一種vegf-c真核表達(dá)載體的構(gòu)建和體外表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種VEGF-C真核表達(dá)載體的構(gòu)建和體外表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法。在首先進(jìn)行的MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)與總RNA提取中，于DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF細(xì)胞,胰酶消化傳代。收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞,總量為5～6×106；按Trizol試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA；其中Trizol試劑盒,為cDNA第一鏈合成試劑。本發(fā)明的有益效果是，基因測(cè)序能夠證實(shí)RT-PCR產(chǎn)物包含VEGF-CcDNA全長(zhǎng)。重組pcDNA3.1(-)中含有VEGF-CcDNA全長(zhǎng)序列,Western-blotting檢測(cè)到細(xì)胞培養(yǎng)上清中以及細(xì)胞內(nèi)有VEGF-C蛋白存在。結(jié)論:成功構(gòu)建了人類VEGF-C真核表達(dá)載體并檢測(cè)到載體在真核細(xì)胞中的表達(dá)。
【專利說(shuō)明】—種VEGF -C真核表達(dá)載體的構(gòu)建和體外表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生化的實(shí)驗(yàn)方法，具體來(lái)說(shuō)，一種VEGF -C真核表達(dá)載體的構(gòu)建和體外表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGF -C)屬VEGF/PDGF家族成員，其受體為VEGFR -2，VEGFR -3。VEGF通過(guò)VEGFR -2調(diào)節(jié)血管和淋巴管的增生，而VEGFR-3表達(dá)則局限于淋巴管內(nèi)皮，VEGF -C為VEGFR-2的結(jié)合，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的所需濃度遠(yuǎn)高于VEGFR -C，因此，VEGFR -3是淋巴管增生特異性調(diào)節(jié)因子，用VEGF -C轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，VEGF-C的高表達(dá)可以選擇性地引起淋巴管增生[2]，經(jīng)研究，VEGF -C表達(dá)與腫瘤淋巴管增生和
轉(zhuǎn)移的關(guān)系是VEGF -C高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移，其機(jī)理是VEGF -C促進(jìn)了腫瘤周圍及間質(zhì)的淋巴管生長(zhǎng)以及腫瘤組織中淋巴管增生。為進(jìn)一步研究VEGF -C在淋巴管增生中的作用及其機(jī)制，我們構(gòu)建了攜帶人VEGF -C cDNA的基因片段的真核表達(dá)載體，研究了它在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，為探討VEGF -C與淋巴管增生的關(guān)系，VEGF -C基因用于治療淋巴水腫和某些癌腫的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為克服上述技術(shù)問(wèn)題，我們提出了以下技術(shù)方案:
一種VEGF -C真核表達(dá)載體的構(gòu)建和體外表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法，在首先進(jìn)行的MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)與總RNA提取中，于DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF細(xì)胞，胰酶消化傳代。
[0004]本發(fā)明中，收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MCF -7細(xì)胞，總量為5~6 X 106。
[0005]本發(fā)明中，按Trizol試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA。
[0006]本發(fā)明中,其中Trizol試劑盒，為cDNA第一鏈合成試劑。
[0007]本發(fā)明的有益效果是，基因測(cè)序能夠證實(shí)RT -PCR產(chǎn)物包含VEGF -C cDNA全長(zhǎng)。重組pcDNA3.1(-)中含有VEGF -C cDNA全長(zhǎng)序列，Western -blotting檢測(cè)到細(xì)胞培養(yǎng)上清中以及細(xì)胞內(nèi)有VEGF -C蛋白存在。結(jié)論:成功構(gòu)建了人類VEGF -C真核表達(dá)載體并檢測(cè)到載體在真核細(xì)胞中的表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0008]在首先進(jìn)行的MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)與總RNA提取中，于DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF細(xì)胞，胰酶消化傳代。收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MCF -7細(xì)胞，總量為5~6 X 106;按Trizol試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA;其中Trizol試劑盒，為cDNA第一鏈合成試劑。
[0009]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng) 涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種VEGF -C真核表達(dá)載體的構(gòu)建和體外表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，在首先進(jìn)行的MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)與總RNA提取中，于DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF細(xì)胞，胰酶消化傳代。
2.如權(quán)利要求1所述的一種VEGF-C真核表達(dá)載體的構(gòu)建和體外表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MCF -7細(xì)胞，總量為5~6 X 106。
3.如權(quán)利要求1所述的一種VEGF-C真核表達(dá)載體的構(gòu)建和體外表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，按Trizol試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA。
4.如權(quán)利要求1所述的一種VEGF-C真核表達(dá)載體的構(gòu)建和體外表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，其中Trizol試劑 盒，為cDNA第一鏈合成試劑。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103602685SQ201310519284
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】王景文 申請(qǐng)人:王景文