基4568起。將其克隆到pSLJ21148中，然后用于轉(zhuǎn)化馬鈴薯和番茄，從而賦予針對致病疫霉的抗病性。如圖8所示，Rpi-okal和Rpi_nrsl序列親緣關(guān)系極近。如下文所述，我們認(rèn)為Rpi-oka的序列實(shí)際上與Rpi-nrsl是相同的，但為了完整起見，仍把它們納入本文。然而，本文后面提及的Rpi_oka3序列與Rpi_oka2相同，因此不再明示。最后，從S.mochiquense鑒定出了不同的候選Rpi基因，它們均在序列中示出。它們均被認(rèn)為是具有不同識別特異性的功能R基因。因此，在本發(fā)明的第一個方面中，公開了編碼功能Rpi基因的分離核酸分子，它們可以任選地從S.okadae,S.mochiquense禾口S.neorossii中選擇。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有如本文SEQ.ID.la,lb,2a,2b或3所提供的序列的分離Rpi抗性基因。所提供的本發(fā)明的核酸分子可以是從其自然環(huán)境中分離和/或純化的，處于基本上純凈或均一的形式，或者不含或基本上不含來源物種的其它核酸。在本文中使用時，術(shù)語“分離的，，涵蓋所有這些可能性。核酸分子可以完全是合成的或部分地是合成的。特別地，它們可以是重組的，體現(xiàn)在自然界中不會一起出現(xiàn)(不相鄰)的核酸序列被連接起來或者用其它方式人工組合起來。作為選擇，可以直接合成它們(例如通過使用自動合成儀器)。優(yōu)選的核酸基本上由所討論的基因組成，所述基因任選處于表達(dá)載體內(nèi)，這將在下文有更詳細(xì)的說明。根據(jù)本發(fā)明的核酸可以包括cDNA、RNA、基因組DNA和經(jīng)過修飾的核酸或核酸類似物。在具體說明DNA序列(例如參考附圖)的時候，除非上下文需要，否則即涵蓋RNA等價物，其中有T出現(xiàn)時替換為U。當(dāng)本文中提及本發(fā)明核酸時，該核酸的互補(bǔ)體也包含在本發(fā)明中。給定核酸(序列)的“互補(bǔ)體”與該核酸(序列)長度一樣，但與其100%互補(bǔ)。在公開本發(fā)明的基因組核酸序列時，含有任意一個或多個(例如2個)來自這些序列中任一序列的內(nèi)含子或外顯子的核酸也包括在內(nèi)。在此語境下的抗性基因是控制對由致病疫霉導(dǎo)致的晚疫病的抗性的基因。這種基因所編碼的多肽能夠應(yīng)答于所述病原體或其Avr基因產(chǎn)物的攻擊(challenge)而在植物體內(nèi)識別和激活抵抗應(yīng)答。第一個方面的核酸可以有利地在例如馬鈴薯中使用。本發(fā)明的核酸可以編碼上述氨基酸序列(4a，4b，5a，5b，6)的其中之一，例如與相應(yīng)的核苷酸序列簡并等價(degenerativelyequivalent)。在本發(fā)明進(jìn)一步的方面中公開的核酸是第一個方面的序列的變體。變體核酸分子與上述編碼序列的全部或一部分具有同源性或者同一。一般來說，變體可以編碼或者用于分離或擴(kuò)增編碼如下所述的多肽的核酸所述多肽能夠介導(dǎo)針對致病疫霉的應(yīng)答，和/或可特異結(jié)合用上述多肽(4a，4b，5a，5b，6)激發(fā)產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明的變體可以是人工核酸(即含有非自然來源的序列)，本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合本公開內(nèi)容能夠制備這樣的人工核酸。或者，它們可以是新的、天然存在的核酸，已經(jīng)或者可以利用本發(fā)明的序列從例如S.mochiquense,S.okadae和S.neorossii中分離。因此，變體可以是對應(yīng)于所提供的序列的一部分的獨(dú)特部分或片段(無論以何種方式產(chǎn)生)。片段可以編碼多肽的特定功能部分，例如LRR區(qū)或末端。同等地，所述片段可以用于探測或擴(kuò)增所提供的序列或與之緊密相關(guān)的序列。用于這些過程的合適片段長度和條件在下文有更詳細(xì)的討論。還包括在3’或5’端被延長的核酸。天然存在的序列變體可以包括等位基因或其它同源物(其可以在一個或多個堿基處含有多態(tài)性或突變)。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過例如定點(diǎn)或隨機(jī)突變，或者通過直接合成，可以制備人工變體(衍生物)。優(yōu)選地，從具有所述第一個方面的序列之全部或部分的原始核酸直接或間接地產(chǎn)生變體核酸(例如通過一個或多個擴(kuò)增或復(fù)制步驟)。優(yōu)選地，它編碼致病疫霉抗性基因。本文使用的術(shù)語“變體”核酸包括全部這三種可能性。在多肽或蛋白質(zhì)的語境下使用時，它指示變體核酸編碼的表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明關(guān)于變體的一些方面將在下文有更詳細(xì)的討論。計算核苷酸同一度如下Rpi-okalRpi-oka2Rpi-nrslRpi-mcql.1Rpi-mcql.2Rpi-okalRpi-oka298%Rpi-nrsl98%100%Rpi-mcql.184%83%83%Rpi-mcql.283%82%82%87%Tm2-280%79%79%85%84%計算氨基酸同一度如下Rpi-okalRpi-oka2Rpi-nrslRpi-mcql.1Rpi-mcql.2Rpi-okalRpi-oka298%Rpi-nrsl98%100%Rpi-mcql.176%75%75%Rpi-mcql.276%75%75%81%Tm2-272%71%71%77%75%上述多重比較的執(zhí)行使用AlignX(VectorNTISuiteInvitrogen)，其使用基于CLUSTAL矩陣的引擎。更一般地說，同源性(即相似性或同一性)可以用序列比較加以定義，使用GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin制作的WisconsinPackage10.0的GCG的BestFit和GAP程序。CLUSTAL也是BestFit使用的矩陣。參數(shù)優(yōu)選地設(shè)定如下，使用缺省設(shè)置缺口產(chǎn)生罰分(GapCreationpen):9;缺口延伸罰分(Gapextpen):2。同源性可以是核苷酸序列水平和/或編碼氨基酸序列水平。優(yōu)選地，核酸和/或氨基酸序列與SEQ.ID.la、lb、2a、2b或3或4a、4b、5a、5b、或6，視情況而定，具有至少大約50%、或60%、或70%、或80%同源性，最優(yōu)選地至少大約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^；99%同源性。特別地，本發(fā)明提供了一種分離的Rpi抗性基因，其具有與本文作為SEQ.ID.la,lb,2a,2b或3提供的序列至少大約80%同源的序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與本文作為SEQ.ID.4a、4b、5a、5b或6提供的序列至少大約80%同源的氨基酸序列。因此，根據(jù)本發(fā)明的變體多肽在本文所示的序列中可以包含單個氨基酸或2、3、4、5、6、7、8、9個氨基酸改變，大約10、15、20、30、40或50個改變，或大于大約50、60、70、80、90、100、200、400個改變。除了所示氨基酸序列內(nèi)的一個或多個改變之外，變體多肽可以在C端和/或N端包含額外的氨基酸。因此，在本發(fā)明進(jìn)一步的方面中，公開了一種產(chǎn)生衍生核酸的方法，包括修飾本發(fā)明核酸的編碼序列，例如SEQ.ID.la,lb,2a,2b或3，的步驟。改變序列以產(chǎn)生衍生物，可以通過如下的一種或多種方法實(shí)現(xiàn)在核酸中添加、插入、刪除或替換一個或多個核苷酸，導(dǎo)致在被編碼的多肽中添加、插入、刪除或替換一個或多個氨基酸。有多種原因可以導(dǎo)致需要改變，包括如下特征的引入或除去限制性內(nèi)切酶序列；密碼子使用；其它翻譯后修飾所需要的位點(diǎn)；所編碼多肽中的剪切位點(diǎn)；所編碼多肽中的基序(例如結(jié)合位點(diǎn))?？梢詫Ρ磉_(dá)蛋白添加或從其除去前導(dǎo)(leader)或其它靶序列，以決定其表達(dá)后的定位。所有這些都有助于以重組形式高效地克隆和表達(dá)活性多肽(如下文所述)。其它理想的突變可以是隨機(jī)或定點(diǎn)誘變，以改變所編碼多肽的活性(例如特異性)或穩(wěn)定性。改變可以采取保守變異的方式，即用一個疏水性殘基，例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，替換另一個疏水性殘基，或者用極性殘基彼此替換，例如用精氨酸替換賴氨酸，谷氨酸替換天冬氨酸，或谷氨酰胺替換天冬酰胺。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通過保守替換改變多肽的一級結(jié)構(gòu)可以不顯著改變該肽的活性，因?yàn)椴迦氲叫蛄兄械陌被岬膫?cè)鏈可能能夠形成與替換掉的氨基酸的側(cè)鏈相似的鍵和接觸。甚至當(dāng)替換發(fā)生在決定肽構(gòu)型的關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)時也是如此。還包括具有非保守替換的變體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，對于決定肽構(gòu)象非關(guān)鍵的區(qū)域內(nèi)的替換對其活性不會有大的影響，因?yàn)樗鼈儾粫@著改變肽的三維結(jié)構(gòu)。在決定肽構(gòu)型或活性的關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)，這些改變可以賦予多肽以有利的性質(zhì)。事實(shí)上，改變，例如如上所述的改變，可能賦予肽以稍微有利的性質(zhì)，例如改變的穩(wěn)定性或特異性。例如，對本發(fā)明核酸所編碼多肽的LRR區(qū)進(jìn)行操作可允許產(chǎn)生新的抗性特異性，例如針對致病疫霉分離株(isolate)的抗性特異性。LRR區(qū)也可以被移植到其他NBS區(qū)(例如來自其它抗性基因的)上。因此，用于產(chǎn)生新特異性的方法可以包括將來自相關(guān)抗性基因的序列混合或摻入到本文公開的Rpi序列中。其它備選的Rpi序列修飾策略可采用如下文所述的PCROtoetal.,1989,Gene77，51-59)或DNA重排(Cramerietal.，1998，Nature391)。在下文的實(shí)施例中提供了對本發(fā)明一些ORF的詳細(xì)分析，包括具有替換的變體的存在，和關(guān)注區(qū)域的鑒定。在本發(fā)明進(jìn)一步的方面中，提供了鑒定和/或從植物中克隆核酸變體的方法，該方法采用獨(dú)特的Rpi核苷酸序列(例如，如SEQ.ID.1A、1B、2A、2B或3或其互補(bǔ)體中存在的序列，或者基于它們的簡并引物)。用于探測或擴(kuò)增反應(yīng)的寡核苷酸包括或者由長度為大約30個或更少的(例如18、21或24個)核苷酸組成。一般地，特異性引物的長度超過14個核苷酸。為了最佳特異性和成本效率，長度為16-24個核苷酸的引物可能是優(yōu)選的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能熟練地進(jìn)行用于PCR等過程的引物的設(shè)計。如果需要，可以用本文公開基因的整個限制片段進(jìn)行探測，長度為數(shù)以百計(100’s)或者甚至數(shù)以千計(1000’s)的核苷酸。優(yōu)選地，探針/引物從下述意義上說是獨(dú)特的它存在于全部或某些本文公開的Rpi序列中，但不存在于現(xiàn)有技術(shù)的抗性基因序列中。例如，本文提供的功能等位基因數(shù)據(jù)(見例如圖10或圖11)允許如下所述地鑒定功能Rpi等位基因。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的變體也可以通過如下的方法獲得，該方法包括(a)提供核酸制備物，例如從植物細(xì)胞提供；(b)提供核酸分子，其是如上所述的探針，(c)在所述核酸分子與所述制備物中任何所述基因或同源物雜交的條件下，使所述制備物中的核酸與所述核酸分子接觸，并根據(jù)其與所述核酸分子的雜交鑒定出所述基因或同源物(如果存在的話)。探測可以采用標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡技術(shù)。例如，可以從細(xì)胞提取DNA，用不同的限制酶加以消化。隨后可以在瓊脂糖凝膠上電泳來分離限制片段，然后使其變性并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍上。可以使標(biāo)記探針與濾膜上的DNA片段雜交，然后測定結(jié)合?？梢杂脕碜约?xì)胞的RNA制備物來制備用于探測的DNA?？梢詮募?xì)胞以基因組DNA、cDNA或RNA，或者它們的任意混合物的形式來提供測試核酸，優(yōu)選地作為存在于合適載體中的文庫提供。如果使用基因組DNA，則可用探針來鑒定基因的非翻譯區(qū)(例如啟動子等)，例如下文所述。任選地，可以利用所謂“核酸芯片”的方法進(jìn)行探測(綜述見Marshall&Hodgson(1998)NatureBiotechnology16:27-31)。可以通過在低嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交來進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)。對于探測而言，優(yōu)選的條件是嚴(yán)格度足夠高，從而存在這樣的簡單模式，其中只有少數(shù)雜交可被鑒定為陽性并可加以進(jìn)一步研究。例如，可以最先在如下條件下進(jìn)行篩選其包括大約37°C或者更低的溫度，小于大約50%的甲酰胺濃度，和中到低鹽濃度(例如標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽(“SSC”)=0.15M氯化鈉；0.15M檸檬酸鈉；PH7)?；蛘撸瑴囟却蠹s50°C或更低，高鹽(例如“SSPE”0.180mM氯化鈉；9mM磷酸氫二鈉；9mM磷酸二氫鈉；ImMEDTA鈉鹽；pH7.4)。優(yōu)選地，篩選在如下條件下進(jìn)行大約37°C，大約20%的甲酰胺濃度，和大約5XSSC的鹽濃度，或溫度大約50°C，鹽濃度為大約2XSSC。這些條件將容許鑒定與探針序列具有顯著程度(substantialdegree)的同源性(相似性、同一性)的序列，而不必要求鑒定出穩(wěn)定雜交體所需的完美同源性。合適的條件包括，例如對于同一性大約為80-90%的序列的檢測，在42°C下在0.25MNa2HPO4,pH7.2,6.5%SDS、10%硫酸右旋糖酐中雜交過夜，并最終在55°C下用0.1XSSC、0.SDS清洗。對于同一性大于大約90%的序列的檢測，合適的條件包括在65°C下在0.25MNa2HPO4,pH7.2,6.5%SDS、10%硫酸葡聚糖中雜交過夜，并最終在60°C下用0.1XSSC、0.1%SDS清洗。逐漸增加雜交嚴(yán)格度直至僅有少數(shù)克隆保留是本領(lǐng)域眾所周知的。當(dāng)可以獲得大量雜交片段而背景雜交較低時，即獲得了合適的條件。使用這些條件，可以對核酸文庫，例如反映表達(dá)序列的cDNA文庫，進(jìn)行搜索。本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全能夠在考慮寡核苷酸長度和堿基組成、溫度等因素的同時，采用具有期望嚴(yán)格度的合適條件進(jìn)行選擇性雜交。下面是一個用于計算具有給定序列同源性的核酸分子之間實(shí)現(xiàn)雜交所需的嚴(yán)格條件的常用公式(Sambrooketal.,1989)Tm=81.5°C+16.6Log[Na+]+0.41(%G+C)-0.63甲酰胺)_600/#bp(以雙鏈體形式)。作為上面公式的示例，使用[Na+]=和50-%甲酰胺，GC含量為42%，平均探針大小為200堿基，Tm為57°C。同源性每降低1%，DNA雙鏈體的Tm降低1-1.5°C。因此，使用42°C的雜交溫度可以觀察到具有大于75%序列同一性的靶分子。這樣的序列被認(rèn)為與本發(fā)明的核酸序列基本上同源。本領(lǐng)域技術(shù)人員可任意使用任何一種技術(shù)測量探針與核酸(例如DNA)的結(jié)合。例如，可以用放射性、熒光或酶標(biāo)記探針。其它不采用探針標(biāo)記的方法包括用PCR擴(kuò)增(見下文)或RNA酶剪切。識別出成功的雜交之后，對雜交的核酸進(jìn)行分離，這可以包括一步或多步PCR或在合適宿主中擴(kuò)增載體。因此，本發(fā)明這個方面的一個實(shí)施方案是這樣的核酸，其包括或者基本上由如下核苷酸序列構(gòu)成所述核苷酸序列互補(bǔ)于能夠同本文所提供的任何編碼序列雜交的核苷酸序列。這一點(diǎn)從另一個角度看，就是根據(jù)本方面的核酸能夠同本文所提供的任何編碼序列的互補(bǔ)核苷酸序列雜交。當(dāng)然，DNA一般是雙鏈的，印跡技術(shù)，例如Southern雜交，經(jīng)常在雙鏈分離之后執(zhí)行，不會區(qū)分兩條鏈的哪一條是雜交鏈。優(yōu)選地，能夠雜交的核酸或其互補(bǔ)體編碼能夠影響植物的抗性特征(特別是Rpi抗性應(yīng)答)的產(chǎn)物。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，核酸分子與變體的雜交可以間接地確定或鑒定，例如通過使用核酸擴(kuò)增反應(yīng)，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(見〃PCRprotocols;AGuidetoMethodsandApplications",Innis等人編，AcademicPress,NewYork,(1990))。還可以使用上述方法確定本發(fā)明的核苷酸序列之一在植物個體的遺傳語境內(nèi)的存在。這可以用于植物育種程序，例如用于直接在親本植物或子代(例如雜交Fl，F(xiàn)2等)中選擇含有負(fù)責(zé)該植物物種的期望特征的等位基因的植物。如下文中使用的，除非上下文另有要求，否則術(shù)語“Rpi核酸”意圖涵蓋任何如上文所述的本發(fā)明的核酸分子，包括功能變體。在本發(fā)明的一個方面中，上述的Rpi核酸處于重組體，優(yōu)選為可復(fù)制載體的形式?！拜d體”定義為包括任何質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或土壤桿菌(Agrobacterium)雙元載體，及其它，呈雙鏈或單鏈的線性或環(huán)狀形式，可以或者不可以自我傳輸或移動，并可以轉(zhuǎn)化原核或真核宿主，或是通過整合到細(xì)胞基因組內(nèi)，或是存在于染色體之外(例如具有復(fù)制起點(diǎn)的自主復(fù)制質(zhì)粒)。具體地包括穿梭載體，它的意思是天然地能夠或者通過設(shè)計能夠在兩種不同宿主生物體內(nèi)復(fù)制的DNA載體，所述宿主可以從放線菌和相關(guān)物種、細(xì)菌和真核生物(例如高等植物、酵母或真菌細(xì)胞)中選擇。包含根據(jù)本發(fā)明核酸的載體不需要包括啟動子或其它調(diào)節(jié)序列，特別是如果該載體要用來將核酸導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)以重組進(jìn)入基因組的話。優(yōu)選地，載體中的核酸受到合適啟動子或其它調(diào)節(jié)元件的控制或者任意地與之相連，用于在宿主細(xì)胞，例如微生物如細(xì)菌或植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。載體可以是在多種宿主內(nèi)發(fā)揮作用的雙功能表達(dá)載體。在基因組DNA的情況下，可以包含其自身的啟動子或其它調(diào)節(jié)元件，在cDNA的情況下，可以受到合適啟動子或其它調(diào)節(jié)元件的控制以便在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。“啟動子”的意思是一段核苷酸序列，從它開始可以引發(fā)下游(即在雙鏈DNA中有義鏈的3’方向)可操作連接的DNA的轉(zhuǎn)錄?！翱刹僮鬟B接”的意思是作為同一核酸分子的一部分連接，并合適地定位和取向，以便從啟動子起始轉(zhuǎn)錄。與啟動子可操作連接的DNA“受啟動子的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)”。因此，本發(fā)明的這個方面提供了基因構(gòu)建體，優(yōu)選地可復(fù)制的載體，其包括與本發(fā)明所提供核苷酸序列，例如SEQ.ID.la、lb、2a、2b或3或者其變體，操作連接的啟動子。一般地說，本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全能夠構(gòu)建載體并設(shè)計用于重組基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方案。可以選擇或構(gòu)建合適的載體，其含有合適的調(diào)節(jié)序列，包括啟動子序列、終止子片段、多聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因和其它合適的序列。更詳細(xì)的內(nèi)容見例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊第二版》(Sambrook等，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress)(或其更新版本)。在Ausubel等主編的《當(dāng)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)第二版(JohnWiley&Sons,1992)中詳細(xì)介紹了許多用于核酸操作的已知技術(shù)和方案，例如核酸構(gòu)建體的制備、誘變(見上面關(guān)于變體的討論)、測序、將DNA弓丨入到細(xì)胞內(nèi)和基因表達(dá)、以及蛋白質(zhì)分析。本文援弓丨并入Sambrook等和Ausubel等的公開內(nèi)容。在本發(fā)明這一方面的一個實(shí)施方案中，提供了一種基因構(gòu)建體，優(yōu)選地，可復(fù)制的載體，其包括與本發(fā)明所提供核苷酸序列操作連接的可誘導(dǎo)啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全理解術(shù)語“可誘導(dǎo)的”在用于啟動子時的含義。實(shí)質(zhì)上，應(yīng)答于被施加的刺激，可誘導(dǎo)啟動子控制下的表達(dá)“開啟”或增加。刺激的性質(zhì)隨啟動子不同而不同。合適的可誘導(dǎo)啟動子在沒有合適的刺激時幾乎不會導(dǎo)致表達(dá)或者僅導(dǎo)致不可檢測水平的表達(dá)(或無表達(dá))。其它的可誘導(dǎo)啟動子在不存在刺激時可導(dǎo)致可檢測的組成性表達(dá)。無論在沒有刺激時表達(dá)的水平如何，在正確的刺激存在時，從任意可誘導(dǎo)啟動子啟動的表達(dá)均會增加。在此語境中特別感興趣的是充當(dāng)植物載體的核酸構(gòu)建體。下面的文獻(xiàn)介紹了先前已在植物上廣泛成功使用的具體程序和載體Guerineau和Mullineaux(1993)(Planttransformationandexpressionvectors.In:PlantMolecularBiologyLabfax(CroyRRDed)Oxford,BIOSScientificPublishers,pp121-148)。在植物體內(nèi)工作的合適啟動子包括花椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)。Lindsey&Jones(1989)"PlantBiotechnologyinAgriculture，，Pub.OUPress,MiltonKeynes,M第120頁中公開了更多實(shí)例。可誘導(dǎo)的植物啟動子包括乙醇誘導(dǎo)啟動子，見Caddick等(1998)NatureBiotechnology16:177-180。純粹作為舉例，SEQ.ID.lc,2c和2d顯示okal,mcql.1和mcql.2的核苷酸序列，并且包括啟動子和增強(qiáng)子序列，它們可用在用于轉(zhuǎn)化馬鈴薯和番茄二者的構(gòu)建體內(nèi)。使用強(qiáng)組成型啟動子可能是理想的。如果期望，構(gòu)建體中可以包括可選擇的遺傳標(biāo)記，例如賦予可選擇表型的標(biāo)記，所述可選擇表型例如針對抗生素或除草劑(例如卡那霉素、潮霉素、草銨膦(phosphinotricin)、氯磺隆(chlorsulfuron)、甲氨蝶呤、慶大霉素、大觀霉素、咪唑啉酮和草甘膦(glyphosate))的抗性。本發(fā)明還提供了包括將這樣的構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞內(nèi)，特別是植物細(xì)胞內(nèi)的方法。在本發(fā)明進(jìn)一步的方面中，公開了含有根據(jù)本發(fā)明的異源構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，特別是植物或微生物細(xì)胞。術(shù)語“異源”在本方面用于泛指已經(jīng)使用遺傳工程，即通過人為干預(yù)，將目標(biāo)核苷酸的基因/序列(Rpi基因)引入到植物的所述細(xì)胞內(nèi)或它們的祖先內(nèi)。異源基因可以替換內(nèi)源等價基因，即通常執(zhí)行相同或相似功能的基因，或者所插入的序列可以附加于(beadditionalto)內(nèi)源基因或其它序列。植物細(xì)胞的異源核酸可以天然地不存在于該類型、品種(variety)或物種的細(xì)胞中。因此，異源核酸可以包含這樣的編碼序列，它屬于或衍生自特定植物細(xì)胞類型或植物物種或品種，并被置于不同類型的植物細(xì)胞或物種或品種的環(huán)境(context)中。另一種可能性是，核酸序列被置于細(xì)胞內(nèi)，此細(xì)胞中天然存在該序列或同源物；但是，該核酸序列連接和/或毗鄰于該細(xì)胞或該類型植物或物種或品種的細(xì)胞中天然不存在的核酸，例如可操作地連接于一個或多個用于控制表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，如啟動子序列。宿主細(xì)胞(例如植物細(xì)胞)優(yōu)選地被所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，也就是說，構(gòu)建體在細(xì)胞內(nèi)確立，改變細(xì)胞的一個或多個特征，從而改變表型，例如針對致病疫霉的表型。核酸可以用任何合適的技術(shù)轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞內(nèi)，例如由土壤桿菌攜帶的去甲Ti質(zhì)粒載體，利用其天然的基因轉(zhuǎn)移能力(EP-A-270355，EP-A-0116718，NAR12(22)8711-872151984)，粒子或基因槍轟擊(US5100792，EP-A-444882，EP-A-434616)，顯微注射(W092/09696，W094/00583,EP331083，EP175966，Greenetal.(1987)PlantTissueandCellCulture,AcademicPress)，電穿孔(EP290395,WO8706614GelvinDebeyser)，其它形式的直接DNA攝取(DE4005152,WO9012096，US4684611)，脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA攝取(例如Freemanetal.PlantCellPhysiol.291353(1984))，或渦旋法(例如Kindle，PNASU.S.Α.871228(1990d)PhysicalmethodsforthetransformationofplantcellsarereviewedinOard,1991,Biotech.Adv.9:1_11)。純粹作為舉例，下文實(shí)施例6中提出了用于馬鈴薯、番茄和煙草的轉(zhuǎn)化策略。其它的策略，特別是可用于茄屬(Solanum)的策略，是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的(見例如MansureandMagioli,ActaBotanicaBrasilica，2005(Vol.19)(No.1)139-148)。轉(zhuǎn)化技術(shù)的具體選擇將取決于其轉(zhuǎn)化特定植物物種的效率以及選用特定方法學(xué)實(shí)施本發(fā)明的人員的經(jīng)驗(yàn)和喜好。對于技術(shù)人員顯而易見的是，用于將核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的具體選擇不是關(guān)鍵的，也不會構(gòu)成對本發(fā)明的限制，植物再生技術(shù)的選擇也是如此。因此，本發(fā)明一個進(jìn)一步的方面提供了轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，包括將如上所述的構(gòu)建體引入到植物細(xì)胞中，并導(dǎo)致或允許載體與植物細(xì)胞基因組之間發(fā)生重組，從而將根據(jù)本發(fā)明的核酸引入到基因組中。本發(fā)明進(jìn)一步包括被根據(jù)本發(fā)明的核酸或載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，特別是植物或微生物細(xì)胞。在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中(即相對于所討論的核酸是轉(zhuǎn)基因的)，轉(zhuǎn)基因可以在基因組外(extra-genomic)載體上，或者是整合，優(yōu)選穩(wěn)定地整合到基因組中的。每個單倍體基因組可以有多于一個異源核苷酸序列。一般而言，轉(zhuǎn)化之后，可以再生植株，例如從單細(xì)胞、愈傷組織或葉盤再生，這在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。幾乎任何植物均可從植物細(xì)胞、組織或器官完全再生。在下列文獻(xiàn)中綜述了各禾中技術(shù)Vasil等，CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants,第I,II禾口III卷，LaboratoryProceduresandTheirApplications,AcademicPress,1984,禾口Weissbachandffeissbach,MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,1989。還提供了包含根據(jù)本發(fā)明植物細(xì)胞的植物。除了再生的植物之外，本發(fā)明還包括下述的全部這樣的植物的克隆、自交或雜交后代和后裔(例如Fl和F2后代)以及上述任何一種的任何部分。本發(fā)明還提供了這樣的植物的部分，例如任何可用于有性或無性生殖或繁殖的部分，包括插枝(cutting)、種子等，或者可作為商品的部分，例如塊莖。本發(fā)明進(jìn)一步提供了影響或調(diào)節(jié)植物針對病原體，特別是致病疫霉，更特別地是對本文所討論的任意分離株，的抗性程度的方法，該方法包括導(dǎo)致或允許上面所討論的異源核酸序列在所述植物的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的步驟。在進(jìn)行該步驟之前可以先進(jìn)行將所述核酸引入到所述植物或其祖先的細(xì)胞內(nèi)的步驟。優(yōu)選的用于轉(zhuǎn)化的植物是茄科(Solanaceae)植物，更優(yōu)選的是茄屬(Solanum)植物。任選地，植物可以是馬鈴薯(馬鈴薯)或番茄(番茄)。該方法還可包括對其它基因，例如可能參與抗性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的或者參與產(chǎn)生抗性應(yīng)答的基因，的操作。因此，提供了影響(influence或affect)植物對致病疫霉的抗性的程度的方法，所述方法包括導(dǎo)致或允許上文描述的異源核酸在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的步驟。在優(yōu)選方法中，將超過1個Rpi基因引入到植物中。根據(jù)其他策略，提供多個植物，各自具有不同的內(nèi)源或異源Rpi基因(其中所述植物中的至少1個包括本發(fā)明的異源Rpi基因，即，是通過上述技術(shù)方法產(chǎn)生的)?？梢詫⒍鄠€植物一起種植在單個區(qū)域內(nèi)，以使作物對致病疫霉抗性的程度或持續(xù)時間最大化?；蛘?，可以將多個植物在區(qū)域內(nèi)相繼地(例如輪流地(onarotation))種植，實(shí)現(xiàn)相同的效果。上面的討論一般地涉及本發(fā)明核酸用于在植物中產(chǎn)生功能性Rpi多肽，藉此提高其病原體耐受性的應(yīng)用。純粹為完整起見，我們指出，如果期望如此的話(例如在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，本文公開的信息也可用于降低細(xì)胞中這些多肽的活性或水平。用于實(shí)施下調(diào)的核酸和相關(guān)方法學(xué)(例如互補(bǔ)序列)構(gòu)成本發(fā)明的一部分。如上文指出的，本發(fā)明還涵蓋上文公開的任何Rpi(特別是功能性Rpi)核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物，以及通過表達(dá)編碼核酸從而在合適的條件下(可以在合適的宿主細(xì)胞內(nèi))制造表達(dá)產(chǎn)物的方法。優(yōu)選的多肽包括SEQ.ID.4a，4b，5a，5b，或6所示的氨基酸序列。然而，根據(jù)本發(fā)明的多肽可以是這些多肽的變體(等位變體(allele)、片段、衍生物、突變體或同源物等)。同時，本發(fā)明還包括這樣的多肽，其雖然明顯與功能性Rpi多肽相關(guān)(例如它們可與多肽免疫交叉反應(yīng)，或者它們與所述多肽具有同樣的特征性序列基序)，但不再有Rpi功能。表達(dá)后，如果需要，可以從表達(dá)系統(tǒng)分離重組產(chǎn)物。然而一般來說，本發(fā)明的多肽將在體內(nèi)使用(特別是在植物中(inplanta))。對于通過表達(dá)編碼核酸重組產(chǎn)生的、經(jīng)純化的本發(fā)明Rpi或變體蛋白，可以利用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)用于產(chǎn)生抗體。產(chǎn)生抗體的方法包括用蛋白或其片段免疫哺乳動物(例如小鼠、大鼠、兔子、馬、山羊、綿羊或猴子)?？梢杂枚喾N本領(lǐng)域已知技術(shù)中的任一種從被免疫的動物獲得抗體，并可以對抗體進(jìn)行篩選，優(yōu)選地利用抗體與目的抗原的結(jié)合。例如，可以使用Western印跡技術(shù)或免疫沉淀(Armitageetal，1992，Nature357:80-82)。抗體可以是多克隆或單克隆的。作為免疫哺乳動物的替代或補(bǔ)充，可以從重組產(chǎn)生的免疫球蛋白可變域表達(dá)文庫獲得具有合適結(jié)合特異性的抗體，例如使用在表面上展示功能性免疫球蛋白結(jié)合域的λ噬菌體或絲狀噬菌體；例如見W092/01047。針對某個多肽或肽產(chǎn)生的抗體可用于鑒定和/或分離同源多肽，進(jìn)而鑒定和/或分離編碼基因。因此，本發(fā)明提供了鑒定或分離具有Rpi功能(根據(jù)本文公開的實(shí)施方案)的多肽的方法，包括用如下所述的多肽來篩選候選肽或多肽該多肽包含抗體的抗原結(jié)合域(例如整個抗體或其片段)，所述抗體能夠結(jié)合Rpi肽、多肽或片段、變體或其變體，或者優(yōu)選地具有這種肽或多肽的結(jié)合特異性，例如具有本文鑒定的氨基酸序列。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面是特異性的結(jié)合成員，例如如下所述的抗體和包含抗體抗原結(jié)合域的多肽它們結(jié)合，優(yōu)選特異地結(jié)合SEQ.ID.4a、4b、5a、5b或6的序列或其突變體、變體或衍生物，另外它們的用途和利用它們的方法也是本發(fā)明進(jìn)一步的方面。上面的說明一般地涉及Rpi基因中被翻譯的和編碼的部分。另外本發(fā)明還包括基因的非編碼部分(UTR)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步的方面是編碼本文所述Rpi基因啟動子或其它UTR(3'或5')的分離核酸分子。如上面指出的，SEQ.ID.lc，2c和2d顯示了okal，mcql.1和mcql.2的核苷酸序列，并且包括可以在構(gòu)建體中使用，來轉(zhuǎn)化馬鈴薯和番茄的啟動子和終止子序列?？傊?，可以看出，本發(fā)明人分離、鑒定和表征了來自馬鈴薯野生種S.okadae以及來自S.mochiquense和S.neorossii的數(shù)種不同晚疫病R基因。因此，本發(fā)明提供了新基因序列、組合物和方法，用于提高作物，特別是，但不僅限于馬鈴薯，對由卵菌病原體致病疫霉導(dǎo)致的晚疫病的抗性。為了克隆這些晚疫病R基因，我們別出心裁地組合了多種方法學(xué)。如在下文的實(shí)施例中詳述的，我們從這兩個物種的基因組DNA構(gòu)建了兩個BAC文庫。在本專利公開中，我們說明了兩個這BAC文庫的構(gòu)建和分析。而且，我們利用在前期基因作圖實(shí)驗(yàn)中開發(fā)的基于PCR的標(biāo)記來鑒定和表征與晚疫病R基因關(guān)聯(lián)的BAC克隆。該過程為下列程序提供了方便R基因的精細(xì)(fine-scale)作圖、向著靶基因的染色體步移、物理作圖、乃至基因克隆。帶有大基因組DNA插入片段的文庫的構(gòu)建是基于作圖的基因克隆策略的基本步驟之一。已經(jīng)開發(fā)出了數(shù)種用于構(gòu)建文庫的方法，包括酵母人工染色體(YAC)、P1衍生人工染色體(PAC)、基于質(zhì)粒的克隆(PBC)、植物可轉(zhuǎn)化人工染色體(transformation-competentartificialchromosome,TAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)和雙元細(xì)菌人工染色體(BIBAC)(Feng等2006引用)。在過去數(shù)年里，從許多植物物種構(gòu)建了BAC文庫，包括糧食作物(staplecrops)/K稻、小麥和馬鈴薯(Taoetal.2002；Nilmalgodaetal.2003；Chenetal.2004)，以及其它物種，例如桃、大蒜、香蕉、糖用甜菜、大豆、花生和向日葵(Georgietal.2002；Leeetal.2003；Vilarinhosetal.2003；McGrathetal.2004；Wuetal.2004；Yukseletal.2005；Bouzidietal.2006；Fengetal.2006)。我們一直致力于用基于作圖的基因克隆方法從野生種S.okadae和S.mochiquense分離出賦予馬鈴薯對晚疫病的抗性的基因。S.mochiquense來源的基因已經(jīng)有報道，雖然它先前沒有被分離出來；而且最近S.okadae來源的基因也已經(jīng)被鑒定(Foster等，未發(fā)表的數(shù)據(jù))。作為邁向這些R基因的圖定克隆(map-basedcloning)的一個步驟，我們從含有Rpi-okal和Rpi_oka2的K39和含有Rpi_mcql的K182構(gòu)建了兩個BAC文庫。為了構(gòu)建高質(zhì)量的BAC文庫，關(guān)鍵的是對部分消化的條件進(jìn)行優(yōu)化，和精確地按尺寸選擇經(jīng)部分消化的DNA片段。較小的片段往往產(chǎn)生轉(zhuǎn)化效率高的較小插入克隆，而對于較大的片段，它產(chǎn)生的克隆中缺乏插入序列和轉(zhuǎn)化效率較低的比例往往較高(Feng等，2006)。在本研究中，選擇100-200Kb的片段用于BAC文庫。單倍體茄屬物種的大小范圍是800Mb-l，200Mb，取決于物種。Arumuganathan和Earle(1991)報道，S.berthaultii的單倍體基因組大小為840Mb，而馬鈴薯為800_930Mb。在本研究中，針對K39和K182文庫，分別獲得了平均插入序列大小為103.5Kb和85.5Kb的總共105，216和100，992個BAC克隆。假定馬鈴薯單倍體基因組大小為1，000Mb,我們估計，K39和K182文庫分別包含大約10.9和8.6倍基因組當(dāng)量。盡管我們選擇的DNA片段范圍是100-200Kb，但兩個文庫的平均插入大小小于預(yù)期。這種矛盾之處其他人也觀察到了(Daneshetal.1998；Meksemetal.2000；YukselandPaterson2005),Frijtersφ(1997)提出這可能是由于在尺寸選擇步驟中沒有完全除去的較小片段的存在所導(dǎo)致的。從基因組覆蓋率看，我們預(yù)期基因組的全部區(qū)域均應(yīng)被充分代表。對此，我們用已知與R基因Rpi-okal,Rpi-oka2和Rpi-mcql連鎖的基于PCR的標(biāo)記進(jìn)行了測試。為了最大程度地減少所需PCR反應(yīng)的數(shù)目，我們使用一種匯集(pooling)來策略篩選文庫。先前已有數(shù)種不同的匯集策略被用于篩選BAC文庫(Kleinetal.2000；Ozdemiretal.2004；Bouzidietal.2006)。在我們的研究中，我們使用平板匯集(platepooling)策略，結(jié)合平板池內(nèi)的列匯集和行匯集策略。將每個384孔板匯集(pool)，并從每個匯集池制備質(zhì)粒DNA。根據(jù)每個文庫的基因組當(dāng)量，我們在理論上預(yù)期，有11和9個匯集池會對特殊標(biāo)記呈陽性，而且在用限制酶消化以鑒定抗性等位基因特異性標(biāo)記之后，這些池中有一半會含有來自相應(yīng)于每個基因的單元型的BAC克隆。K39和K182文庫中對基于PCR的標(biāo)記呈陽性的BAC克隆與估計的基因組當(dāng)量一致或者優(yōu)于后者，并且鑒定出的平均數(shù)目分別為15和12.5。兩個均略高于根據(jù)基因組當(dāng)量預(yù)期的數(shù)目。這可能是由于馬鈴薯單倍體基因組大小被高估導(dǎo)致的，或者是由于所得BAC克隆的平均插入大小被低估導(dǎo)致的。另一方面，由于在我們的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)HindIII位點(diǎn)過多或過少存在，我們構(gòu)建的BAC文庫可能有偏倚。為了實(shí)現(xiàn)更好的代表性，其他人使用兩種或三種不同的限制酶，在構(gòu)建BAC文庫時富含A/T或GC(Changetal.2001；Taoetal.2002；Chenetal.2004)。根據(jù)用與Rpi基因連鎖的PCR標(biāo)記進(jìn)行BAC篩選的結(jié)果，我們對每個文庫的8個單獨(dú)BAC克隆的BAC末端進(jìn)行了測序。其中從K39和K182文庫中都鑒定出一個克隆，它與番茄9號染色體上的番茄花葉病毒R基因Tm-22(Lanfermeijeretal.2003)相似。此外，其它兩個來自K182文庫的BAC末端序列與數(shù)種不同的抗性蛋白相似。這些結(jié)果，以及我們在補(bǔ)充研究(Foster等，未發(fā)表；Zhu等，未發(fā)表)中構(gòu)建的Rpi-okal，Rpi_oka2和Rpi-mcql遺傳連鎖圖，它們結(jié)合起來表明，我們已經(jīng)鑒定出了覆蓋含有這些基因的基因組區(qū)的BAC克隆。大插入BAC文庫是染色體步移、BAC重疊群構(gòu)建和在含R基因區(qū)域內(nèi)物理作圖的極有用工具。盡管我們還沒有鑒定R基因的精確物理位置，如PCR法BAC篩選的結(jié)果和所選BAC克隆的BAC末端序列所示，但是通過從S.okadae和S.mochiquense構(gòu)建覆蓋10.9和8.6倍馬鈴薯單倍體基因組的BAC文庫，不但方便了Rpi基因的克隆，并且對于需要進(jìn)行基于作圖的克隆步驟的進(jìn)一步的馬鈴薯基因組研究也是有價值的。上面對本發(fā)明進(jìn)行了一般的公開，包括制作和使用可賦予晚疫病抗性的組合物的方法，下面提供的實(shí)施例用于提供本發(fā)明的書面描述，以使本發(fā)明，包括其最佳模式和等價物，能夠完全實(shí)現(xiàn)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，本發(fā)明，如這些實(shí)施例所例示的，并不僅限于這里提供的具體的實(shí)施例。為了理解本發(fā)明的范圍的目的，應(yīng)當(dāng)關(guān)注本公開所附的權(quán)利要求。實(shí)施例實(shí)施例1從野生馬鈴薯種Solanumokadae和Solanummochiauense構(gòu)建BAC文庫和晚疫病抗件座位附沂的克降的鑒定a.植物材料用于構(gòu)建這兩個BAC文庫的植物的世系如圖1所示。S.okadae植物K39是反式雜合子(transheterozygote)，同時攜帶最初來自親本A618的Rpi-okal和來自A624的Rpi-oka2(Foster等.未發(fā)表數(shù)據(jù))。S.mochiquense植物K182是Rpi-mcql(先前命名為Rpi-mocl；SmiIde等.2005)的雜合子，從一個BCl群體獲得。b.高分子量插入DNA的制備用于高分子量(HMW)DNA制備的方法是Liu和Whittier(1994)和Chalhoub等(2004)的方法之上略微修改得到的。將植物材料體外培育于沒有加蔗糖的Murashige和Skoog(MS)培養(yǎng)基上，收集幼葉組織并保存于-80°C。使用20克冷凍葉組織制備含有HMWDNA的DNA瓊脂塊(plug)。DNA瓊脂塊在0.7%inCert瓊脂糖(Biozym，Oldendorf，Germany)中制備，用裂解緩沖液(1%十二烷基肌氨酸，0.2mg/ml蛋白酶K和3.8mg/ml二乙基二硫代氨基甲酸鈉，溶解于0.5MEDTA，PH8.5)清洗，并于4°C保存在0.5MEDTA中直到需要，而不會降低DNA的質(zhì)量，如Osoegawa等(1998)所建議的。將保存的瓊脂塊浸泡在TE緩沖液中，切成小塊，并用5單位HindIII部分消化1小時，這些條件是根據(jù)先前優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定的，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)顯示這些條件可產(chǎn)生大小范圍為50-300kb的DNA。使用如Chalhoub等(2004)所述的三重尺寸選擇(triplesizeselection)以改善插入物的大小和均勻性。第一次尺寸選擇利用鉗位均勻電場(CHEF)脈沖場凝膠電泳(Bio-rad,Hercules,USA)在SeakemLE瓊脂糖(Biozym,Oldendorf,Germany)上進(jìn)行，在0.25xTBE緩沖液中1-40秒，120°，16小時和200V，然后直接在相同凝膠中進(jìn)行第二次尺寸選擇，在相同緩沖液中4-5秒，120°，6小時和180V。將含有100_200Kb的部分消化DNA的凝膠區(qū)域切下來，并分成兩部分。對于第三次尺寸選擇，將切下的凝膠片分別在SeaPlaqueGTG低熔點(diǎn)瓊脂糖(Biozym，Oldendorf，Germany)上電泳，3-4.5秒，120°，14小時和180V。將經(jīng)過尺寸選擇的DNA片段從凝膠上切下，并于4°C保存在0.5MEDTA(pH8)中。利用BioRad電洗脫系統(tǒng)(Bio-rad，Hercules，USA)通過電洗脫將DNA回收在40μ1IxTAE緩沖液中。c.BAC文庫構(gòu)津連接和轉(zhuǎn)化根據(jù)Allouis等(2003)和Chalhoub等(2004)所述的方法進(jìn)行，并做了一些修改。對于從經(jīng)尺寸選擇的DNA片段得到的總洗脫DNA，將它在100μ1反應(yīng)體系中與IOngpIndigoBAC-5載體(EpiCentreBiotechnologies，Madison,USA)和800UT4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs,Ipswich,USA)進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)物用Millipore膜(Millipore,Billerica,USA)在0.5xTE緩沖液中透析3小時。將3微升經(jīng)透析的連接反應(yīng)物與20μ1ElectroMaxDHlOB電感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen,Paisley,UK)混合，冰上溫育1分鐘，并在180V、200歐姆和25μF條件下電穿孔。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞回收到ImlSOC培養(yǎng)基(Invitrogen,Paisley,UK)中，37°C溫育1小時，涂布在含有17μg/ml氯霉素、125μg/mlIPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和100μg/mlX-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷)的選擇性LB培養(yǎng)基上，并在37°C過夜培育。利用QPix裝置(GenetixLtd.,Dorset,UK)挑取白色克隆到384孔微滴定板(GenetixLtd.，Dorset，UK)上，后者含有冰冷液(Freezingbroth)(1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl,0.63%K2HPO4,0.045%檸檬酸鈉，0.009%MgSO4,0.09%(NH4)2SO4jO.18%KH2PO4,4.4%甘油和17μg/ml氯霉素，PH7.2)，37°C溫育過夜，然后保存于-80°C。d.BAC插入物尺寸測定(sizing)為了確定BAC克隆的插入尺寸，隨機(jī)選擇BAC克隆，在3ml含有17μg/ml氯霉素的LB中37°C過夜培養(yǎng)。用略加改變的Qiagen質(zhì)粒抽提試劑盒的方法(QiagenLtd,Crawley,UK)分離BACDNA,并用NotI消化3小時，以便從載體釋放插入的DNA。消化的DNA用CHEF凝膠電泳(Bio-rad，Hercules，USA)在1%瓊脂糖凝膠上分離，參數(shù)為5-15秒、120°、16小時和200V，在0.5xTBE緩沖液中進(jìn)行。e.BAC文庫篩選和BAC克隆的表征將保存在各別384孔板中的BAC克隆匯集起來，并從每個匯集池制備質(zhì)粒DNA。用8種已知與已鑒定的Rpi基因連鎖的基于PCR的標(biāo)記(表la)對匯集后的DNA進(jìn)行篩選。一旦用特定的標(biāo)記引物鑒定出陽性匯集池，即利用高密度復(fù)制工具將該文庫的原始384孔文庫板復(fù)制到固體LB培養(yǎng)基上，并用與選擇單個陽性克隆相同的引物通過PCR對克隆的行和列進(jìn)行篩選。對選出的陽性克隆，用BigDyev.3.1循環(huán)測序試劑(AppliedBiosystems,FosterCity,USA)進(jìn)行BAC末端測序。測序反應(yīng)在JohnInnes中心基因組實(shí)驗(yàn)室(Norwich,UK)的ABI3730上運(yùn)行。此外，將從K39文庫BAC池匯集得到的質(zhì)粒DNA斑點(diǎn)印跡(spot-blotted)到Hybond-N+膜上，并用32p-標(biāo)記的okaNBS-Hae標(biāo)記作為探針通過雜交進(jìn)行探測。然后，對于用該探針鑒定出的池，將與之相應(yīng)的384孔BAC板雙點(diǎn)印跡(doublespot)到Hybond-N+膜上，并與相同的探針雜交，以從池中鑒定出各個BAC克隆。從鑒定出的BAC克隆中分離出BACDNA,并對其進(jìn)行SNaPshot指紋分析，從含有該探針的同源序列的BAC構(gòu)建出重疊群。該SNaPshot分析中也包括了使用選定的標(biāo)記引物(markerprimers)(TG551和TG35)PCR結(jié)果顯示為陽性的選定BAC克隆。f.結(jié)果BAC文庫的構(gòu)津和表征為了分離馬鈴薯晚疫病R基因，我們構(gòu)建了來自兩種植物K39和K182的兩個BAC文庫(圖1)。與一種易感S.okadae基因型異交的結(jié)果表明，K39是Rpi-okal和Rpi-oka2的反式雜合。對來自K182家系的植物的表型和基因型分析表明，K182對于Rpi-mcql是雜合的。從HindIII部分消化的馬鈴薯DNA構(gòu)建了兩個BAC文庫。來自K39和K182的文庫分別包含105，216和100，992個克隆，分別保存在274x384和263x384孔微滴定板中。從K39和K182文庫分別隨機(jī)選擇38和40個克隆，NotI消化得到DNA，對DNA進(jìn)行脈沖場凝膠分析來估計平均插入物的尺寸。來自兩個文庫的經(jīng)NotI消化的克隆的圖譜如圖2所示。對K39文庫，估計插入物尺寸范圍是60-165Kb，平均為103.5Kb，對于K182文庫，插入物尺寸范圍是50-130Kb，平均為85.5Kb。馬鈴薯的單倍體基因組大小估計為大約1，OOOMb,因此預(yù)期K39和K182文庫的基因組當(dāng)量分別為10.9X和8.6X。實(shí)施例2來自Solanumokadae和S.neorossii的Rpi基因的鑒定、作圖和克隆a.植物培育條件12itt(accession)Solanumokadag禾中〒禾口4ftkS·neorossii禾中〒(^lb)■自冑蘭Wageningen的遺傳資源中心(CentreforGeneticsResources,CGC)。將種子在70%乙醇中表面滅菌1分鐘，1.5%次氯酸鹽消毒5分鐘，在滅菌蒸餾水中漂洗3次，并置于含有3%蔗糖的固體MSOmirashigeandSkoog)培養(yǎng)基(2%瓊脂糖)上進(jìn)行萌發(fā)。將萌發(fā)的幼苗轉(zhuǎn)移到溫室，并定期用殺真菌劑和殺蟲劑進(jìn)行處理，以控制薊馬、蚜蟲、葉螨、白粉病和早疫病(Alternariasolani)。b.致病疫霉菌株、接種和抗病性評分(pathotestscoring)致病疫霉分離株98.170.3(小種(race)1.3.4.10.11；Smilde等2005)由Bangor大學(xué)DavidShaw博士提供，UK分離株90128(小種1.3.4.7.8.9.10.11)、ΙΡ0-0(毒力譜未知)禾口ECl(小種3.4.7.11)由荷蘭WageningenPlantResearchInternational的EdwinvanderVossen博士提供?！癝uperBlight，，分離株由UKDundeeSCRI的PaulBirch博士提供，是一種目前對英國和歐洲大陸的大量產(chǎn)業(yè)化種植的馬鈴薯栽培種具有致病性的分離株。分離株]\^324、]\^717、]\^778、]\^674、]\^622、]\^618和]\^650從波蘭IHAR獲得。將這些分離株在RyeB瓊脂上18°C保存。以2周一循環(huán)的頻率將新鮮的孢子囊亞傳代到新平板上來產(chǎn)生孢子囊。周期性地在合適的敏感性植物的離體葉片上確認(rèn)分離株感染宿主材料的能力。在RyeB培養(yǎng)基上培育10天后，通過用無菌去離子水沖洗平板收集新鮮的孢子囊，并使收獲的孢子懸浮液在新鮮的培養(yǎng)皿內(nèi)保持20分鐘。在此之后，大部分孢子囊粘附到平皿的塑料表面上。用新鮮的冷水替換原始懸浮液的水，將孢子囊重新懸浮，并在4°C溫育1-4小時，以誘導(dǎo)游動孢子釋放。使用一種離體葉片測定法來篩選針對致病疫霉的抗病性(在(Vleeshouwers等1999)的方法的基礎(chǔ)上加以修改)。每株植物摘下兩片葉子，插入到一小塊濕的花型海綿(floristsponge)內(nèi)，并置于9cm培養(yǎng)皿內(nèi)。葉片接種10μ1游動孢子懸浮液(20，000-50,000個游動孢子πιΓ1)，用畫筆(artist'sbrush)將接種體輕柔地鋪散在背軸的(abaxial)葉片表面。將平皿用塑料膜包裹起來，并在受控的環(huán)境條件下(18°C；18h光照/6h黑暗循環(huán))溫育7-12天，隨后對表型進(jìn)行評分。將有葉子顯示孢子形成病變的植物評為易感型；而沒有孢子形成并且沒有顯示可見的癥狀或壞死的葉子的植物則評為抗性型。若兩個葉片沒有顯示相同的反應(yīng)，則把這種表型看作中間型(弱抗性型)。為了確認(rèn)這些中間表型，至少進(jìn)行三次獨(dú)立的接種。對于區(qū)分鮮明的表型(兩個葉片均為抗性或者均為易感)，認(rèn)為兩輪獨(dú)立的接種就足夠了。c.DNA分離從植物材料分離DNA使用DNeasy96植物試劑盒(Qiagen)或者Park等2005的實(shí)驗(yàn)方案。簡而言之，將大約50mg葉片材料收集到250μ1核裂解緩沖液中(200mMTris-HClpH7.5,50mMEDTA,2ΜNaCl，2%CTAB)，向其中添加200μ1DNA提取緩沖液(IOOmMTris-HClpH7.5，350mM山梨醇，20mM亞硫酸氫鈉)。然后用具有2個3mm鋼球軸承(steelballbearing)的RetschMM300研磨器粉碎每個樣品的葉片材料，并在65°C溫育1小時。添加250微升的冰冷氯仿，混合樣品并以3500rpm離心10分鐘。將上清轉(zhuǎn)移到新試管內(nèi)，通過添加等體積的異丙醇沉淀DNA，隨后3500rpm離心60min。將沉淀的DNA風(fēng)干，并重新懸浮在100μ1TE中。d.AFLP和SSR分析及基于PCR的作圖對Pstl/Msel消化后的模板DNA進(jìn)行AFLP，方法基本上如(Thomas等1995)和(Vos等1995)所述，用Pstl+Ο和Msel+l引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增步驟，然后用PstI+2和MseI+3引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增步驟。將AFLP反應(yīng)產(chǎn)物變性，并在4.5%丙烯酰胺/7.5M尿素/0.5xTBE(45mMTris-硼酸鹽，ImMEDTA)凝膠上100W電泳2.5h來加以分離。電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)移到Whatman3匪紙，干燥但不固定，并暴露于X射線薄膜(X-OMATAR，Kodak)1-7天。從膠上切下可指示信息(informative)的AFLP條帶，在TE(IOmMTris-HClpH8.0,0.ImMEDTA)中重新水化。然后將凝膠片轉(zhuǎn)移到新鮮的TE中，粉碎，并通過14000g離心Imin除去碎片。為了克隆，首先用PCR再擴(kuò)增AFLP片段，使用2μ1上清液，并使用與最初擴(kuò)增相同的循環(huán)條件和引物。根據(jù)制造商的使用說明將終產(chǎn)物克隆到PGEM-TEasy(Promega,Madison,Wise.)中，并用ABIPRISMBigDye(v.3.1)TerminatorCycleSequencingReadyReactionkit(PEAppliedBiosystems)試劑盒根據(jù)制造商的使用說明進(jìn)行測序。SSRPCR反應(yīng)在25μ1反應(yīng)體積中完成，其含有20mMTris-HCl(pH8.4),50mMKCl，2.5mMMgCl2,dCTP、dTTP禾口dGTP各0.4mM,0.012mM非標(biāo)記dATP，370kbq[γ」3P)]dATP(AmershamBiosciences，)，每禾中弓|物各0·4μΜ，IUTaqDNA聚合醇(Invitrogen,Carlsbad,CA)和IOOng模板DNA。熱循環(huán)條件包括首先在94°C變性4min的步驟，隨后是2min的引物退火步驟(50°C或55°C，根據(jù)所用的引物對；見表2)，和72°C延伸90s的步驟。隨后的循環(huán)如下29個循環(huán)的94°Clmin、引物退火溫度2min，72°C90s，然后是72°C5min的最終延伸步驟。通過添加等量的終止溶液(含有溴酚藍(lán)和二甲苯藍(lán)的95%甲酰胺)使擴(kuò)增產(chǎn)物變性并加熱到98°CIOmin0將2_5微升反應(yīng)物在含有6M尿素的6%致變性聚丙烯酰胺上100W運(yùn)行2-4小時。將凝膠干燥，并暴露于X-ray膜，與AFLP反應(yīng)相同。常規(guī)的PCR在15μ1反應(yīng)體積中完成，其含有20mMTris-HCl(pH8.4),50mMKCl,1.5mM1%(12，每種(1^13各20(^]\1，每種引物各0.4“]\1，0.5^^9聚合酶(Invitrogen)禾口IO-IOOng模板DNA。熱循環(huán)條件典型地包括首先在94°C變性2min的步驟，隨后是35個循環(huán)的94°C15s，引物退火溫度(表2)30s，72°Clmin/kb擴(kuò)增產(chǎn)物，然后是72°CIOmin的最終延伸步驟。為了測序，在37°C用1.2U外切核酸酶I和xl.2USAP溫育30min來從PCR產(chǎn)物中除去引物和dNTP，隨后在80°C溫育20min使酶變性。測序使用ABIPRISMBigDye(v.3.1)TerminatorCycleSequencingReadyReactionkit(PEAppliedBiosystems)試劑盒根據(jù)制造商的使用說明完成。對序列進(jìn)行檢查，尋找抗性和敏感單元型之間的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，這些SNP能夠用于開發(fā)用于在分離群體中作圖的CAPS(剪切擴(kuò)增多態(tài)序列)標(biāo)記。e.結(jié)果各批CGN中致病疫霉抗性的變異用致病疫霉分離株98.170.3在離體葉片測定中對12批S.okadae進(jìn)行篩選顯示，在6批中存在抗性表型變異(表lb)。其余的6批均對這種分離株敏感，盡管有CGN數(shù)據(jù)表明它們中至少有3批對致病疫霉有中等或很強(qiáng)的抗性。抗性是顯著的，因?yàn)樽越臃N后第4天起(from4dayspostinoculation)葉片組織上完全沒有芽孢形成，而敏感性個體的葉片上明顯有大量菌絲生長(圖1)。敏感性葉片往往到接種后第7天為止完全變黑。S.okadae和S.neorossii作圖群體的開發(fā)將來自S.okadae中的5批的抗性個體與來自相同或不同批(表3)的敏感性個體雜交。在每個雜交中，對致病疫霉的抗性在所得的子代中11分離，表明在抗性親本中存在潛在的5個雜合Rpi基因。在易感性S.okadae植物與抗性S.neorossii植物之間進(jìn)行種間雜交。所得子代中的抗性分析表明存在一個以11比例分離的顯性Rpi基因。S.okadae中Rpi基因的作圖Rpi-oka1使用總共72種AFLP引物組合來篩選SokaOH抗性和敏感性池，以獲得與Rpi-okal連鎖的片段。引物組合Pstl+CT/Msel+AGA產(chǎn)生了一個97bp片段，它僅從SokaOH群體的抗性親本和抗性池中被擴(kuò)增出來。該片段的序列與來自番茄組合EST文庫(http://www,sRn.Cornell,edu)的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)SGN-U214221相似。從SGN-U214221的序列設(shè)計PCR引物，用它們從番茄(Solanumlycopersicum)(先前稱作Lycopersiconesculentum,Le)和潘那利番茄(S.pennellii)(先前稱作L.pennellii，Lp)擴(kuò)增出一條大約2kb的條帶，該條帶用AluI消化時顯示在兩個物種之間的多態(tài)性。通過對Le/Lp滲入系(introgressionlines)中該多態(tài)性的分析(EshedandZamir1994)，這個標(biāo)記被定位在IL9.2中，表明該標(biāo)記可能位于染色體IX的任一個臂上。在與IL9.2基本上重疊的IL9.1中沒有該多態(tài)性，提示該標(biāo)記緊鄰于任一染色體臂的著絲粒。使用不同的PCR引物(SokaM2.9LF5和SokaM2.9LR5)和DdeI消化，在Soka014群體中對該標(biāo)記(SokaM2.9L)進(jìn)行了作圖，結(jié)果其與Rpi-okal的距離為大約6cM(48個分離子中有3個重組體)(圖3)。根據(jù)SGN數(shù)據(jù)庫中已知的染色體IXRFLP標(biāo)記序列設(shè)計PCR引物，對從抗性和敏感性親本DNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并鑒定能夠用于CAPS標(biāo)記的SNP(表2)，用這樣的方法開發(fā)了更多的標(biāo)記。以此方式，Rpi-okal被圖定于在染色體IX的6.OcM區(qū)，由標(biāo)記C2_At4g02680和TG186劃界。標(biāo)記TG551和TG35被發(fā)現(xiàn)與Rpi-okal共分離(圖3)。Rpi-oka3用總共48種AFLP引物組合對Soka040群體的抗性和敏感性池進(jìn)行篩選。引物組合Pstl+AT/Msel+GCT產(chǎn)生了一個IOSbp的連鎖片段。對于該片段沒有發(fā)現(xiàn)顯著的序列相似性，并且盡管可以用根據(jù)該序列設(shè)計的PCR引物從Le和Lp擴(kuò)增一個片段，但是沒有發(fā)現(xiàn)可以用來在滲入系中圖定該標(biāo)記的多態(tài)性。然而，在Soka040群體的親本之間存在一個DdeI多態(tài)性，這使經(jīng)變換的(converted)PCR標(biāo)記(M6.44)得以被圖定在距Rpi_oka3大約23cM處(圖3)。AFLP引物組合Pstl+AA/Msel+GTC產(chǎn)生了一個大約260bp的連鎖片段。從該序列設(shè)計的引物從Le和Lp擴(kuò)增了一個片段，用HaeIII或Sau3AI消化時它顯示了多態(tài)性。該多態(tài)性存在于滲入系IL9-2中。在Soka040群體的親本之間沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，因此該標(biāo)記不能相對于Rpi_oka3來圖定。為了確認(rèn)Rpi_oka3在染色體IX上的位置，研究了4個SSR標(biāo)記(StmOOlO，Stm0017，Stm1051andStm3012；(Milbourne等1998))與Rpi_oka3的連鎖。Stm0017未能成功地從敏感性親本擴(kuò)增，因此不能用于作圖。StmOOlO，Stml051和Stm3012都被圖定在染色體IX的短臂(Milbourne等1998)上，它們均在抗性與敏感性的親本和池之間顯示多態(tài)性，進(jìn)一步證明該基因位于染色體IX上(圖3)。Rpi-oka2使用總共72種AFLP引物組合來篩選Soka013抗性和敏感池，以獲得與Rpi-okal連鎖的片段。AFLP引物組合Pstl+AA/Msel+CAT產(chǎn)生一個連鎖片段，其被變換成大約200bp的基于PCR的等位基因特異性標(biāo)記(PCR-basedallelespecificmarker)(Sokal3M5.17)。該標(biāo)記被圖定在距Rpi_oka2大約6.5cM處(圖3)。此外，在Rpi-oka2連鎖圖中設(shè)置了另外3個AFLP標(biāo)記(P12M44_103，P13M42_228和P17M33_472)(圖3)。因?yàn)镽pi-okal和Rpi_oka3顯示與染色體IX標(biāo)記TG551和TG35緊密連鎖，所以也考察了這些標(biāo)記與Rpi-okal的連鎖情況。在Soka013群體中，TG551和TG35被圖定在染色體IX上Rpi-oka2近著絲粒方向(centromericof)0.7cM處(圖3)，側(cè)翼是標(biāo)記T1421。在S.neorossii中對Rpi基因進(jìn)行作圖Rpi-nrsl總共11個AFLP標(biāo)記被定位在Rpi-nrsl連鎖圖上(圖3)。有人嘗試過將這些標(biāo)記轉(zhuǎn)換成SCAR標(biāo)記，以便研究能夠用來將這些標(biāo)記定位在Le/Lp滲入系上的多態(tài)性(Eshed和Zamir1994)。然而，這些標(biāo)記都沒有給出信息，因此未能利用這些標(biāo)記確認(rèn)Rpi_nrsl的染色體定位。標(biāo)記TG551確實(shí)顯示與Rpi-nrsl緊密連鎖，因此我們得出結(jié)論，Rpi_nrsl也位于染色體IX上，可能與Rpi_okal3位于相同的座位。與Rpi-okal，2，3和Rpi_nrsl緊密連鎖的NBS標(biāo)記在作圖中的使用將NBS標(biāo)記NBS3B(見實(shí)施例3)轉(zhuǎn)換成基于PCR的SCAR標(biāo)記，它可以用引物okaNBSHae-F和okaNBSHae_R(表2)加以擴(kuò)增。這些標(biāo)記從含有Rpi-okal，Rpi_oka2和Rpi-nrsl的抗性植物擴(kuò)增出了一個555bp的片段(標(biāo)記okaNBSHae)。在每個群體中，這個標(biāo)記顯示與抗性基因共分離(圖3)。對于Rpi-oka3，從抗性植物和易感植物均擴(kuò)增出了PCR產(chǎn)物。然而，通過用MaeIII消化將該標(biāo)記轉(zhuǎn)換成了CAPS標(biāo)記。該CAPS標(biāo)記在Soka040群體中顯示與Rpi_oka3共分離(圖3)。BAC文庫篩選和重疊群構(gòu)建我們使用了9個與Rpi-okal，Rpi_oka2和Rpi-mcql連鎖的PCR標(biāo)記對BAC文庫進(jìn)行篩選。如表Ia所示，TG551、TG35和TG186與Rpi-okal連鎖。TG551也與Rpi_oka2連鎖。標(biāo)記okaNBSHae同時與Rpi-okal和Rpi_oka2連鎖。盡管TG551與來自S.okadae的兩個基因均連鎖，但是來自Rpi-okal和Rpi-oka2單元型的該標(biāo)記的等位基因可以通過如表Ia所示的限制性消化加以區(qū)分。U282757、U296361、TG591和U279465均與Rpi_mcql連鎖。顯示對這些標(biāo)記呈陽性的BAC池的數(shù)目，對于K39文庫為11-17個不等，對于K182文庫為9-14個不等(表la)。在K39文庫中，從17個池擴(kuò)增出了TG186標(biāo)記。確定該標(biāo)記擴(kuò)增自哪個單元型(Rpi-okal或Rpi-oka2)是不可能的。TG186盡管是CAPS標(biāo)記，但與Rpi-okal相斥連鎖，并且Rpi-okal單元型中存在的等位基因不能與Rpi-oka2單元型中的等位基因區(qū)分。從18個池擴(kuò)增出了標(biāo)記okaNBSHae。由于該標(biāo)記在Rpi-okal和Rpi_oka2單元型之間沒有多態(tài)性，所以不可能根據(jù)該標(biāo)記來指定這些BAC的單元型。通過PCR從16個池擴(kuò)增出了TG551，限制酶消化顯示有6個池對Rpi-okal單元型呈陽性，7個對Rpi-oka2單元型呈陽性。通過PCR從11個池擴(kuò)增出了TG35，經(jīng)過限制性消化，其中8個顯示來自Rpi-okal單元型，提示其余3個來自Rpi-oka2單元型。圖4a-4c所示的是基于PCR的標(biāo)記及它們的相關(guān)限制圖譜的凝膠圖像。通過用okaNBSHae探針與合并的BACDNA雜交，總共鑒定了有67個池含有具備同源序列的BAC克隆。從含有來自已鑒定池的每個單個BAC克隆的高密度雙重斑點(diǎn)膜(highdensitydouble-spottedmembrane)的篩選中，總共鑒定了85個BAC克隆，分離了DNA并進(jìn)行BACSNaPshot指紋圖譜，還有10個選定的對TG551和/或TG35標(biāo)記呈陽性的克隆。在所產(chǎn)生的多個重疊群中，有1個重疊群含有通過如下方法鑒定的BAC克隆，a)使用連鎖標(biāo)記TG551，TG35和共分離標(biāo)記okaNBSHae進(jìn)行基于PCR的篩選，和b)用okaNBSHae標(biāo)記作為探針進(jìn)行雜交。該BAC重疊群如圖5所示。表Ia用與晚疫病抗性座位連鎖的基于PCR的標(biāo)記對BAC池進(jìn)行篩選標(biāo)記_連鎖基因_PCR命中aREb消化后命中eTG551Rpi-oka216TaqI7TG551Rpi-okal16MwoI6okaNBSHaeRpi-okal&18不適用d不適用Rpi-oka2TGl86Rpi-okal17不適用d不適用TG35Rpi-okal11HhaI8U282757Rpi-mcql14Xhol6U296361Rpi-mcql13HincII3TG591Rpi-mcql14HaeIII7U279465_Rpi-mcql_9_不適用不適用aPCR顯示對標(biāo)記呈陽性的池的數(shù)目b導(dǎo)致抗性等位基因和易感等位基因之間出現(xiàn)多態(tài)性的限制酶c用特定酶消化后對標(biāo)記呈陽性的池的數(shù)目d由于標(biāo)記系排斥連鎖或者在抗性和易感等位基因之間無多態(tài)性而不適用從K39文庫隨機(jī)選擇了一些對標(biāo)記TG551、TG35或okaNBSHae呈陽性的池，TG551、TG35是與Rpi-okal或Rpi_oka2緊密連鎖的標(biāo)記，而okaNBSHae與Rpi-okal或Rpi_oka2共分離。將每一個所述BAC文庫的原始384孔板復(fù)制到固體LB培養(yǎng)基上。從每個板上按行和列刮取菌落，并以相關(guān)標(biāo)記的存在為準(zhǔn)加以篩選。從384孔板選取單個克隆。在選取單個克隆之后，分離BACDNA,并對BAC末端進(jìn)行測序。BLAST同源搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)顯示，在來自K39文庫的克隆中，有兩個克隆(K39_272N11和K39_256M23)的BAC末端序列彼此之間高度相似而且與番茄花葉病毒R基因Tm-22(Lanfermeijer等2003)極為近似。根據(jù)所得的每個BAC末端序列設(shè)計PCR引物，并利用它們從Rpi-okal和Rpi-oka2親本基因型擴(kuò)增產(chǎn)物。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并分析它們中是否存在這樣的SNP，使得這些PCR產(chǎn)物可以用作各自群體內(nèi)的標(biāo)記。將轉(zhuǎn)換成功的標(biāo)記置于Rpi-okal(1213個體)和Rpi-oka2(1706個體)的高分辨率遺傳圖譜上。這些標(biāo)記相對于Rpi-okal和Rpi_oka2的位置如圖6所示。Rpi-okal的高分辨率作圖和克隆從由1214個個體組成的Rpi-okal群體Soka014中篩選SokaM2.9L和TG186兩種標(biāo)記的重組體?？偣茶b定了169個重組體，覆蓋14cM的遺傳間隔。對這些用于疾病表型的重組體的最初篩選表明，抗性座位定位于標(biāo)記TG35的南部(south)。因此，從較大的重組體亞系列中選擇了一個包含53個標(biāo)記TG35和TG186之間的重組體的亞系列。對這些重組體篩選對致病疫霉的抗性或易感性，并使用根據(jù)BAC末端序列開發(fā)的標(biāo)記進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，Rpi-okal位于一個以標(biāo)記TG35和185L21R(BAC末端標(biāo)記)為邊界的0.33cM的遺傳間隔內(nèi)(圖5、6)。參考由PCR構(gòu)建的物理圖和對來自K39文庫的BAC克隆的指紋圖譜分析(圖5)，預(yù)測Rpi-okal存在于被BAC克隆K39_148P20和Κ39_266Ι9覆蓋的物理區(qū)域中。對這兩個BAC克隆進(jìn)行測序，為Rpi-okal鑒定了一個候選0RF。Rpi_oka2的高分辨率作圖和克隆為了構(gòu)建高分辨率圖，我們使用兩個側(cè)翼的基于PCR的標(biāo)記(TG551和T1421；圖la)來篩選一個大(expanded)群體，以選擇抗性座位周圍的重組體。從具有1706種基因型的大群體選擇了46個重組體，它們代表了兩個PCR標(biāo)記之間2.9cM的間隔。確定了這些重組體對晚疫病抗性的表型，并使用來自所述BAC重疊群的BAC末端標(biāo)記確定了它們的基因型。結(jié)果表明，Rpi_oka2位于以BAC末端標(biāo)記266I9F和185L21R為邊界的0.12cM的遺傳間隔內(nèi)(圖5、6)。參考由PCR構(gòu)建的物理圖和對來自K39文庫的BAC克隆的指紋圖譜分析(圖5)，預(yù)測Rpi-oka2存在于為Rpi-okal鑒定的同一物理區(qū)域中。然而，除了BAC克隆K39_272N11(它的一個末端包含Tm22同源的一部分)之外，在文庫中不能鑒定出覆蓋與Rpi-okal相同的物理區(qū)域的克隆(圖5)。作為另一種備選方法，使用為了擴(kuò)增完整的Rpi-okalORF而設(shè)計的引物與來自Rpi_oka2群體的親本植物的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。將所得的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-TEasy內(nèi)，對4個克隆進(jìn)行測序，以獲得Rpi-oka2候選物的共有序列(consenussequence)。Rpi-nrsl的高分辨率作圖為了構(gòu)建高分辨率圖，我們使用3個側(cè)翼基于PCR的標(biāo)記(Sne0M2.9a,TG551和TP25；圖3)篩選大群體(expandedpopulation)，并選擇Rpi-nrsl抗性座位周圍的重組體。TP25是從AFLP標(biāo)記P13M34_370[R]轉(zhuǎn)換得到的。來自具有1402種基因型的擴(kuò)展群體最初選擇了323個重組體，產(chǎn)生了一個Sne0M2.9a和TP25之間的遺傳距離23cM的間隔。同時，開發(fā)了更靠近Rpi-nrsl的PCR標(biāo)記(U317500和U270442)。結(jié)果選擇了40個重組體，并確定了這些重組體對晚疫病的抗性表型。名為okaNBSHae的RGA標(biāo)記被圖定于與Rpi-nrsl相同的遺傳位置，并從來自K39BAC文庫的Rpi-okal/2重疊群開發(fā)了數(shù)個基于BAC末端序列的PCR標(biāo)記，它們允許構(gòu)建Rpi-nrsl周圍的精細(xì)尺度的遺傳圖。此外，用三種不同的分離株測試這些重組體的抗性，結(jié)果表型以不同的方式分離，這表明在該群體中存在多個基因。第二個基因指定的Rpi-nrslb被預(yù)期位于Rpi-nrsla的南部(south)(圖6)。Rpi-okal,Rpi_oka2和Rpi_oka3的分析Rpi-okalORF長度為2673bp，并被翻譯成一個891個氨基酸的蛋白序列，計算分子量為102kDa，pi為8.05。Rpi_oka2ORF包括2715bp，并翻譯成一個905個氨基酸的蛋白序列，計算分子量為103.6kDa,pi為8.16。從含有Rpi-oka3的材料擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的序列與Rpi-oka2的相同。Rpi-okal蛋白包含卷曲螺旋核苷酸結(jié)合區(qū)-富亮氨酸重復(fù)(CC-NB-LRR)類抗性蛋白的全部特征。在蛋白N端部分最先215個氨基酸內(nèi)有4個區(qū)域，每一個區(qū)域都具有3個預(yù)測的七肽重復(fù)基序，這種基序是卷曲螺旋域的典型特征(圖7)。所有的NB-ARC域(vanderBiezen和Jones1998)均位于氨基酸序列216-505內(nèi)。NB-ARC域之后是一個包含一系列15個不規(guī)則LRR基序的區(qū)域，它們可根據(jù)共有序列進(jìn)行比對LxxLxxLxxLxLxxC/N/Sx(χ)LxxLPxx(其中L可以是L、I、M、V、Y或F，χ任意氨基酸)(McHaleetal.2006)。Rpi-oka2序列與Rpi-okal不同之處在于在基因5’端插入了42個核苷酸(圖7)。結(jié)果得到的存在于Rpi-oka2相應(yīng)區(qū)域中的額外14個氨基酸不影響任何預(yù)測的卷曲螺旋域。在Rpi-okal和Rpi-oka2之間還存在3個單核苷酸多態(tài)性(SNP)；A1501T,T1767C和G2117A(圖7)。這些核苷酸差異導(dǎo)致Rpi-okal和Rpi-oka2之間2個氨基酸的不同(圖7)。501位的差異位于NB-ARC域的末端，恰好在LRR區(qū)之前，導(dǎo)致Rpi-okal中的天冬氨酸變?yōu)镽pi-oka2中的酪氨酸。這個氨基酸變化不影響任何已表征的NB-ARC域。在第九個LRR中的706位置，Rpi-okal中的精氨酸在Rpi-oka2中變成賴氨酸；這兩個殘基都是帶正電荷的極性氨基酸，因此可被看作是同義改變。Rpi-okal和Rpi_oka2在核酸水平上與Tm_22分別有80.9%和79.7%的同一度。在氨基酸水平上，這相當(dāng)于72.和71.的同一度。如所預(yù)期的，考慮到LRR域在識別特異性中的作用，在LRR域中相似性百分比最低，Rpi-okal/2和Tm_22僅有57.5%的相似性。與之形成對照的是，Rpi-okal/2和Tm-22在整個卷曲螺旋和NB-ARC域內(nèi)的序列相似性為81.8%和79.7%；在NA-ARC區(qū)保守域內(nèi)，Tm-22和Rpi-okal僅相差1個氨基酸。使用引物okallong-F和okallong-R(表2)從含有Rpi_oka3的親本材料擴(kuò)增出Rpi-okal同源序列。將所得的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T中，并測序。所得序列與Rpi_oka2相同。從易感性S.okadae親本A613不可能擴(kuò)增出全長的Rpi-okal側(cè)向同源物(paralogues)。這個觀察結(jié)果與okaNBSHae標(biāo)記僅能從抗性基因型擴(kuò)增出來的事實(shí)共同提示導(dǎo)致易感表型的原因是Rpi-okal的缺失，而非無功能的拷貝。Rpi-okal也存在于抗性S.neorossii基因型中，并是Rpi_phul的直向同源物。在來自于S.neorossiiCGN1800批的抗性個體的分離群體中對Rpi基因作圖，也顯示在已鑒定基因(Rpi-nrsl)和標(biāo)記TG551之間有緊密連鎖，表明該基因位于和Rpi-okal相同的區(qū)域。類似地，有報道稱來自S.phureja的Rpi-phul也被圖定在該區(qū)域(Sliwka等2006)。在一個對Rpi-phul分離的149株馬鈴薯群體中，Rpi-okal標(biāo)記okaNBSHae-F/R與抗性共分離。從3個含有Rpi-phul的抗性基因型的DNA擴(kuò)增全長Rpi-okal側(cè)向同源物。得到了單個產(chǎn)物，測序顯示其與Rpi-okal相同。類似地，對抗性S.neorossii材料進(jìn)行的擴(kuò)增顯示，Rpi-oka2存在于該材料中，并且在40個預(yù)先選擇的重組體中，該基因的存在與抗性相關(guān)。含有Rpi-nrsl或Rpi-phul抗性的植物材料也顯示對本研究使用的所有致病疫霉分離株(ECl除外)有抗性。因此我們得出結(jié)論:Rpi-okal=Rpi-phul；且Rpi-oka2=Rpi_oka3=Rpi-nrsl。表lb12批Solanumokadae和4批S.neorossii對致病疫霉的反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>Ι551F:CATATCCTGGAGGTGTTATGAATGC60MwolTaq\TaqlTaqlR:CATATCCTGGAGGTGTTATGAATGCTG35F:CACXiGAGACrAAGATTCAGG55HhalAlulTsp509lR:TAAAGGTGATGCTQATGC3GGT1421F:CATCAATTGATCCXTTTGGACX60BsllRsaIRCTGCATCAGCnuriOCTCTGCTC186RAATCGTGCAGnTCAGCATAAGCG60Dral[R]R:TGCrrOCAGITGOGTGGGATTC'115429F:CATATnGGTGACXjOCTACAG55MselR:GGAGACA1TGTCACAAGGTl190RGTTCGCGTIUrCGTTACrGG55asR;GTIXjCATGGTrGACATCAGGTG591AF:CKjCAAATCTACITOTGCAAG60asRCTGGTGGATTGAGAAATCCCd<aNBSHaeP.'CrTACTTTCCCTTCCTCATCCTCAG60asasMeeIIIasR:TGAAGTCATCnXXAGACCGATGokallongF:AGTTATACAaDCrACATTCTACrCG60asasasasRCrrrGAAAAGAGGCTTCATACTOOC26619FF:GTATCTnTGAGTTAGTCTIOC55Hinfir:TATAATACJGTGTTCTTXjggg266I9RF:AAGGTOTTGGGAGTTTTTAG55HindlUHindlllR:TATCTTOCTCATnTGGTGC185L21RF:GATTGAGACAATGCTAGTOC55BsllRsalRAGAAGCAGTCAATAGTCATTG148P20RF:AAGATIXJITTTTOCTXXTTAG58HpyCH4IV_R:AAAGATGAAGTAGAGinTGG___a限制酶表示該標(biāo)記是CAPS標(biāo)記，即指示等位基因特異標(biāo)記，[R]指示該標(biāo)記以互斥相(impulsionphase)連鎖，SSR指示該標(biāo)記是簡單序列重復(fù)標(biāo)記，空白指示該標(biāo)記沒有多態(tài)性或者未針對Rpi基因進(jìn)行檢測。表3S.okadae內(nèi)的雜交及它們的后代中晚疫病抗病(R)和敏感(S)分離體<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>3植物標(biāo)識號后面是其保藏批號(accessionnumber)及對致病疫霉接種的反應(yīng)CGN荷蘭遺傳資源中心；BGRC，Braunschweig遺傳資源中心。b顯示抗性(R)或敏感(S)表型的植物數(shù)目實(shí)施例3使用候選基因/等位基因發(fā)掘方法對Rpi-okal和RPI-nrsl進(jìn)行作圖和克隆迄今為止，R基因的克隆典型地是通過定位克隆策略實(shí)現(xiàn)的。一旦從特定R座位克隆了功能基因，就可以嘗試從相同或不同物種克隆功能等位基因，以確定給定座位的等位基因頻率和等位變異。這里我們證明，NBS譜分析(profiling)(Linden等，2004)與集群分離分析法(bulkedsegregantanalysis)(BSA)(Michelmore等，1991)的組合是一種強(qiáng)有力的工具，用來產(chǎn)生能夠預(yù)測所研究R座位位置的候選基因標(biāo)記，同時在此過程中為通過功能等位基因發(fā)掘策略克隆基因提供了出發(fā)點(diǎn)。植物材料從荷蘭Wageningen的遺傳資源中心(CGN)獲取多個批次的Solanumokadae禾口Solanumneorossii.用致病疫霉篩選之后，使用來自特定批次的抗性基因型制作種間或種內(nèi)作圖群體。Rpi-okal作圖群體7698通過使0KA7014-9(0KA367-1和0KA366-8之間雜交而得到的抗性Fl代植物，0KA367-1和0KA366-8兩者均來自CGN18108批次)與易感植物NRS735-2(CGN18280)雜交而產(chǎn)生。全部的S.okadae基因型均來自批次CGN18108。Rpi_nrsl作圖群體7663通過使抗性植物NRS365-1(CGN18000)與NRS735-2雜交產(chǎn)生。疾病測定茄屬物種的離體葉片測定(DLA)按照Vleeshouwers等(1999)的敘述進(jìn)行。葉子在背軸側(cè)用10μ1的接種體液滴(5χ104個游動孢子/ml)接種，并在16h/8h白天/黑夜光周期的氣候箱中15°C溫育6天。接種6天后，將顯示孢子形成的葉子評價為易感性，而未顯示癥狀或壞死斑的葉片評價為抗性。標(biāo)記開發(fā)從茄科(Solanaceae)基因組網(wǎng)絡(luò)(SolanaceaeGenomicsNetwork)(SGN)數(shù)據(jù)庫選擇合適染色體位置的標(biāo)記，然后把它們開發(fā)成各個相關(guān)作圖群體中的多態(tài)性標(biāo)記。通過vanderLinden等(2004)介紹的NBS譜分析法開發(fā)了其它的候選基因標(biāo)記。通過用限制酶MSeI、HaeIII、AluI、RSaI或TaqI限制性消化基因組DNA產(chǎn)生模板。將限制片段連接上銜接頭(adapter)。通過根據(jù)NBS域的保守域(P-環(huán)、激酶_2和GLPL基序(Calenge，2005；Syed,2006)設(shè)計的放射性標(biāo)記引物(nbsl，nbs2，nbs3，nbs5a6或nbs9)產(chǎn)生PCR片段。候選R基因的PCR擴(kuò)增用Taq聚合酶或PfuTurbo聚合酶進(jìn)行長程PCR(LongrangePCR)制備50μ1反應(yīng)混合物，其包含50nggDNAUu1正向引物(10μΜ)、1μ1反向引物(10μΜ)、0·8μ1dNTP(每種5mM)、5μ1IOX緩沖液、5單位Taq聚合酶(PerkinElmer)或1μ1pfuTurbo(Invitrogen)。使用如下的PCR程序94°C3min、94°C30sec、55°C30sec、72°C4mins、72°C5min，29個循環(huán)。基因組步移通過克隆側(cè)翼DNA片段來延伸標(biāo)記序列。克隆利用ClonTech基因組步移試劑盒根據(jù)制造商的使用說明來進(jìn)行，使用包含如下互補(bǔ)序列的平末端銜接子(bluntadapter)5-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGA-3和5，-P04TCCAGCCC,以及銜接子特異引物APl(5，-TAATACGACTCACTATAGGGC)和AP2(5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT)。進(jìn)行同時限制酶切-連接(simultaneousrestriction-ligation)反應(yīng)，然后進(jìn)行2輪PCR。制備50μ1限制酶切-連接(RL)混合物，其含有250ng基因組DNA、5單位平末端切割酶(Bshl236I、Alul、DpnI,HaeIII,RsaI,HincII,DraI,Seal、HpaI或SspI)，1μ1基因組步移銜接子(25μΜ)UOmMATP、10μ15ΧRL緩沖液、1單位Τ4DNA連接酶(InvitrogenIU/μ1)。將消化混合物在37°C溫育3小時。樣品在PCR之前稀釋50倍。對于第一輪PCR，制備20μ1反應(yīng)混合物，其含有5μ1稀釋的RLDNA、0.6y1特異性正向引物1(10μΜ)、0.6μ1API(10μΜ),0.8μ1dNTP(每種5πιΜ)、2μ110Χ緩沖液(PerkinElmer)、5單位Taq聚合酶(PerkinElmer)。第一次PCR使用如下的循環(huán)程序94°C30sec作為變性步驟、56°C30sec作為退火步驟、72°C60sec作為延伸步驟。執(zhí)行35個循環(huán)。第二次PCR與第一次的條件相同，使用特異引物2和AP2，以及5μ150倍稀釋的第一次PCR的產(chǎn)物。取5μ1第二次PCR產(chǎn)物在凝膠(1%瓊脂糖)上檢查，將最大的擴(kuò)增子從Promega克隆到pGEM-TEasy載體中，并測序。用Gateway法將候選R基因克隆到雙元表達(dá)載體中根據(jù)制造商的說明使用Gateway克隆技術(shù)高效地將候選基因與合適的啟動子和終止子序列一起克隆到雙元Gateway載體pKGW-MGW中。在質(zhì)粒pKGW中，gateway盒子被交換為pDESTr4r3擴(kuò)增的多元gateway盒子，產(chǎn)生pKGW-MGW。在本研究中，我們使用Rpi-blb3(Lokossou等，論文準(zhǔn)備中)的啟動子和終止子，它們被分別克隆到GatewaypDONR載體PD0NRP4P1R和pD0NRP2RP3中，產(chǎn)生pENTR_Blb3P和pENTR_Blb3T。將用PfuTurbo聚合酶產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增子克隆到pD0NR221中，產(chǎn)生pENTR-RGH克隆，隨后利用多重Gateway克隆試劑盒(Invitrogen)將其與Rpi_blb3啟動子和終止子片段一起克隆到pKGW-MGW中。通過過夜進(jìn)行BP反應(yīng)II產(chǎn)生pENTR。(http//www.unterRasser.com/lab/protocols/bpRatewayreactioniivl0.shtml)。通過用5μ1BP反應(yīng)II混合物熱激轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)。細(xì)胞在含有50mg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。通過菌落PCR檢查菌落中是否存在相關(guān)的插入。從大腸桿菌(E.coli)提取出合適的PENTR克隆的DNA，用它來進(jìn)行多重GatewayLR克隆反應(yīng)，以產(chǎn)生最終的雙元表達(dá)克隆(http//www.untergasser.com/lab/protocols/lr_multiple_gateway_reaction_vl_0.shtml)。用5μ1BP反應(yīng)II混合物熱激轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)。細(xì)胞在含有50mg/ml壯觀霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。通過PCR對克隆進(jìn)行檢查，考察是否存在正確插入。將陽性克隆在補(bǔ)充有100mg/ml大觀霉素的LB培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)。通過電穿孔將最終的表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到土壤桿菌菌株C0R308中。在補(bǔ)充有100mg/ml大觀霉素和12.5mg/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)基上30°C過夜篩選克隆。測序?qū)τ肨aq聚合酶(PerkinElmer)或PfuTurbo聚合酶(Invitrogen)產(chǎn)生的克隆片段或PCR產(chǎn)物測序如下用5μ1PCR產(chǎn)物或5ng質(zhì)粒、3μ1緩沖液、1μIDETT(Amersham)和1μ1正向或反向引物制備10μ1測序反應(yīng)混合物。所用的PCR程序如下25個循環(huán)的940C20sec、50°C15sec、60°Clmin。序列用ABI3730XL測序儀生成。結(jié)果S.okadae和S.neorossii批次中晚疫病抗性的遺傳基礎(chǔ)和譜為了確定S.okadae和S.neorossii中晚疫病抗性的遺傳基礎(chǔ)，用復(fù)合(complex)致病疫霉分離株IPO-C進(jìn)行離體葉片測定(DLA)，分別對14和5個批次進(jìn)行篩選。分別利用選自oka批次CGN18108和nrs批次CGN18000的抗性基因型產(chǎn)生S.okadae和S.neorossii作圖群體7698[oka7014_9(oka367-lxoka366_8)xnrs735_2)和7663(nrs365-lxnrs735-2)。用群體7698的50個Fl子代植株進(jìn)行DLA之后，有30個被評價為抗性，22個被評價為易感，提示存在一個單一的顯性R基因，我們將其命名為Rpi-okal。在從群體7663選擇的60個Fl子代植物中，有24個被評價為抗性，36個評價為易感，提示nrs365-l也含有一個單一的顯性R基因，我們將其命名為Rpi_nrsl。通過用數(shù)種具有不同復(fù)雜性(complexity)和侵襲性(aggressiveness)的分離株(表4)進(jìn)行刺激，分析這兩個基因的抗性譜。Rpi-okal和Rpi-nrsl似乎具有相同的特異性。菌株ECl是唯一能夠同時克服這兩種R基因的菌株。Rpi-okal和Rpi-nrsl在染色體IX上的作圖為了確定在群體7698中分離的Rpi-okal基因是否在染色體IX上，我們嘗試在群體7698的最初50個Fl子代植株中開發(fā)并定位染色體IX特異標(biāo)記TG35、TG551、TG186、CT183和T1421。發(fā)現(xiàn)僅有TG35和TG186在親代基因型之間具有多態(tài)性，而且它們確實(shí)與Rpi-okal連鎖(圖9)。在嘗試開發(fā)額外的Rpi-okal標(biāo)記以及Rpi-nrsl標(biāo)記時，我們在兩個作圖群體中進(jìn)行了集群分離分析(BSA)并結(jié)合進(jìn)行了NBS譜分析。結(jié)果在7698中為Rpi-okal鑒定了9個集群特異標(biāo)記(bulkspecificmarker)，在7663中為Rpi-nrsl鑒定了8個集群特異標(biāo)記。最后，在7698和7663群體最初的50和60個Fl子代植物中，只有兩個集群特異片段分別與抗性發(fā)生了共分離，其中一個是用NBS2/RsaI引物-酶組合產(chǎn)生的，另一個是用NBS3/HaeIII產(chǎn)生的。因此，克隆這些片段并進(jìn)行了測序。當(dāng)進(jìn)行BLAST分析時，兩個片段均顯示與番茄染色體IX上的Tm-22基因高度相似(Lanfermeijer等，2003；2005)。所克隆的NBS2/RsaI和NBS3/HaeIII片段的大小為350和115bp，與Tm-22具有88.3%和80.3%的DNA序列同一性。這些發(fā)現(xiàn)提示，Rpi-nrsl在染色體IX上定位的區(qū)域可能與Rpi-okal相同。為了確認(rèn)這一點(diǎn)，針對每個片段設(shè)計了特異的引物，并利用它們在Rpi-okal作圖群體和Rpi-nrsl作圖群體二者中開發(fā)SCAR標(biāo)記。這樣，分別為群體7663和7698開發(fā)了兩個NBS譜分析衍生標(biāo)記NBS3A和NBS3B。隨后，在Rpi_nrsl作圖群體7698中確定了這些標(biāo)記相對于Rpi-nrsl及染色體IX特異標(biāo)記TG35和TG551的位置。TG35、TG551和NBS3B在60個個體的最初Fl群體中與Rpi-nrsl共分離，證明Rpi-nrsl在染色體IX上定位的區(qū)域確實(shí)與Rpi-okal相同(圖9)。為了開發(fā)用于重組分析的側(cè)翼標(biāo)記(flankingmarker)，從SGN選擇了與TG35或TG551連鎖的標(biāo)記，并在這兩個群體中對它們加以篩選。盡管多態(tài)性水平較低，但開發(fā)了基于EST的標(biāo)記U276927和U270442I，并分別在群體7698和7663中進(jìn)行了作圖(表4和圖9)。U276927被圖定在Rpi-okal北側(cè)2cM處，而U270442I被圖定在Rpi-nrsl南側(cè)3.5cM處。隨后，分別使用側(cè)翼標(biāo)記U276927/TG186和NBS3B/U270442在群體7663的后代群體7698和1005的500個后代中進(jìn)行重組分析。結(jié)果，Rpi-okal和Rpi-nrsl分別被圖定在4cM和3.6cM的遺傳間隔之內(nèi)(圖9)在S.okadae和S.neorossi中進(jìn)行基于Tm_22的等位基因發(fā)掘本發(fā)明人采用基于同源性的等位基因發(fā)掘策略來克隆Rpi-okal和Rpi-nrsl。第一個步驟是設(shè)計這樣的簡并引物，它們帶有位于Rpi-okal和Rpi-nrsl座位上候選Tm-2基因同源體(Tm2GH)的推定起始和終止密碼子。根據(jù)公共序列數(shù)據(jù)庫中所有可得的馬鈴薯和番茄來源的類Tm-22序列的比對結(jié)果，我們設(shè)計了引物ATG-Tm2-F和TGA-Tm2-R(表5)。然而，當(dāng)針對兩個作圖群體的親本基因型用該引物系列進(jìn)行測試時，沒有產(chǎn)生預(yù)期大小的擴(kuò)增子。因?yàn)锳TG-Tm2-F引物序列存在于共分離的來源于NBS譜分析的標(biāo)記序列內(nèi)，所以在原來的TGA-Tm2-R引物上游IOObp處(該區(qū)域在所有被比對的類Tm_22序列中是保守的)設(shè)計了三個新的反向引物(REV-A、-B和-C)。當(dāng)與ATG-Tm2-F或NBS3B-F組合時，僅從抗性親本基因型，即oka7014-9和nrs365-l，特異擴(kuò)增出了一個單一的大約2.5kb擴(kuò)增子。將這些片段克隆到pGEM-TEasy載體中，并用引物步移策略對來自每個基因型的大約96個單個克隆進(jìn)行了測序。得到所有的序列都與Tm-22具有75-80%的相似度。在來源于oka7014-9的序列中可以區(qū)分出總共5種不同的類型，而nrs365-l序列僅能分成3個不同的類型。隨后，根據(jù)與NBS3B序列的同源性程度將這些不同的類型命名為NBS3B樣或非NBS3B樣(表6)。為了恢復(fù)(retrieve)所擴(kuò)增的Tm2GH中丟失的C端部分，我們用引物GSP1-1、GSP1-2和GSP2(表5)進(jìn)行3，-基因組步移，這些引物在REV-A、-B和-C引物的大約IOObp上游設(shè)計，以便在所克隆的類NBS3B序列和用基因組步移產(chǎn)生的克隆之間產(chǎn)生IOObp的重疊。從oka7014-9獲得了3個200bp的擴(kuò)增子，從nrs365_l獲得了一個Ikb的擴(kuò)增子。在克隆、測序和與已克隆的Tm2GH比對之后，全部4個克隆似乎均與克隆Tm2GH-nrS8biS匹配，因?yàn)橹丿B的IOObp是精確匹配的。為了能夠隨后從Rpi-okal和Rpi-nrsl座位擴(kuò)增全長Tm2GH，我們根據(jù)全長Tm2GH-nrS8biS序列與來自番茄的Tm22序列的比對(圖2)，設(shè)計了新的反向引物(TAA-8bis-R)(表5)。由于原始的TGA終止密碼子不存在于Tm2GH-nrS8biS序列中，我們包含了下游12bp的下一個框內(nèi)終止密碼子(TAA)(in-framestop-codon)。隨后用高保真PfuTurbo聚合酶和引物ATG-Tm2_F和TAA_8bis_R，從oka7014_9和nrs365-l進(jìn)行Tm2GH全長擴(kuò)增。將2.6kb的擴(kuò)增子克隆到pGEM-TEasy載體中并測序。從0KA7014-9獲得了三種不同類型的克隆，其中一個具有預(yù)期大小的0RF(Tm2GH-okalbis)。從NRS365-1獲得的全部克隆均彼此相同，并且也包含預(yù)期的0RF。選擇克隆Tm2GH-nrsl.9，與Tm2GH_okalbis—起用于進(jìn)一步的遺傳分析。在以Tm2GH-0kalbiS和Tm2GH-nrSl.9作為目標(biāo)進(jìn)行互補(bǔ)分析之前，我們需要確認(rèn)所選的Tm2GH確實(shí)圖定在Rpi-okal和Rpi-nrsl座位上。當(dāng)在最初的作圖群體中作為SCAR標(biāo)記進(jìn)行測試時，這兩個標(biāo)記均與抗性共分離。在限定Rpi-okal和Rpi-nrsl座位的重組體的集合中擴(kuò)增ATG-Tm2-F和TAA_8bis-R時，確實(shí)僅從晚疫病抗性重組體中產(chǎn)生了具有預(yù)期大小的擴(kuò)增子，這證明上述兩種Tm2GA均確實(shí)是Rpi-okal和Rpi-nrsl的良好候選。然而，有抗性重組體沒有給出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，在Rpi-okal作圖群體中有2個，在Rpi-nrsl作圖群體中有1個，提示兩個座位可能實(shí)際上都含有由兩個功能R基因構(gòu)成的串聯(lián)。Rpi-okal禾口Rpi—nrslORF的分析Rpi-okal和Rpi-nrsl的基因結(jié)構(gòu)通過比較擴(kuò)增子序列與通過cDNA末端5，快速擴(kuò)增(RACE)產(chǎn)生的cDNA片段，確定了Rpi-okal和Rpi-nrsl的5’端結(jié)構(gòu)。RACE鑒定了包括83個核苷酸(nt)(對于Rpi-okal)禾口5nt(對于Rpi-nrsl)的5’-非翻譯區(qū)的5’Rpi_okal和Rpi-nrsl特異cDNA片段。兩個基因都沒有內(nèi)含子。Rpi-okal和Rpi-nrsl的開放閱讀框分別編碼891個和905個氨基酸的預(yù)測肽。除了在Rpi-nrsl的N端區(qū)域內(nèi)的14個氨基酸插入之外，Rpi-okal和Rpi-nrsl之間僅有2個其它的氨基酸差異。在548和753位，Rpi-okal具有天冬酰胺和精氨酸殘基，而Rpi-nrsl的相應(yīng)殘基分別是酪氨酸和賴氨酸(圖8)。然而，被替換的殘基具有相同的性質(zhì)。天冬酰胺和酪氨酸屬于疏水殘基族，而精氨酸和賴氨酸是帶正電荷殘基。兩個基因的蛋白序列均具有CC-NBS-LRR類R蛋白的數(shù)個保守基序(圖8)。所述蛋白的N端部分存在一個卷曲螺旋(CC)域，對于Rpi-okal而言在氨基酸1-183之間，對于Rpi-nrsl而言在1-198之間。在最初的183或198個殘基中，在Rpi-okal和Rpi-nrsl序列中分別可以找出4對推定的由疏水殘基構(gòu)成的七聯(lián)體基序。在殘基183或198與472或486之間的氨基酸序列段中分別可以識別出一個NB-ARC(核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，細(xì)胞凋亡，R基因產(chǎn)物，CED-4)域(Ploop，Kinase-2，GLPL)(VanderBierzen禾口Jones1998)。Rpi—okal禾口Rpi—nrsl的C端的一半包括一系列大小不規(guī)則的15LRR基序，它們可以依照共有序列LxxLxxLxxLxLxxC/N/Sx(χ)LxxLPxx(其中χ是任何氨基酸)(McHale等.2006)比對。PR0SITE分析(Hofmann等.1999)鑒定了4個N-糖基化位點(diǎn)，7個酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，10個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，6個N-豆蔻?；稽c(diǎn)和1個Camp-和Cgmp-依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。在蛋白水平上，Rpi-okal和Rpi_nrsl與Tm_22蛋白序列具有75%的氨基酸同一性。有趣的是，發(fā)現(xiàn)同源性最低的地方是在LRR域內(nèi)，在那里Tm-22與Rpi-okal和Rpi-nrsl僅有62%的同一性。相比之下，Rpi-okal和Rpi-nrsl的卷曲螺旋和NB-ARC域與Tm_22的相同區(qū)域具有87%的氨基酸序列同一性。表4用于確定Rpi-okal和Rpi-nrsl特異性的致病疫霉分離株的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表5A.用于Rpi-okal和Rpi_nrsl作圖的標(biāo)記的概覽<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>a.s.等位基因特異(c)互引相(couplingphase)(r)互斥相(repulsingphase)表5b.用于根據(jù)NBS3B樣序列進(jìn)行基因組步移的引物，靶定Rpi_okal和Rpi-nrsl的起始和終止密碼子的引物和5’RACE引物的概覽<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表6.對從抗性親本S.neorossii(la)和S.okadae(lb)擴(kuò)增的Tm2同源物根據(jù)限制圖和NBS3B同源性(同時與兩個R座位緊密連鎖的標(biāo)記)所作的分類<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實(shí)施例4A在本氏煙(Nicotianabenthamiana)中瞬時互補(bǔ)取決于相關(guān)遺傳作圖研究的分辨率和候選基因家族的大小，等位基因發(fā)掘法可以產(chǎn)生許多候選基因，需要對它們的功能進(jìn)行分析。迄今為止，對于候選R基因同源物(RGH)的功能分析而言，需要穩(wěn)定轉(zhuǎn)化易感基因型用于互補(bǔ)的目的。這是一種耗時并且低效的方法，因?yàn)樽钌傩枰ㄙM(fèi)數(shù)個月時間方能產(chǎn)生可進(jìn)行功能分析的轉(zhuǎn)基因植物。在本研究中，但我們利用對本氏煙易感致病疫霉(盡管與前人的報道(參考文獻(xiàn)Kamoim等，1998)不同)的這一發(fā)現(xiàn)，開發(fā)了一種土壤桿菌瞬時互補(bǔ)測定法(ATCA)，用于檢測賦予針對致病疫霉的抗性的R基因。土壤桿菌瞬時轉(zhuǎn)化測定(ATTA)在煙草中進(jìn)行土壤桿菌瞬時轉(zhuǎn)化測定(ATTA),隨后用合適的致病疫霉分離群進(jìn)行離體葉片測定。用帶有推定的R基因候選物的土壤桿菌菌株C0R308(Hamilton等，1996)溶液浸潤(infiltrate)4周齡大小的植物。浸潤前2天，使土壤桿菌在含有四環(huán)素(12.5mg/ml)和大觀霉素或卡那霉素(分別為100mg/ml和50mg/ml)的LB培養(yǎng)基中30°C過夜生長。生長16小時后，測量OD1，并用χμ1LB培養(yǎng)物接種50mlYEB培養(yǎng)基，隨后在30°C過夜生長，以便下一天的0D2達(dá)到0.8[χ=z/0Dl,z=80000(2(Δ"2)]。翌日，將45mlYEB培養(yǎng)物在4000rpm離心8min。將離心沉淀用含有l(wèi)ml/L乙酰丁香酮(acetosyringone)WymlMMA重懸浮。Y=22x0D2，從而可以將不同的培養(yǎng)物標(biāo)準(zhǔn)化為0D32.0。將每個重懸的離心沉淀在室溫下溫育1小時。然后，用2ml注射器用0D4為0.1的MMA培養(yǎng)物浸潤葉片的下方一側(cè)。浸潤2天后,如上所述地進(jìn)行DLA。在接種后4-7天評估感染表型(抗性或易感)。離體葉片測定如Vleeshouwers等(1999)所述進(jìn)行，使用兩種致病疫霉分離株IPO-復(fù)合物，其對Rpi_okal、2和Rpi_nrsl均無毒力；和ECl分離株，其對所有三種基因均有毒力。將致病疫霉接種物以10μ1(5χ104個運(yùn)動孢子/ml)液滴接種在葉片的背軸側(cè)，并在16h/8h白天/黑夜的光周期氣候箱中在15°C溫育6天。在接種后6天，顯示芽孢形成的葉子評價為易感，而沒有顯示癥狀或壞死性損害的葉片評價為抗性。用兩種分離株各進(jìn)行3次獨(dú)立的瞬時互補(bǔ)測定，每次有三個重復(fù)。對于每一個重復(fù)，將從植株底部數(shù)起的第4，5和6片葉子用土壤桿菌浸潤，隨后用致病疫霉攻毒。用IPO-C接種5天后，瞬時表達(dá)候選Rpi-okal或Rpi-nrsl基因的葉片有60-70%顯示了典型的HR應(yīng)答，與瞬時表達(dá)功能性Rpi-stol基因的陽性對照植物一樣(Vleeshouwers等，2008)，盡管在后者中互補(bǔ)效率顯著更高(80-90%的被攻毒的葉片顯示了HR)。相比之下，表達(dá)abptGH-a——Rpi-abpt的一種非功能性側(cè)向同源物(Lokossou等，論文準(zhǔn)備中)——的葉片完全為易感性。在ECl的場合，所有經(jīng)土壤桿菌浸潤的葉片均是易感的，除了那些用Rpi-stol——它賦予ECl的抗性——浸潤過的葉片除外。這些數(shù)據(jù)與Rpi-okal和Rpi-nrsl的抗性譜一致，因此提示所述候選基因就是Rpi-okal禾口Rpi-nrsl。實(shí)施例4B通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)化底西瑞栽培種(cv.Desiree)的互補(bǔ)分析為了確認(rèn)在本氏煙中瞬時互補(bǔ)測定獲得的結(jié)果，通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將帶有Tm2GH_okalb和Tm2GH-okal.9的雙元Gateway構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到易感性的馬鈴薯底西瑞栽培種中。作為對照，我們還用構(gòu)建體PSLJ21152轉(zhuǎn)化了底西瑞栽培種，pSLJ21152是一種帶有攜帶假定Rpi-okal啟動子、ORF和終止子序列的4.3kb片段的雙元構(gòu)建體(見實(shí)施例6)。對具有目的轉(zhuǎn)基因的原代轉(zhuǎn)化體(primarytransformants)進(jìn)行離體葉片測定，測試其對致病疫霉的抗性。令人驚訝的是，只有攜帶4.3kbRpi-okal片段的遺傳構(gòu)建體能夠補(bǔ)全易感表型；9個原代轉(zhuǎn)化體中有8個是抗性的。含有原代轉(zhuǎn)化體的22個Tm2GH-okalb和17個Tm2GH-okal.9全部對致病疫霉易感。Tm2GH-okalb和Tm2GH-okal.9序列與4.4kbRpi-okal片段的比對顯示，在最初用作等位基因發(fā)掘?qū)嶒?yàn)基礎(chǔ)的起始密碼子的上游99nt處還存在一個合框的(in-frame)ATG起始密碼子。這個發(fā)現(xiàn)與用Tm2GH-okalb和Tm2GH-0kal.9獲得的陰性互補(bǔ)結(jié)果以及用4.3kbRpi-okal片段獲得的陽性互補(bǔ)結(jié)果一起提示，最5’側(cè)的那個起始密碼子是功能Rpi-okal和Rpi-nrslORF的真正起點(diǎn)。使用5’延伸的等位基因發(fā)掘產(chǎn)物進(jìn)行瞬時互補(bǔ)測定為了試圖分別從oka7014-9nrs365_l發(fā)掘出推定的全長Rpi-okal和Rpi-nrsl基因，用引物ATG2-Tm2F和TAA-8bR(表2)對兩種基因型的基因組DNA進(jìn)行了長程PCR。將具有預(yù)期大小的擴(kuò)增子克隆到pGEM-TEasy載體中并加以測序。從oka7014-9獲得的克隆全部相同，并且與PSLJ21152中的相應(yīng)序列相同(見實(shí)施例6)。從nrs365_l獲得的克隆也全部相同，但與從oka7014-9獲得的克隆相比，在5’延長區(qū)含有一個42nt的插入。隨后將兩個片段插入到Gateway雙元表達(dá)載體中Rpi_blb3基因的調(diào)節(jié)元件之間(Lokossou等，論文準(zhǔn)備中)，并以它們作為靶標(biāo)，結(jié)合原來的Tm2GH-okalb和Tm2GH-0kal.9構(gòu)建體及PSLJ21152一起在煙草中進(jìn)行瞬時互補(bǔ)測定。全長基因和4.3kb的Rpi-okal基因均顯示與陽性對照Rpi-stol相當(dāng)?shù)目剐运?80-90%的被攻毒的葉片顯示了HR應(yīng)答)，而較短的基因構(gòu)建體再次顯示顯著更低水平的抗性(60-70%HR)，表明來自oka7014-9和nrs365-l的全長擴(kuò)增子分別是Rpi-okal和Rpi-nrsl。實(shí)施例5-來自S.mochiquense的Rpi基因的鑒定、作圖和克隆在S.mochiguense中Rpi基因的圖定Rpi-mcqlRpi-mcql先前被粗略地圖定到染色體IX長臂的底部(Smilde等，2005)，但沒有公開精細(xì)的作圖和表征。除了一種在68個個體的群體中與Rpi-mcql共分離的標(biāo)記(TG328)之外，還開發(fā)了跨20cM距離的側(cè)翼標(biāo)記。為了精細(xì)地圖定Rpi-mcql，使用總共72個AFLP引物組合尋找更緊密連鎖的標(biāo)記。鑒定了一個多態(tài)性條帶P13M32_472，其圖定在該基因的南側(cè)(southernside)。根據(jù)番茄BAC克隆C09HBa0165P17的發(fā)布序列以及SGN數(shù)據(jù)庫中染色體IX的其它已知RFLP標(biāo)記開發(fā)了額外的5個CAPS標(biāo)記(表7)。這樣，將Rpi-mcql圖定在一個11.6cM的、側(cè)翼為標(biāo)記T0156和Sldll的區(qū)域中，并且它與CAPS標(biāo)記TG328，U286446,U296361和TG591共分離(圖10)。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>Rpi-mcql的高分辨率作圖和克隆BAC文庫篩選在K182文庫中，從9個池(表la)擴(kuò)增標(biāo)記U279456。該標(biāo)記是等位基因特異的，并且在K182中與易感單元型連鎖。其它三個標(biāo)記(U282757、U296361和TG591)是CAPS標(biāo)記，因此使用限制性消化來為已鑒定的BAC指定單元型。對這三個標(biāo)記的分析顯示，有3-7個BAC池所含的BAC克隆具有來自抗性單元型的標(biāo)記等位基因(表la，圖4d_4e)。Rpi-mcql的高分辨率作圖和克隆從K182文庫隨機(jī)選擇了8個對與Rpi-mcql緊密連鎖的標(biāo)記U282757、U296361、TG591或U279465呈陽性的BAC池。將每個BAC文庫的原始384孔板復(fù)制到固體LB培養(yǎng)基上。從每個板按行和列刮取菌落，并篩選相關(guān)標(biāo)記是否存在。從384孔板選擇了單克隆。從K182文庫選擇的克隆的一個BAC末端序列與基因Tm-22高度相似。此外，K182文庫中有2個BAC末端序列與在馬鈴薯(Solanumtuberosum)，山荊子(Malusbaccata)，香脂楊(Populusbalsamifera),(Populustrichocarpa),^^Wlf(Medicagotruncatula)禾口；(Lensculinaris)中鑒定的數(shù)種不同抗性蛋白相似。使用由2502個個體組成的大群體鑒定側(cè)翼標(biāo)記T0156和Sldll之間的重組體?？偣舶l(fā)現(xiàn)了163個重組體，用它們來分析共分離標(biāo)記TG328、U286446、U296361和TG591。結(jié)果，Rpi-mcql被圖定在染色體IX的一個0.32cM區(qū)域中，兩側(cè)是標(biāo)記U286446和9C23R(從BAC末端序列開發(fā)的標(biāo)記)，并且與標(biāo)記U272857和TG591共分離(圖10)。根據(jù)所述CAPS標(biāo)記的次序確定相應(yīng)的BAC克隆的次序，并使用它們構(gòu)建一個跨越9C23R-TG328的重疊群(圖11)。預(yù)期含有Rpi-mcql的區(qū)域被兩個從抗性單元型鑒定的重疊BAC克隆——9C23和43B09所覆蓋。對這兩個BAC克隆測序，并通過用Sau3AI部分消化把它們亞克隆到雙元粘粒載體pCLD04541中。BAC序列分析表明，它含有2個完整的ORF和2個不完整的0RF，與針對ToMV的Tm22抗性基因相似。所述2個完整的ORF被預(yù)測是Rpi-mcql的候選物，并鑒定了含有這兩個ORF的粘?？寺?Rpi-mcql.1和Rpi-mcql.2)，并通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化引入到易感馬鈴薯品種底西瑞、番茄栽培種Moneymaker和本氏煙中。Rpi-mealORF分析我們測序了兩個候選BAC克隆9C23和43B09。BAC克隆K182_43B09長度為103，863bp，并且已被完全測序。BAC克隆K182_9C23已被測序到3個重疊群K182_9C23_2699(62，389bp)、K182_9C23_2732(22，072bp)和K182_9C23_2737(10，119bp)。在對這些BAC序列之間進(jìn)行比對之后，發(fā)現(xiàn)K182_43B09含有K182_9C23_2737的全部，和K182_9C23_2732的大約一半，這指示了兩個BAC克隆的重疊區(qū)域。K182_9C23_2699被發(fā)現(xiàn)含有3個0RF，而K182_9C23_2732和K182_9C23_2737各自含有1個長度超過300bp的0RF。來自K182_9C23_2732和K182_9C23_2737的ORF與來自K182_43B09的第一個和第二個ORF相同。K182_9C23_2699的第一個ORF編碼一個推定的NAD依賴的差向異構(gòu)酶(與CAPS標(biāo)記U272857相同的基因)。第二個ORF編碼一個完全的CC-NBS-LRR型植物抗性基因蛋白，其與ToMV抗性基因Tm22高度相似，因此是Rpi-mcql的候選基因(Rpi-mcql.1)。第三個ORF編碼一個不完全的Tm22樣蛋白，其含有部分NBS基序和完全的LRR基序。另外從K182_43B09的序列出發(fā)預(yù)測了其它5個0RF。預(yù)測第一個和第三個ORF可能編碼指向RNA的DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白，第五個ORF編碼與CAPS標(biāo)記U296361相同的基因。它們均沒有被考慮作為Rpi-mcql候選物，因?yàn)檫@些蛋白與植物抗性基因功能無關(guān)。第二個和第四個ORF與抗性基因Tm22相似。第二個ORF編碼一個完整基因，其中出現(xiàn)了全部的CC、NB和LRR域；它被認(rèn)為是Rpi-mcql的第二個候選物(Rpi-mcql.2)。第四個ORF被預(yù)測編碼一個截短的蛋白，因?yàn)樵诘?10位氨基酸處具有提前終止密碼子。將Rpi-mcql的兩個候選基因亞克隆到雙元粘粒載體pCLD04541中。Rpi-mcql.1長度為2，589bp，并且被預(yù)測編碼一個862個氨基酸的CC-NB-LRR蛋白，其計算分子量為98.2kDa,pi為7.75。卷曲螺旋(CC)域位于該蛋白N端的氨基酸1-173的部分。在這最先的173個殘基中，可以識別出12個推定的由疏水殘基構(gòu)成的七聯(lián)體基序。在氨基酸序列173-478中存在一個含有所有已表征基序的NB-ARC域(vanderBiezen&Jones，1998)。LRR域存在于氨基酸序列479-862中，其包括一系列大小不規(guī)則的15個LRR基序，它們可以根據(jù)共有序列LxxLxxLxxLxLxxC/N/Sx(χ)LxxLPxx(其中χ是任意氨基酸)(McHale等，2006)比對。NB-ARC第5基序(第481-485位氨基酸)與LRR域的起點(diǎn)重疊。Rpi-mcql.2長度為2，571bp，預(yù)測它編碼一個856個氨基酸的CC-NBS-LRR蛋白，該蛋白的計算分子量為98.0kDa，pI為7.81。卷曲螺旋(CC)域位于該蛋白N端第1-170位氨基酸的部分。NB-ARC域位于氨基酸序列171-476中，并且包含全部已被表征的基序(vanderBiezen&Jones，1998)。LRR域位于氨基酸序列477-856中，其包括一系列大小不規(guī)則的15個LRR基序，它們可以根據(jù)共有序列LxxLxxLxxLxLxxC/N/Sx(χ)LxxLPxx(其中χ是任意氨基酸)(McHale等，2006)比對。NB-ARC第5基序與LRR域的起點(diǎn)重疊。Rpi-mcql.1和Rpi-mcql.2與Tm22蛋白在氨基酸水平上分別有大約77%和75%的同一性，二者彼此之間則有81%的同一性。實(shí)施例6將新抗性基因引入到對致病疫霉易感的馬鈴薯和番茄基因型中以及引入到本氏煙中n有在自身啟云力子禾招冬Ih子(iC^ga)^ffeHTa^iRpi-okai基因的雙元jH本使用引物okalIongF(5，-AGTTATACACCCTACATTCTACTCG-3，)和okallongR(5，-CTTTGAAAAGAGGCTTCATACTCCC-3，)通過PCR從BAC克隆K39_266I9擴(kuò)增攜帶Rpi-okal啟動子、開放閱讀框(ORF)和終止子的4.3kb片段(SEQ.ID.No.Ic)。將該片段克隆到pGEM-TEasy(Promega)中，并測序以確認(rèn)在PCR期間沒有引入錯誤。用EcoRI消化最終的質(zhì)粒，將含有原始基因的片段克隆到pBinl9的EcoRI位點(diǎn)。所得的質(zhì)粒被命名為pSLJ21152。將質(zhì)粒PSLJ21152引入到土壤桿菌菌株AGLl中。H有在自身啟云力子禾Π鄉(xiāng)冬Ih子(iC始基因)控泡丨之_下的RDi-mcal.1禾口Rpi-mcql.2基因的雙元載體通過用Sau3AI部分消化將BAC克隆K182_9C23和K182_43B09亞克隆到雙元粘粒載體PCLD04541的BamHI位點(diǎn)。用GigaPackGold(Stratagene)包裝重組粘粒載體，并引入到大腸桿菌DH5菌株中。使用引物TG591-F和TG591-R通過PCR從所得的克隆中篩選鑒定含有Rpi-mcql候選物的克隆，選擇陽性克隆用于末端測序。通過參考BAC克隆K182_9C23和K182_43B09的完全BAC序列，選出了攜帶兩個Rpi-mcql候選物的克隆?？寺SLJ21153攜帶Rpi-mcql.1的全序列，包括啟動子和終止子序列(SEQ.ID.No2c)。該克隆也含有一個額外的抗性基因同源物，其缺少卷曲螺旋域和部分的NBS域，因此推測是沒有功能的。為了確認(rèn)這一點(diǎn)，鑒定了另一個克隆，其命名為D5，含有這種截短的基因，而沒有Rpi-mcql.1。克隆PSLJ21148載有Rpi-mcql.2的完全序列，包括啟動子和終止子序列(SEQ.ID.No2d)。將帶有全長候選Rpi-mcql基因和截短基因的克隆引入到土壤桿菌菌株AGLl和LBA4404中。為了確保沒有發(fā)生質(zhì)粒重排，從所得的反式接合體(transconjugant)分離質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化回大腸桿菌菌株DHlO-β，消化后，與原始質(zhì)粒儲液的消化物進(jìn)行比較。馬鈴薯的轉(zhuǎn)化建立具有合適抗生素選擇域(selectionregime)的土壤桿菌培養(yǎng)物，在28°C震蕩培育24小時。從生長在MS培養(yǎng)基(2%蔗糖)上無菌培養(yǎng)的4-6周齡馬鈴薯底西瑞栽培種植株收集莖節(jié)間段切片(Steminternodesections)(不帶節(jié)點(diǎn))。將節(jié)間段切成Icm切片，并置于20mlLSR液體培養(yǎng)基中。向干節(jié)添加IOOul土壤桿菌過夜培養(yǎng)物，在24°C以40rpm黑暗溫育20分鐘。從土壤桿菌懸液取出莖切片，吸干，并在低光條件下在LSRl固體培養(yǎng)基上(每個盤上鋪布大約15-20個外植塊(eXplant))18°C溫育3天。然后將這些共培養(yǎng)的莖切片轉(zhuǎn)移到含有選擇抗生素的LSRl培養(yǎng)基上，每盤大約10個外植塊。每7-10天將莖切片亞培養(yǎng)到新鮮LSRl培養(yǎng)基上大約3-6周，或者直到出現(xiàn)第一個小愈傷組織。一旦愈傷組織充分發(fā)育后，便將莖切片轉(zhuǎn)移到含有選擇抗生素的LSR2培養(yǎng)基上。每7-10天將莖切片亞培養(yǎng)一次，直到開始發(fā)芽。芽在轉(zhuǎn)化開始后2個月內(nèi)出現(xiàn)。用鋒利的手術(shù)刀(sharpscalpel)將芽切下，并植入到含有選擇抗生素的MS2R固體培養(yǎng)基內(nèi)。具有合適抗生素或除草劑抗性基因的轉(zhuǎn)基因植物通常在2周內(nèi)開始生根，逐漸停止(weanoutof)組織培養(yǎng)物供應(yīng)，代之以無菌泥炭塊(peatblock)，然后移植到溫室中。培養(yǎng)基用于馬鈴薯植塊的MS培養(yǎng)基IXMS培養(yǎng)基2%蔴糖0.6%瓊脂糖100mg/L酪蛋白酸水解物pH5.7LSR液體培養(yǎng)基IXMS培養(yǎng)基3%蔴糖pH5.7LSRl培養(yǎng)基IXMS培養(yǎng)基3%蔴糖2.0mg/L—(zeatinriboside)0.2mg/lNAA0.02mg/LGA30.6%瓊脂糖pH5.7LSR2培養(yǎng)基IXMS培養(yǎng)基3%蔴糖2.Omg/L玉米素核苷0.02mg/lNAA0.02mg/LGA30.6%瓊脂糖pH5.7MS2RIXMS培養(yǎng)基2%蔴糖100mg/L肌醇2.Omg/L甘氨酸0.2%固化劑pH5.7培養(yǎng)基土壤桿菌抗生素T-DNA選擇抗生素菌株標(biāo)記/除草劑/LSRl/GV3101/頭孢噻肟nptll卡那霉素LSR2/LBA4404(Cefotaxime)/100mg/LMS2R沃格孟汀(Augmentin)250mg/LAgll泰門汀bar草丁磷(Timentin)(Phoshinothricin)320mg/L2.5mg/L番茄轉(zhuǎn)化將番茄種子在70%乙醇中表面滅菌2分鐘，以使凝膠狀的種皮松弛，然后用滅菌水沖洗一次。然后將種子在10%家用漂白水(例如Domestos/Vortex)溶液中震蕩滅菌3小時，并在滅菌水中清洗4次。將種子置于含有萌發(fā)培養(yǎng)基的盆中(20-30粒種子/盆)，并在培養(yǎng)室(16小時光周期，裝備Gro-Lux或白熾燈)中25°C溫育。嫩芽培育7_10天，當(dāng)子葉尚嫩、仍在伸展過程中、并且沒有可見的真實(shí)葉片形成時使用。用土壤桿菌菌株LBA4404接種10毫升含有合適抗生素的基本A培養(yǎng)基，28°C振蕩培養(yǎng)。將1毫升細(xì)煙草懸浮培養(yǎng)物(finetobaccosuspensionculture)置于含有用0.6%瓊脂糖固化的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基或添有0.5mg/L2，4-D和0.6%瓊脂糖的MS培養(yǎng)基的平板上。將細(xì)胞分散成一個均勻的層，平板不密封，堆放在25°C培養(yǎng)室中低光下，直到翌日。在營養(yǎng)板(feederplates)的上面放置一片Whatmanl號濾紙，小心排除所有氣泡，確保濾紙完全潤濕。轉(zhuǎn)化使用子葉進(jìn)行，因?yàn)橄屡咻S會產(chǎn)生大量四倍體。在培養(yǎng)皿中，切去子葉的尖端，然后再進(jìn)行另外的兩次橫切，從而產(chǎn)生兩個大約0.5cm長的外植體。將外植體轉(zhuǎn)移到有水的新培養(yǎng)皿中，以防止在進(jìn)一步的切割中產(chǎn)生任何損傷。收集若干外植體匯總后，將它們在滅菌濾紙上吸干，并將大約30-40塊置于一個營養(yǎng)板上，使背軸表面(abaxilsurface)在最上面(倒置)。將培養(yǎng)基非密封布置，并堆放在25°C培養(yǎng)室中低光下8小時。將土壤桿菌培養(yǎng)物離心下來，并重新懸浮在含有3%蔗糖的MS培養(yǎng)基中，使OD6tltl為0.4-0.5。將細(xì)菌懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿，并將來自一個營養(yǎng)板的外植體浸沒在該懸液中。然后取出它們，在滅菌濾紙上吸干，再將它們返回到原來的營養(yǎng)板上，同樣注意不要損傷組織。對置于細(xì)菌中的時間沒有特定的要求，只要時間足夠確保薄片被完全浸沒即可。將平板返回到與預(yù)處理階段所用的相同的條件下(25°C，低光強(qiáng))共培養(yǎng)40小時。將來自所述營養(yǎng)層的外植體(每個培養(yǎng)皿12個外植體)放置在含有500ug/ml沃格孟汀或羧芐青霉素和100ug/ml卡那霉素的番茄再生平板上，選擇T-DNA轉(zhuǎn)化標(biāo)記。將子葉右側(cè)朝上放置，從而使它們卷曲伸入培養(yǎng)基中，確保葉片的切割邊緣與培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物和抗生素良好接觸。使用瓊脂糖凝膠作為硬化劑(settingagent)，因?yàn)樗尚纬扇彳浀慕橘|(zhì)，能夠?qū)⒈∑p柔地推入其中。平板左側(cè)不密封，將它們返回到先前的培養(yǎng)條件(25°C，低光強(qiáng))。每2-3周將外植體轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。一旦再生材料相對于培養(yǎng)皿而言過大時，便將其放入更大的螺紋旋蓋玻璃瓶(screwcappedglassjar)內(nèi)。將芽從外植體切下，放入具有200ug/ml沃格孟汀和50ug/ml卡那霉素的生根培養(yǎng)基中。為了轉(zhuǎn)移到土壤中，通過在流水中輕柔地沖洗根盡可能多地除去培養(yǎng)基。小心地將植物轉(zhuǎn)移到含水的(hydrated)、經(jīng)高壓滅菌的苗缽(Jiffypot)(泥炭鍋)中，保持密封以便在生長室中維持高濕。逐漸降低濕度。一旦能夠看見根生長穿透苗缽，即將植物轉(zhuǎn)移到溫室。再生/升MS鹽Ix肌醇IOOmgNitsch氏維生素(Nitsch，svitamins)Iml1000X儲液蔗糖20g瓊脂膠(Agargel)4gpH6.0(KOH)高壓滅菌玉米素核苷(反式異構(gòu)體)2mg(過濾滅菌并在高壓滅菌后添加)Nitsch氏維生素終濃度mg/1IOOOx儲液(mg/100ml)硫胺0.550甘氨酸2.0200煙酸5.0500鹽酸吡哆醇0.550葉酸0.550生物素0.055在ΙΟΟΟχ下，不是所有維生素都會溶入溶液。4°C保存，使用前搖勻。生根/升MS培養(yǎng)基0.5X蔗糖5g固化劑2.25gpH6.0(KOH)培養(yǎng)基種子萌發(fā)/升MS培養(yǎng)基Ix葡萄糖IOg瓊脂糖6gpH5.8傾倒入Sigma“人造黃油”(‘margarine，)盆中基本培養(yǎng)基A/升KnHPO410.5gKH2PO44.5g(NH4)2SO4l.Og檸檬酸鈉.2H200.5g990ml高壓滅菌使用前添加；1.OmlIMMgSO4.H2OIOml20%葡萄糖平板用制備上述溶液500ml并高壓滅菌。15g細(xì)菌瓊脂溶于490mlH2O中單獨(dú)高壓滅菌添加MgSO4和葡萄糖并混合本氏煙轉(zhuǎn)化將本氏煙植株培育至10-20cm高，但開始開花之前為止。用合適的抗生素選擇方案啟動土壤桿菌培養(yǎng)，并在28°C振蕩生長24小時。第二天，將土壤桿菌離心沉淀下來，并重新懸浮在含有3%蔗糖的MS培養(yǎng)基中。收集幼嫩的本氏煙葉(最大直徑為IOcm)，并在含有數(shù)滴作為表面活性劑的吐溫20的新鮮次氯酸鈉中表面滅菌20分鐘。然后，將葉片在滅菌水中充分清洗，用鋒利手術(shù)刀切成l-2cm見方，浸沒在土壤桿菌懸浮液中。確保全部的葉子均被完全潤濕，然后迅速將它們吸干，并置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上3天。之后，將共培養(yǎng)后的葉塊轉(zhuǎn)移到含有合適抗生素的選擇培養(yǎng)基上，每個皿上大約10個外植體。每7-10天將外植體亞培養(yǎng)到新鮮的培養(yǎng)基上，歷時大約1-2個月，直到出現(xiàn)初芽。用鋒利手術(shù)刀將芽切下，并植入含有選擇抗生素的生根培養(yǎng)基內(nèi)。帶有合適的抗生素或除草劑抗性基因的轉(zhuǎn)基因植物通常會在2周內(nèi)開始生根，可以對它們逐漸停止(weanoutof)組織培養(yǎng)物供應(yīng)，代之以無菌泥炭塊(peatblock)，然后移植到溫室中。MS液體培養(yǎng)基IXMS培養(yǎng)基蔴糖pH5.7共培養(yǎng)培養(yǎng)基IXMS基礎(chǔ)鹽混合物IXGamborg'sB5維生素蔴糖0.59g/LMES1.Omg/LBAP0.lmg/1NAA0·6%瓊脂糖ρΗ5.7選擇培養(yǎng)基IXMS基礎(chǔ)鹽混合物IXGamborg'sB5維生素蔴糖0.59g/LMES1.Omg/LBAP0.lmg/1NAA0.4%瓊脂糖ρΗ5.7生根培養(yǎng)基1/2強(qiáng)度MS培養(yǎng)基0.5%蔗糖0.25%結(jié)冷膠(Gelrite)ρΗ5.8<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>互補(bǔ)分析(Rpi-okal)選擇能夠在卡那霉素上生長的總共37個馬鈴薯底西瑞栽培種植株作為推定的Rpi-okal轉(zhuǎn)化體。在轉(zhuǎn)移到溫室之后，切下葉片，用來進(jìn)行致病疫霉分離株90128和‘Superblight’的離體葉片測定，以確定該轉(zhuǎn)基因是否賦予晚疫病抗性。在37個轉(zhuǎn)化體中，31個被確認(rèn)為是抗性的，沒有顯示任何晚疫病感染跡象。一些植物在接種局部顯示超敏感應(yīng)答跡象。其余6個植株對兩種分離群都易感，與對照(未被轉(zhuǎn)化的底西瑞)相同。轉(zhuǎn)基因植物的表型與Rpi-okal0RF的PCR擴(kuò)增精確相關(guān)所有可以擴(kuò)增出Rpi-okal的植物均被確認(rèn)是抗性的。Rpi-okal轉(zhuǎn)基因還賦予針對多種致病疫霉分離株的抗性，詳見表6.1。所有的測試轉(zhuǎn)基因植物均對分離群EC1易感，表明Rpi-okal的特異性在轉(zhuǎn)基因植株中仍得以保持，并且該抗性表型不是由于轉(zhuǎn)基因?qū)Ψ烙返慕M成性活化而導(dǎo)致的。攜帶Rpi-okal的轉(zhuǎn)基因番茄Moneymaker栽培種植株也顯示對致病疫霉分離株90128有抗性。選擇了能夠在卡那霉素上生長的總共21個番茄Moneymaker栽培種植株作為推定Rpi-okal轉(zhuǎn)化體。在轉(zhuǎn)移到溫室之后，切下葉片用于致病疫霉分離株90128的離體葉片測定，以確定該轉(zhuǎn)基因是否賦予晚疫病抗性。在21個轉(zhuǎn)化體中，13個被確認(rèn)為是抗性的，沒有顯示任何晚疫病感染跡象。一些植株在接種局部顯示了超敏感應(yīng)答跡象。其余8個植株對分離群90128易感，與對照(未被轉(zhuǎn)化的Moneymaker)相同。轉(zhuǎn)基因植株的表型與Rpi-okal0RF的PCR擴(kuò)增大體相關(guān)，大多數(shù)能擴(kuò)增出Rpi-okal的植株被確認(rèn)是抗性的。然而，2個經(jīng)PCR確定含有Rpi-okal的植株仍然是易感的，表明轉(zhuǎn)基因被沉默了，或者插入到了受體番茄基因組的無轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域中。Rpi-okal轉(zhuǎn)基因還賦予針對多種致病疫霉的抗性，詳見表6.1。所有沒有擴(kuò)增出Rpi-okal的植株均對致病疫霉易感。Rpi-okal賦予的針對致病疫霉分離株的抗性譜將帶有Rpi-okal的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯底西瑞栽培種的離體葉片與多種致病疫霉分離株(表6.1)溫育，以確定Rpi-okal賦予抗性的分離株的范圍。11個被測試的分離株中，只有來自厄瓜多爾的EC1分離株能夠克服Rpi-okal，在溫育植物上致病。互補(bǔ)分析(Rpi-mcql.1和Rpi-mcql.2)用pSLJ21153(Rpi-mcql.1)和pSLJ21148(Rpi-mcql.2)轉(zhuǎn)化后，分別獲得了總共22和20個推定的馬鈴薯底西瑞栽培種轉(zhuǎn)基因系。在轉(zhuǎn)移到溫室后，用致病疫霉分離株90128、ECUHica和IPO-complex進(jìn)行離體葉片測定。對于構(gòu)建體pSLJ21153，有12個轉(zhuǎn)基因系顯示對分離株90128和EC1抗性，但對Hica和IPO-complex易感。對于構(gòu)建體PSLJ21148，有10個轉(zhuǎn)基因系顯示當(dāng)?shù)蜐舛?lxlO4個游動孢子ml—1)接種時對Hica有更高的抗性，但對90128、EC1和IPO-complex易感。存在于此構(gòu)建體中的Rpi-mcql.2也賦予針對分離株‘Superblight’和MP618(表6)的部分抗性。用粘粒D5(其含有同樣存在于PSLJ21153上的截短的抗性基因同源物)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯系則對所有測試致病疫霉分離株表現(xiàn)易感。將分別攜帶Rpi-mcql.1和Rpi-mcql.2的兩個構(gòu)建體(pSLJ21153和pSLJ21148)轉(zhuǎn)化進(jìn)番茄Moneymaker栽培種中。通過使用基因特異引物PCR鑒定了2個對Rpi-mcql.1呈陽性的系和11個對Rpi-mcql.2呈陽性的系。兩個攜帶Rpi-mcql.1的轉(zhuǎn)基因系賦予針對90128和EC1的抗性。攜帶Rpi-mcql.2或者攜帶同樣存在于具有Rpi-mcql.1的構(gòu)建體PSLJ21153上的截短R基因同源物(粘粒D5)的轉(zhuǎn)基因Moneymaker系對90128和EC1易感。Rpi-mcql.1和Rpi-mcql.2賦予的針對致病疫霉分離株的抗性譜對多種致病疫霉分離株進(jìn)行測試，以確定它們對Rpi-mcql.1和Rpi-mcql.2的毒力/無毒力(表6.1)。在測試的12個分離株中，Rpi-mcql.1賦予了針對6個分離株的抗性，Rpi-mcql.2賦予了針對3個分離株的部分抗性(表6.1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>實(shí)施例7避免對新基因產(chǎn)生抗性的方法和組合物野生群體中的抗性基因通常是高度多態(tài)性的(Jones2001，Dangl和JoneS2001，Bergelson等，2001)，這種異質(zhì)性可能對于它們的有效性是至關(guān)重要的，因?yàn)樗鼈儠艿筋l率依賴性的選擇(如果任何一個R基因占主導(dǎo)地位，針對能夠克服它的病原體種族的選擇加強(qiáng))。在農(nóng)業(yè)上，單作是常態(tài)，這方便了任何能夠在特定作物品種上生長和快速繁殖的病原體的流行。我們建議，如果能夠鑒定足夠的R基因，并且混合配置(cbployinmixtures)在原本具有均一的農(nóng)藝和消費(fèi)性狀的遺傳背景中，那么就可能在作物中實(shí)現(xiàn)持久的抗性(Pink和Pudd印hat1999,Jones2001)。為了使這一策略發(fā)揮作用，并應(yīng)對與以R基因?yàn)榛A(chǔ)的抗性的克服和進(jìn)化相關(guān)的問題，分離盡可能多的新Rpi基因是重要的。這可以根據(jù)本發(fā)明加以實(shí)現(xiàn)，通過從馬鈴薯野生親緣種分離多種Rpi基因，將這些基因分別引入到一個品種內(nèi)，混合(mix)并種植所得的品系。這個策略可以規(guī)避了這樣的問題，即就單一栽培的品種而言，對于任何能夠克服該品種內(nèi)特定Rpi基因的晚疫病類型，該品種將變得完全易感，結(jié)果使得該種類在寄生物群體中占主導(dǎo)地位。而如果混合使用3個Rpi基因，任何能夠克服這些Rpi基因之一的晚疫病類型僅能在田間33%的植物上生長。根據(jù)本發(fā)明的一個可選擇策略包括使用相同的品種，但是每年攜帶不同的Rpi基因。在此情形下，在某一年能成功克服的病原體種類，在下一年就會不能成功克服或者不能完全成功克服，從而降低損失。我們具體設(shè)想1.流行減慢如果對某一種R基因有毒力的致病疫霉菌株進(jìn)入作物，那么該菌株的擴(kuò)散被限制在攜帶該R基因的植物之內(nèi)，其它帶有不同R基因的植物仍然保持抗性，因此限制病原體的擴(kuò)散和整體損失。對于病原體而言，發(fā)展出針對多個R基因的毒力是更加困難的，因此將極大地降低對多于一種R基因有致病能力的菌株的發(fā)展。由于具有不同R基因的植物將被雜交，具有相同R基因的植物之間會出現(xiàn)空間隔離，這將限制該菌種在田間的擴(kuò)散。2.對多于一種Rpi基因的毒力與僅對一種基因的毒力相比導(dǎo)致適應(yīng)性降低植物R基因通過識別由植物病原體的特定菌株產(chǎn)生的分子而發(fā)揮作用。目前被接受的假說是，病原體通常需要某種效應(yīng)分子以克服宿主防御應(yīng)答，而該效應(yīng)分子通常被植物R基因所識別；病原體的毒力是通過喪失編碼該效應(yīng)分子的基因而獲得的。因此，為了對超過1種R基因產(chǎn)生毒力，病原體需要喪失多于1種效應(yīng)分子。當(dāng)在含有不同R基因補(bǔ)充的宿主上生長時，這樣病原體菌株與沒有喪失或者僅喪失一種效應(yīng)分子的菌株競爭時，其內(nèi)在適應(yīng)性降低。3.不相容的種類可觸發(fā)系統(tǒng)性獲得性抗性除了R基因介導(dǎo)的抗性應(yīng)答之外，植物具有產(chǎn)生非特異性防御應(yīng)答，稱作系統(tǒng)性獲得性抗性(SARsymtemicacquiredresistance)，的能力。在識別病原體之后，植物能夠啟動防御應(yīng)答，此類反應(yīng)對對多種病原體有效，不僅限于由R基因識別的病原體菌株。因此，導(dǎo)入的R基因?qū)μ囟ǖ牟≡w菌株的識別也可以有助于防御其它不一定被任何導(dǎo)入的R基因識別的菌株。4.對影響稀有Rpi基因的毒力的正選擇(selectionfor)微弱在群體內(nèi)分布稀少的Rpi基因，對病原體施加的克服該抗性的選擇壓力較小。這種策略可用于保護(hù)有價值的R基因，并可以通過用合理的方式配置R基因，使病原體群體不會暴露于大量具有這些R基因的作物。從而確保這些R基因的長壽性(longevity)，關(guān)于相應(yīng)致病等位基因在病原體群體中的頻率的知識可以幫助人們來進(jìn)行這樣的合理配置。參考文獻(xiàn)AllouisS,MooreG,BellecA,SharpR,FaivreRampantP,MortimerK,PateyronS,FooteTN,GriffithsS,CabocheM,ChalhoubB(2003)Constructionandcharacterisationofahexaploidwheat(TriticumaestivumL.)BAClibraryfromthereferencegermplasm'ChineseSpring'.CerealResCommun31:331-338ArumuganathanK,Ear1eED(1991)Nuc1earDNAcontentofsomeimportantplantspecies.PlantMolBiolRep9:208_218BallvoraA,ErcolanoMR,Wei3J,MeksemK,BormannCA,OberhagemannP,SalaminiF,GebhardtC(2002)TheR1geneforpotatoresistancetolateblight(Phytophthorainfestans)belongstotheleucinezipper/NBS/LRRclassofplantresistancegenes.PlantJ30:361_371Blackff,MastenbroekC,MillsWR,PetersonLC(1953)AproposalforaninternationalnomenclatureofracesofPhytophthorainfestansandofgenescontrol1ingimmunityinSolanumdemissumderivatives.Euphytica2173-240BouzidiMFFranchelJTaoQ,StormoKMrazA,NicolasPMouzeyarS(2006)AsunflowerBAClibrarysuitableforPCRscreeningandphysicalmappingoftargetedgenomicregions.TheorApplGenet113:81—89BradshawJE，BryanGJ，LeesAK，McLeanK，Solomon-BlackburnRM(2006)MappingtheR10andRllgenesforresistancetolateblight(Phytophthorainfestans)presentinthepotato(Solanumtuberosum)R-genedifferentialsofBlack.TheorApplGenet112:744-751ChalhoubB，BelcramH，CabocheM(2004)Efficientcloningofplantgenomesintobacterialartificialchromosome(BAC)librarieswithlargerandmoreuniforminsertsize.PlantBiotechnolJ2:181—188ChangY_L，TaoQ，ScheuringC，DingK，MeksemK，ZhangH_B(2001)AnintegratedmapofArabidopsisthalianaforfunctionalanalysisofitsgenomesequence.Genetics159:1231-1242ChenQ,SunS，YeQ,McCuineS，HuffE,ZhangHH(2004)ConstructionoftwoBAClibrariesfromthewildMexicandiploidpotatoSolanumpinnatisectum，andtheidentificationofclonesnearthelateblightandColoradopotatobeetleresistanceloci.TheorApplGenet108:1002—1009CostanzoS，SimkoI，ChristBJ，HaynesKG(2005)QTLanalysisoflateblightresistanceinadiploidpotatofamilyofSolanumphurejaxS.stenotomum.TheorApplGenet111:609_617DaneshD，PenuelaS，MudgeJ，DennyRL，NordstromH，MartinezJP，YoungND(1998)Abacterialartificialchromosomelibraryforsoybeanandidentificationofclonesnearamajorcystnematoderesistancegene.TheorApplGenet96196-202DeWit,P.J.G.M.(1997)Pathogenavirulenceandplantresistance:akeyroleforrecognition.TrendsInPlantScience.2，452-458.El-KharbotlyA，Leonards-SchippersC，HuigenDJ，JacobsenE，PereiraA，StiekemaWJ,SalaminiF，GebhardtC(1994)SegregationanalysisandRFLPmappingoftheR1andR3allelesconferringrace-specificresistancetoPhytophthorainfestansinprogenyofdihaploidpotatoparents.MolGenGenet242:749_754El-KharbotlyA，Palomino-SanchezC，SalaminiF，JacobsenE，GebhardtC(1996)R6andR7allelesofpotatoconferringrace-specificresistancetoPhytophthorainfestans(Mont.)deBaryidentifiedgeneticlociclusteringwiththeR3locusonchromosomeXI.TheorApplGenet92:880_884EshedY，ZamirD(1994)AgenomiclibraryofLycopersiconpennelliiinLycopersiconesculentum:atoolforfinemappingofgenes.Euphytica79:175—179EwingEE,SimkoI,SmartCD,BonierbaleMW,MizubutiESG,MayGD，F(xiàn)ryWE(2000)GeneticmappingfromfieldofqualitativeandquantitativeresistancetoPhytophthorainfestansinapopulationderivedfromSolanumtuberosumandSolanumberthaultii.MolBreeding6:25_36FengJiVickBA,LeeMK，ZhangHBiJanCC(2006)ConstructionofBACandBIBAClibrariesfromsunflowerandidentificationoflinkagegroup-specificclonesbyovergohybridization.TheorApplGenet113:23-32Flor,H.H.(1971)Currentstatusofthegene-for-geneconcept.AnnualReviewofPhytopathology78，275-298FrijtersACJ,ZhangZ,vanDammeMiWangGLiRonaldPCiMichelmoreRW(1997)ConstructionofabacterialartificialchromosomelibrarycontaininglargeEcoRIandHindIIIgenomicfragmentsoflettuce.TheorApplGenet94:390_399Gebhardt，C.andValkonen,J.P.(2001)Organizationofgenescontrollingdiseaseresistanceinthepotatogenome.AnnuRevPhytopathol39，79-102GeorgiLL,WangY，YvergniauxD，OrmsbeeT，InigOM，ReighardG，AbbottAG(2002)ConstructionofaBAC1ibraryanditsapplicationtotheidentificationofsimplesequencerepeatsinpeach[Prunuspersica(L.)Batsch].TheorApplGenet105:1151-1158GhislainM，TrognitzB，HerreraMaDelR,SolisJ，CasalloG，VasquezC，HurtadeO,CastilloRiPortalLiOrrilloM(2001)GeneticlociassociatedwithfieldresistancetolateblightinoffspringofSolanumphurejaandS.tubersosumgrownundershort-dayconditions.TheorApplGenet103:433_442Grube,R.C.，Radwanski，Ε.R.andJahn,Μ.(2000)ComparativegeneticsofdiseaseresistancewithinSolanaceae.Genetics155,873-887HelgesonJP,PohlmanJD,AustinS，HaberlachGT,WielgusSM,RonisD，ZambolimL，TooleyP，McGrathJM,JamesRV,StevensonWR(1998)SomatichybridsbetweenSolanumbulbocastanumandpotato:anewsourceofresistancetolateblight.TheorApplGenet96:738-742Hofmann，K.，Bucher，P.，F(xiàn)alquet,L.andBairoch，Α.(1999)ThePROSITEdatabase，itsstatusin1999.Nucl.AcidsRes.27，215—219.HuangS，VleeshouwersVGAA,WerijJS,HuttenRCB,vanEckHJ,VisserRGF,JacobsenE(2004)TheR3resistancetoPhytophthorainfestansinpotatoisconferredbytwocloselylinkedRgeneswithdistinctspecificities.MolPlantMicrobInteract17:428_435HuangS，vanderVossenEAG，KuangH,VleeshouwersVGAA,ZhangN,BormTJA,vanEckHJ，BakerB，JacobsenE，VisserRGF(2005)ComparativegenomicsenabledtheisolationoftheR3alateblightresistancegeneinpotato.PlantJ42:251-261Huang，S.(2005)Discoveryandcharacterizationofthemajorlateblightresistancecomplexinpotato:genomicstructure，functionaldiversity,andimplications.PhDthesis.JanskyS(2000)Breedingfordiseaseresistanceinpotato.PlantBreedingRevl969-155JiangJiGillBSiWangGLiRonaldPCiWardDC(1995)Metaphaseandinterphasefluorescenceinsituhybridizationmappingofthericegenomewithbacterialartificialchromosomes.ProcNatlAcadSciUSA924487-4491KamounS，vanWestP，VleeshouwersVGAA,deGrootKE，GoversF(1998)ResistanceofNicotianabenthamianatoPhytophthorainfestansismediatedbytherecognitionoftheelicitorproteinINFl.PlantCell10:1413-1425KleinPEiKleinRR，CartinhourSWiUlanchPEiDongJiObertJAiMorishigeDT,SchlueterSDiChildsKLiAleMiMulletJE(2000)Ahigh-throughputAFLP-basedmethodforconstructingintegratedgeneticandphysicalmapsprogresstowardasorghumgenomemap.GenomeRes10:789_807KuhlJC,HannemanJrRE,HaveyMJ(2001)CharacterizationandmappingofRpi1，alate-blightresistancelocusfromdiploid(IEBN)MexicanSolanumpinnatisectum.MolGenetGenomics265:977_985LanfermeijerFC,DijkhuisJ,SturreMJG，deHaanP，HilleJ(2003)CloningandcharacterizationofthedurabletomatomosaicvirusresistancegeneTm-22fromLycopersiconesculentum.PlantMolBiol52:1037-1049Lanfermeijer，F(xiàn).C.，Warmink,J.andHille，J.(2005)TheproductsofthebrokenTm-2andthedurableTm_2(2)resistancegenesfromtomatodifferinfouraminoacids.JExpBot56，2925-2933LeeH-R,EomE-M,LimY-PiBangJ-W,LeeD-H(2003)ConstructionofagarlieBAClibarayandchromosomalassignmentofBACclonesusingtheFISHtechnique.Genome46:514_520Leonards-SchippersC，GieffersW,SalaminiF，GebhardtC(1992)TheRlgeneconferringrace-specificresistancetoPhytophthorainfestansinpotatoislocatedonpotatochromosomeV.MolGenGenet233:278—283Linden，C.C.G.v.d.，Wouters,D.D.C.A.E.，Mihalka，V.V.，Kochieva，Ε.Ε.Z.，SmuIders,Μ.Μ.J.Μ.andVosman，B.B.(2004)EfficienttargetingofplantdiseaseresistancelociusingNBSprofiling.Theoreticalandappliedgeneticsl09，384-393.LiuYGandWhittierRF(1994)RapidpreparationofmegabaseplantDNAfromnucleiinagaroseplugsandmicrobeads.NucleicAcidsRes22:2168—2169LiX，vanEckHJ,RouppevanderVoortJNAM,HuigenDJ,StamP，JacobsenE(1998)AutotetraploidsandgeneticmappingusingcommonAFLPmarkerstheR2alleleconferringresistancetoPhytophthorainfestansmappedonpotatochromosome4.TheorApplGenet96:1121—1128MalcolmsonJF,BlackW(1966)NewRgenesinSolanumdemissumLindl.andtheircomplementaryracesofPhytophthorainfestans(Mont.)deBary.Euphytica15199-203MastenbroekC(1953)ExperimentsontheinheritanceofblightimmunityinpotatoesderivedfromSolanumdemissumLindl.Euphytica2:197—206McGrathJM,ShawRS,deIosReyesBG,WeilandJJ(2004)ConstructionofasugarbeetBAClibraryfromahybridwithdiversetraits.PlantMolBiolReporter22:23_28McHale，L.，Tan，X.，Koehl，P.andMichelmore，R.W.(2006)PlantNBS-LRRproteins:adaptableguards.GenomeBiol7，212MeksemK，ZobristK，RubenE，HytenD，QuanzhouT，ZhangH_B，LightfootD(2000)Twolarge-insertsoybeangenomic1ibrariesconstructedinabinaryvector-applicationsinchromosomewalkingandgenomewidephysicalmapping.TheorApplGenet101:747_755Michelmore,R.W.，Paran,I.andKesseli,R.V.(1991)Identificationofmarkerslinkedtodisease-resistancegenesbybulkedsegregantanalysis:arapidmethodtodetectmarkersinspecificgenomicregionsbyusingsegregatingpopulations.ProcNatlAcadSciUSA88,9828-9832.MilbourneD，MeyerRC,CollinsAJ,RamsayLD,GebhardtC，WaughR(1998)Isolation，characterisationandmappingofsimplesequencerepeatlociinpotato.MolecularandGeneralGenetics259:233—245NaessSK,BradeenJM,WielgusSM,HaberlachGT,McGrathJM,HelgesonJP(2000)ResistancetolateblightinSolanumbulbocastanumismappedtochromosome8.TheorApplGenet101:697_704NilmalgodaSD,CloutierS,WalichnowskiAZ(2003)Constructionandcharacterizationofabacterialartificialchromosome(BAC)libraryofhexaploidwheat(TriticumaestivumL.)andvalidationofgenomecoverageusinglocus-specificprimers.Genome46:870—878Osoegawa，K，WoonPY,ZhaoB，F(xiàn)rengenE，TatenoM，CataneseJJ,deJongPJ(1998)Animprovedapproachforconstructionofbacterialartificialchromosomelibraries.Genomics52:1—8OzdemirN，HornR，F(xiàn)riedtW(2004)ConstructionandcharacterizationofaBAClibraryforsunflower(HelianthusannuusL)·Euphytica138:177-183Pan,Q.,Liu,Y.-S.，Budai-Hadrian，0.，Sela，M.，Carme1-Goren，L，Zamir，D.andFluhr,R.(2001)ComparativeGeneticsofNucleotideBindingSite-LeucineRichRepeatResistanceGeneHomologuesintheGenomesofTwoDicotyledonsTomatoandArabidopsis.Genetics159，1867c-.ParkT_H，VleeshouwersVGAA,HuttenRCB,vanEckHJ,vanderVossenE，JacobsenE，VisserRGF(2005a)High-resolutionmappingandanalysisoftheresistancelocusRpi—abptagainstPhytophthorainfestansinpotato.MolBreeding16:33_43ParkT_H，GrosA，SikkemaA，VleeshouwersVGAA,MuskensM，AllefsS，JacobsenE，VisserRGF,vanderVossenEAG(2005b)ThelateblightresistancelocusRpi_blb3fromSolanumbulbocastanumbelongstoamajorlateblightRgeneclusteronchromosome4ofpotato.MolPlantMicrobInteract18:722—729ParkTH,VleeshouwersVG,HuigenDJ,vanderVossenEA,vanEckHJ,VisserRG(2005c)Characterizationandhigh-resolutionmappingofalateblightresistancelocussimilartoR2inpotato.TheorApplGenet111:591—597Rauscher,G.M.，Smart，C.D.，Simko,I.，Bonierbale，M.，Mayton,H.，Greenland，A.andFry,W.E.(2006)CharacterizationandmappingofRPi-ber，anovelpotatolateblightresistancegenefromSolanumberthaultii.Theoreticalandappliedgenetics112,674-687SandbrinkJM,ColonLT,WoltersPJCC,StiekemaWJ(2000)TworelatedgenotypesofSolanummicrodontumcarrydifferentsegregatingallelesforfieldresistancetoPhytophthorainfestans.MolecularBreeding6215~225SliwkaJ'jakuczumH，LebeckaR，MarczewskiW,GebhardtC,Zimnoch-GuzowskaE(2006)Thenovel,majorlocusRpi-phulforlateblightresistancemapstopotatochromosomeIXandisnotcorrelatedwithlongvegetationperiod.TheorApplGenet113685-695SmildeWD,BrignetiG，JaggerL,PerkinsS,JonesJD(2005)SolanummochiquensechromosomeIXcarriesanovellateblightresistancegeneRpi-mocl.TheorApplGenet110:252-258SongJ,BradeenJM,NaessSK,RaaschJA,WielgusSM,HaberlachGT,LiuJ,KuangH，Austin-PhillipsSiBuellCRiHelgesonJP,JiangJ(2003)GeneRBclonedfromSolanumbulbocastanumconfersbroadspectrumresistancetopotatolateblight.ProcNatlAcadSciUSA100:9128_9133TaoQ,WangA，ZhangHB(2002)Onelarge-insertplant-transformation-competentBIBAClibraryandthreeBAClibrariesofJaponicariceforgenomeresearchinriceandothergrasses.TheorApplGenetl051058-1066ThomasCM，VosP，ZabeauM，JonesDA,NorcottKA,ChadwickBP，JonesJD(1995)Identificationofamplifiedrestrictionfragmentpolymorphism(AFLP)markerstightlylinkedtothetomatoCf-9geneforresistancetoCladosporiumfulvum.PlantJ8:785—794vanderVossenE，SikkemaA，HekkertBL,GrosJ，StevensP，MuskensM，WoutersD，PereiraA，StiekemaW,AllefsS(2003)AnancientRgenefromthewildpotatospeciesSolanumbulbocastanumconfersbroad-spectrumresistancetoPhytophthorainfestansincultivatedpotatoandtomato.PlantJ36867~882vanderVossenEAG,GrosJ，SikkemaA，MuskensM，WoutersD，WoltersP，PereiraA，AllefsS(2005)TheRpi_blb2genefromSolanumbulbocastanumisanMi-Igenehomologconferringbroad-spectrumlateblightresistanceinpotato.PlantJ44208-222VilarinhosAD,PiffanelliP，LagodaP，ThibivilliersS，SabauX，CarreelF，HontAD(2003)Constructionandcharacterizationofabacterialartificialchromosomelibraryofbanana(MusaacuminateColla).TheorApplGenetl06:1102_1106VleeshouwersVGAA,vanDooijeweertW,KeizerLCP,SijpkesL，GoversF，ColonLT(1999)AlaboratoryassayforPhytophthorainfestansresistanceinvariousSolanumspeciesreflectsthefieldsituation.EuropeanJournalofPlantPathology105:241_250VosP，HogersR，BleekerM，ReijansM，VandeleeT，HornesM，F(xiàn)rijtersA,PotJiPelemanJiKuiperM,ZabeauM(1995)AFLP:AnewtechniqueforDNAfingerprinting.NucleicAcidsResearch234407-4414WangGLiHolstenTEiSongWYiWangHPiRonaldPC(1995)ConstructionofaricebacterialartificialchromosomelibraryandidentificationofcloneslinkedtotheXa-21diseaseresistancelocus.PlantJ7:525—533WastieRL(1991)Breedingforresistance.InIngramDS,WilliamPH(eds)AdvancesinplantpathologyVol.7.Academicpress，London，pp193—224WooS-S,JiangJ，GillBS,PatersonAH,WingRA(1994)ConstructionandcharaterizationofabacterialartificialchromosomelibraryofSorghumbicolor.NucleicAcidsRes22:4922-4931WuCC,NimmakayalaP，SantosFA,SpringmanR，ScheuringC，MeksemK，LightfootDA,ZhangH_B(2004)ConstructionandcharacterizationofasoybeanbacterialartificialchromosomelibraryanduseofmuItiplecomplementarylibrariesforgenomephysicalmapping.TheorApplGenetl09:1041_1050YiikselB，PatersonAH(2005)ConstructionandcharacterizationofapeanutHindIIIBAClibrary.TheorApplGenet111:630-639權(quán)利要求一種分離的Rpi抗性基因，其具有與本文中表示為SEQ.ID.1a、1b、2a、2b或3的核酸序列至少約85％同源的序列。2.如權(quán)利要求1所述的分離的Rpi抗性基因，其具有與本文中表示為SEQ.ID.Ia的核酸序列至少約90%同源的序列。3.如權(quán)利要求2所述的分離的Rpi抗性基因，其包含本文中表示為SEQ.ID.IaUb或3的核酸序列。4.如權(quán)利要求3所述的分離Rpi抗性基因，其包含本文中表示為SEQ.ID.Ic的核酸序列。5.如權(quán)利要求1所述的分離的Rpi抗性基因，其具有與本文中表示為SEQ.ID.2a的核酸序列至少約86%同源、并且任選地可以從S.mochiquense獲得的序列。6.如權(quán)利要求5所述的分離的Rpi抗性基因，其包含本文中表示為SEQ.ID.2a或2b的核酸序列。7.如權(quán)利要求6所述的分離的Rpi抗性基因，其包含本文中表示為SEQ.ID.2c或2d的核酸序列。8.一種分離的蛋白，其具有與本文中表示為SEQ.ID.4a、4b、5a、5c或6的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列，并且能夠介導(dǎo)針對致病疫霉(P.infestans)的應(yīng)答。9.如權(quán)利要求8所述的分離的蛋白，其具有與本文中表示為SEQ.ID.4a的氨基酸序列至少大約90%同源的序列。10.如權(quán)利要求9所述的分離的蛋白，其具有包含本文中表示為SEQ.ID.4a、4b或6的氨基酸序列的序列。11.如權(quán)利要求8所述的分離的蛋白，其具有與本文中表示為SEQ.ID.5a的氨基酸序列至少大約80%同源，并且任選地可以從S.mochiquense獲得的序列。12.如權(quán)利要求11所述的分離的蛋白，其具有本文中表示為SEQ.ID.5a或5b的氨基酸序列的序列。13.一種分離的基因，其編碼如權(quán)利要求8-12任一項(xiàng)所述的蛋白。14.一種植物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)或權(quán)利要求13的基因，所述基因已被導(dǎo)入所述植物中。15.根據(jù)權(quán)利要求14的植物，其是馬鈴薯。16.根據(jù)權(quán)利要求15的植物的后代。17.—種產(chǎn)生晚疫病抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括向所述植物的細(xì)胞或所述植物的部分導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)或權(quán)利要求13的基因，和從所述細(xì)胞或從所述植物的所述部分產(chǎn)生完整的植物。18.—種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)或權(quán)利要求13的基因以及合適的調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列與所述基因可操作連接以便在置于合適的體外或體內(nèi)系統(tǒng)時可實(shí)現(xiàn)其表達(dá)。19.一種用于在馬鈴薯中提供持續(xù)的疾病抗性的方法，其包括從馬鈴薯的野生親緣種分離多個Rpi基因，將所述基因分別導(dǎo)入到馬鈴薯商業(yè)品系或品種中，混合如此產(chǎn)生的品系并種植所得的品系混合物。20.一種用于在馬鈴薯中提供持續(xù)的疾病抗性的方法，包括從馬鈴薯的野生親緣種分離多個Rpi基因，將所述基因分別導(dǎo)入到馬鈴薯商業(yè)品系或品種中，并每年種植攜帶不同Rpi基因的品種。21.如權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的方法，其中Rpi基因如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)或權(quán)利要求13限定。全文摘要本發(fā)明提供了新基因序列，組合物和方法，用于提高作物，特別是但不僅限于馬鈴薯，對由卵菌病原體致病疫霉(Phytophthorainfestans)導(dǎo)致的晚疫病的抗病性。文檔編號C12N15/82GK101802205SQ200880108132公開日2010年8月11日申請日期2008年7月18日優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日發(fā)明者喬納森·瓊斯,儲昭輝,埃德溫·A·G·范德沃森,樸泰皓,理查德·G·F·維瑟,西蒙·J·福斯特,馬蒂厄·A·佩爾申請人:瓦赫寧根大學(xué);植物生物科學(xué)有限公司